Name: Einfache und schnelle Methode, um qualitativ hochwertige Tumor DNA von klinischen pathologischen Proben mit Touch Impressum Zytologie zu erhalten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Gewinnung hochwertiger Tumor-DNA aus klinischen Proben mittels Touch-Imprint-Zytologie. Diese Technik ermöglicht eine effiziente Anreicherung von Tumorzellen für die Next-Generation-Sequenzierung.

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Wir danken allen medizinischen und Dienstpersonal des Krankenhauses und die Patienten für die Zustimmung zur Teilnahme. Wir bedanken uns bei Gabrielle White Wolf, PhD, Edanz-Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für einen Entwurf des Berichts bearbeiten. Diese Studie wurde unterstützt durch eine Beihilfe für Genome Research Project aus der Präfektur Yamanashi (YH und M.O.) und einen Zuschuss von der YASUDA Medical Foundation (YH).

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<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+two+amplicon-based+sequencing+panels+of+different+scales+in+the+detection+of+somatic+mutations+associated+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer.</a> BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+HER2+V777L+mutation+mediates+resistance+to+trastuzumab+in+a+breast+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient.</a> Med Oncol. 34 (1), 3(2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+BRCA1+and+BRCA2+germline+mutations+in+Japanese+population+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigene+panel+analysis+identified+germline+mutations+of+DNA+repair+genes+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).</li>
<li>Lièvre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+status+is+predictive+of+response+to+cetuximab+therapy+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).</li>
<li>Mok, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+or+Platinum-Pemetrexed+in+EGFR+T790M-Positive+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+rep%22%5BJournal%5D)">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci rep. 13 (3), 3493(2013).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie haben wir eine alternative Methode für den Erhalt der Tumor DNA aus klinischen pathologischen Proben mit TIC vorgestellt. TIC-Zubereitung ist sehr einfach und benötigt weniger Zeit im Vergleich zu FFPE Methoden, ohne die Forderung nach speziellen Instrumenten10. Alle Verfahren von der TIC-Vorbereitung zur DNA-Extraktion können innerhalb von zwei Tagen (Abbildung 1) abgeschlossen werden. Diese Methode verkürzt somit die Turnaround-Zeit für die Durchfüh...

Nächste Generation Sequencing Technologie hat Forscher erhebliche Fortschritte bei der Analyse von Genominformationen in genetischen Variationen, Mendelian Krankheit, erbliche Veranlagung und Krebs 1,2,3 bereitgestellt . Die Cancer Genome Atlas (TCGA) und internationalen Krebs Genom Konsortium (ICGC) haben die Identifizierung der genetischen Veränderungen, die in verschiedenen Arten von gemeinsamen Krebserkrankungen4verfolgt. Hunderte von wesentlicher Treiber Krebsgene erfolgreich identifiziert worden, und einige dieser Moleküle sind für Droge-Entwicklung1,5,6angestrebt.
In der klinischen Einstellung sind FFPE-Proben für die pathologische Diagnose und molekulare Tests für verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs gebräuchlich. Jedoch bei der Fixierung mit Formalin, tritt Vernetzung der DNA-Protein oder DNA-DNA und DNA-Fragmentierung wird induziert. Somit eignen sich FFPE DNA-Proben nicht immer zur genetischen Analyse wegen der geringen Qualität und Quantität der DNA-7,8,9. Darüber hinaus dauert es mehrere Tage FFPE-Proben vorbereiten und technisches Geschick ist notwendig, um die Abschnitte genau vorbereitet. Daher ist es wünschenswert, eine einfache und schnelle Methode zur Gewinnung qualitativ hochwertige intakte DNA zu entwickeln.
Zytologie ist eine alternative Methode für die pathologische Diagnose. Zytologische Probenvorbereitung ist eine einfachere, weniger teuer und schneller Ansatz im Vergleich zu FFPE Vorbereitung10. Die TIC-Technik wurde auf Sentinel-Lymphknoten und marginale Gewebe von Patientinnen mit Brustkrebs für intraoperative Schnelldiagnose für einige Jahre11,12durchgeführt. Allerdings gibt es einige Berichte, die untersucht, ob qualitativ hochwertige genomischer DNA aus TIC Proben extrahiert werden kann und für spätere genetische Analyse verwendet. Zytologische Präparate sind häufig mit Papanicolaou (Pap) oder Giemsa Färbung gefärbt, und wir haben bereits berichtet, dass die Menge und Qualität der von TIC Proben (vor allem Giemsa gefärbten Proben) extrahierte DNA Proben aus FFPE überlegen sind Gewebe-13. Verglichen mit PAP-Färbung, hat Giemsa Färbung einen Vorteil in weniger befleckenden Verfahren erfordern. Pap-Färbung, nach die Proben wurden behoben, und gebeizt, müssen sie montiert werden mit Montage Medium (z. B.Malinol) Probe Inhalt, z. B. Tumorzellen normalen Zellen und entzündlichen Zellen unter dem Mikroskop zu unterscheiden. Wenn die Pap-Probe ohne Montage Schritt bereit ist, ist es fast unmöglich, die Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten, weil die Probe getrocknet ist. Zum Vergleich: Giemsa Färbung im getrockneten Zustand beobachtet werden, daher die Montage-Schritt ist nicht erforderlich für schnelle zelluläre Bewertung. Für Mikrodissektion ist die Giemsa Färbung besser geeignet, da trockene Proben erforderlich.
In diesem Bericht wir stellen eine einfache und schnelle Methode für die Zubereitung von TIC Exemplare mit Giemsa Färbung und zeigen, dass TIC eine bessere Quelle für DNA verglichen mit FFPE-Proben.

<table><tbody><tr><td>FINE FROST weiß20 Mikro-Objektträgerglas</td><td>Matsunami Glass ind, Ltd</td><td>SFF-011</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membran Glas-Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick A Lösung</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20571</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick B Lösung</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20581</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald Lösung</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15053</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa-Lösung</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15002</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE-Gewebekit</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNase P Nachweisreagenzien-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316831</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay aus FFPE DNA QC Assay v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324034</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Schnelle optische 96-Well-Reaktionsplatte&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optische Klebefolie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroMixer E36</td><td>TITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VIIA7-03</td><td></td></tr><tr><td>Himac CF16RXII</td><td>Hitachi-koki</td><td>CF16RII</td><td></td></tr><tr><td>Ionenbibliothek TaqMan Quantifizierungskit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 4468802</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 4475346</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4480442</td><td></td></tr><tr><td>Ion Xpress Barcode-Adapter 1-16 Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 4471250</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Hi-Q View Sequenzierungskit (200 Basis)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30044</td><td></td></tr><tr><td>Ion Chef System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484177</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well-Thermocycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Veriti200</td><td></td></tr><tr><td>Ion 318 Chip Kit v2 BC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4488150</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PGM11-001</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Wash 2 Flaschen Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25591</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&Handel; AMPure&Handel; XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Magnetstativ mit 16 Positionen</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 4457858</td><td></td></tr><tr><td>Antihaftbeschichtete, RNasefreie Mikrofuge-Röhrchen, 1,5 mL (Röhrchen mit geringer Bindung)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optische 96-Well-Reaktionsplatten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Durchsichtige Klebefolie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td> Agencourt&trade<td></td></tr><tr><td>; AMPure&Handel; XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08948-25</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (10M)</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>DTU-Neo</td><td>TAITEC</td><td>0063286-000</td><td></td></tr><tr><td>E-36</td><td>TAITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ci-L</td><td>Nikon</td><td>704354</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014393</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014384</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Petit-Change:</td><td>WAKEN</td><td>MODEL8864</td><td>Mini-Zentrifuge</td></tr><tr><td>Petit-Inkubator</td><td>WAKEN</td><td>WKN-2290</td><td>Luft-Inkubator</td></tr><tr><td>SensiCare Puderfreie Nitril-Untersuchungshandschuhe</td><td>MEDLINE</td><td>SEM486802</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gaze</td><td>Osaki</td><td>11138</td><td></td></tr><tr><td>Kühlschrank MediCool</td><td>SANYO</td><td>MPR-312DCN-PJ</td><td></td></tr> FEATHER <tr><td>TRIMMING BLAD</td><td>FEATHER</td><td>Nr.130</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER TRIMMING BLAD</td><td>FEATHER</td><td>No.260</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER S</td><td>FEATHER</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3</td><td>IKA</td><td>41-0458</td><td>Vortex Mixer</td></tr><tr><td>Pincette</td><td>NATSUME</td><td>A-5</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikroröhrchen</td><td>BIOBIK</td><td>RC-0150</td><td></td></tr></tbody></table>

einfache und schnelle methode, um qualitativ hochwertige tumor dna von klinischen pathologischen proben mit touch impressum zytologie zu erhalten

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Es ist entscheidend für die Mutationszucht Status bei Krebs vor Verwaltung und Behandlung der spezifische molekulare zielgerichtete Medikamente für Krebspatienten zu bestimmen. In der klinischen Einstellung sind Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe für Gentests verbreitet. Proteinkinase DNA ist jedoch in der Regel beschädigt und bei der Fixierung mit Formalin fragmentiert. Proteinkinase DNA ist daher manchmal nicht ausreichend für die genetische Untersuchung wegen geringer Qualität und Quantität der DNA. Hier präsentieren wir eine Methode der Touch Impressum Zytologie (TIC), genomischen DNA von Krebszellen zu erhalten, die unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. Zelle Morphologie und Krebs-Zell-Zahlen können mit TIC Proben ausgewertet werden. Darüber hinaus kann die Extraktion von genomischer DNA aus TIC Proben innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden. Den Gesamtbetrag und die Qualität der TIC DNA erhalten mit dieser Methode war höher als die der Proteinkinase DNA. Diese schnelle und einfache Methode erlaubt Forschern, qualitativ hochwertige DNA für genetische Untersuchungen (z.B., nächste Generation Sequenzierung Analyse, digitale PCR und quantitative Real-Time PCR) zu erhalten und um die Bearbeitungszeit für die Berichterstattung über Ergebnisse zu verkürzen.

Abbildung 1 zeigt den gesamten Prozess von der Vorbereitung TIC Proben zur DNA-Extraktion. Insbesondere übernimmt die Prozedur nur zwei Tage genomischen DNA von TIC Proben zu erhalten. Wir bewerten alle Effekte der Tumor Lagerung vor der Verarbeitung der Folie. Wir fanden, dass Tumorzellen auf dem Objektträger befestigt wurden, wenn Gewebeproben sofort auf die Folie berührt wurden und Geweben in Kochsalzlösung befeuchtet steril-Gaze für 1 h (<strong class="xf...

Erhalten qualitativ hochwertige genomischen DNA von Tumorgewebe ist ein wichtiger erster Schritt für die Analyse von genetischer Veränderungen, die Sequenzierung der nächsten Generation. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode, um Tumorzellen zu bereichern und intakte DNA von Touch Impressum Zytologische Proben erhalten.

Einfache und schnelle Methode, um qualitativ hochwertige Tumor DNA von klinischen pathologischen Proben mit Touch Impressum Zytologie zu erhalten

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, qualitativ hochwertige Tumor-DNA aus klinischen Proben zu gewinnen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Grundlagen- und klinischen Wissenschaft zu beantworten, wie z. B. Krebsforschung, Diagnose und Behandlungsentscheidungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Tumor-DNA einfacher und schneller als mit früheren Methoden gewinnen können.Um das Protokoll zu starten, berühren Sie die Tumoroberfläche eines zuvor präparierten und resezierten Gewebes mehrmals mit behandschuhten Händen auf einem normalen Objektträger. Vergewissern Sie sich visuell, dass der berührte Bereich mehr als 80 % des Objektträgers bedeckt. Drücken Sie den normalen Glasobjektträger leicht gegen einen Objektträger aus Polyethylen-Naphthalat oder PEN und reiben Sie ihn zwei- bis dreimal vorsichtig mit behandschuhten Händen.Bestätigen Sie visuell, dass die Zellen vom normalen Glasobjektträger auf den PEN-Membranobjektträger übertragen wurden. Trocknen Sie sowohl das Glas als auch die PEN-Membran fünf Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Nach dem Trocknen färben Sie den normalen Objektträger für die direkte zytologische Untersuchung.Tauchen Sie die Objektträger fünf Sekunden lang in Fixierlösung und färben Sie sie dann 15 Sekunden lang mit Giemsa Färbelösung. Beurteilen und screenen Sie den Tumorinhalt und die Zellularität auf dem normalen Objektträger vollständig mit einem Mikroskop, um eine schnelle Beurteilung zu ermöglichen. Bewerten Sie Tumorzellen anhand mehrerer Kriterien.Wenn die Probe durch eine schnelle mikroskopische Beurteilung aus dem vorherigen Abschnitt eine Tumorzellularität von über 60 % aufweist, schneiden Sie den tumorberührten Film der PEN-Membranobjektträger für die DNA-Extraktion mit einem Messer und behandschuhten Händen ab. Übertragen Sie die geschnittene Folie mit einem Stiftsatz und behandschuhten Händen auf ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie das filmhaltige Mikrozentrifugenröhrchen bis zur DNA-Extraktion bei vier Grad Celsius.Öffnen Sie die Software, planen Sie die Ausführungsbedingung und legen Sie den Ausführungsparameter in der Software fest. Klicken Sie auf die Registerkarte Plan, wählen Sie Vorlage und dann die entsprechende Ausführungsmethode aus. Wählen Sie die Anwendung und den Techniktyp aus und klicken Sie auf Weiter.Wählen Sie das Gerät, das Probenvorbereitungskit, den Typ des Bibliothekskits, das Vorlagenkit, das Sequenzierungskit, den Basiskalibrierungsmodus, den Chiptyp, die Kontrollsequenz und das Barcode-Set aus und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie Plugins aus und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie Projekt aus und klicken Sie auf Weiter.Wählen Sie dann die Standardreferenz- und BED-Dateien der Zielregion aus. Geben Sie den Namen des Beispiels ein, wählen Sie den Barcode aus und klicken Sie auf Planausführung. Führen Sie anschließend die Vorlagenvorbereitung und das Laden der Chips in einem automatisierten Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.Tauen Sie die Reagenzkartusche vor der Verwendung 45 Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Die unverdünnte Bibliothek wird mit nukleasefreiem Wasser entsprechend der in Schritt 6.8 berechneten Bibliothekskonzentration verdünnt und es werden 20 picomolare Bibliotheken hergestellt. Bereiten Sie eine gepoolte Bibliothek für die Sequenzierung vor und speichern Sie sie auf Eis.Geben Sie 25 Mikroliter der gepoolten Bibliothek mit einer 100-Mikroliter-Pipette auf den Boden des Probenröhrchens. Schalten Sie das Gerät ein und öffnen Sie die Abdeckung des automatischen Instruments. Platzieren Sie den Sequenzierungschip, den Chipadapter, die Anreicherungskassette, die Spitzenpatrone, die PCR-Platte, die PCR-Rahmendichtung, das Rückgewinnungsröhrchen, die Lösungspatrone und die Reagenzkartusche an der entsprechenden Position des automatisierten Instruments.Berühren Sie Einrichten, Ausführen und Schritt für Schritt auf dem Bildschirm. Schließen Sie die Abdeckung und berühren Sie auf dem Bildschirm Start Check (Prüfung starten). Nachdem Sie das Deck gescannt haben, berühren Sie Weiter.Überprüfen Sie den Anzeigeinhalt, den Kit-Typ, die Chip-ID, die Proben-ID, den Chip-Typ und die Pläne. Stellen Sie die Uhrzeit ein und berühren Sie OK. Nachdem Sie den Chip geladen haben, berühren Sie Weiter und öffnen Sie die Abdeckung. Entladen Sie den Sequenzierungschip mit behandschuhten Händen vom Chip-Adapter.Legen Sie den Chip in den Chipbehälter, umwickeln Sie ihn mit Parafilm und lagern Sie den Chip bei vier Grad Celsius bis zur Sequenzierungsreaktion. Entfernen Sie dann die Anreicherungskartusche, die PCR-Platte, die PCR-Rahmendichtung, das Rückgewinnungsröhrchen, die Lösungskartusche und die Reagenzkartusche mit behandschuhten Händen aus der entsprechenden Position des automatisierten Instruments. Übertragen Sie eine leere Spitzenpatrone mit behandschuhten Händen in die Position der Abfallspitze des automatisierten Geräts.Tippen Sie auf Weiter und schließen Sie die Abdeckung. Berühren Sie dann Start und reinigen Sie das automatisierte Instrument vier Minuten lang mit ultravioletten Strahlen. Lösen Sie eine Natriumchlorittablette in 1.000 Millilitern Reinstwasser auf und filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,22-Mikron-Filter.Sobald sich das Sequenzierinstrument aufgewärmt hat, berühren Sie "Sauber" und dann auf dem Bildschirm des Sequenzierinstruments. Reinigen Sie das Sequenzierinstrument mit 250 Millilitern filtersterilisierter Natriumchloritlösung und dann mit 250 Millilitern Reinstwasser. Tippen Sie dann auf Initialisieren und wählen Sie das entsprechende Sequenzierungskit auf dem Bildschirm aus.Installieren Sie einen grauen Shipper mit behandschuhten Händen. Initialisieren Sie das Sequenziergerät mit der Waschlösung, der pH-Anpassungslösung und der pH-Standardlösung. Geben Sie als Nächstes 20 Mikroliter DATP-, DGTP-, DCTP- und DTTP-Nukleotide in 50-Milliliter-Röhrchen mit einer 100-Mikroliter-Pipette hinzu.Installieren Sie einen grauen Shipper an der entsprechenden Stelle mit behandschuhten Händen. Laden Sie das 50-Milliliter-Röhrchen und schrauben Sie es auf das Sequenzierinstrument. Wählen Sie auf dem Bildschirm Weiter aus, um den Initialisierungsschritt zu starten.Nachdem Sie den Initialisierungsschritt abgeschlossen haben, berühren Sie auf dem Bildschirm Ausführen und wählen Sie das entsprechende Instrument zur Bibliotheksvorbereitung aus. Scannen Sie den zweidimensionalen Barcode des Chips. Setzen Sie den Sequenzierchip in der entsprechenden Position ein.Schließen Sie die Chipklemme und die Instrumentenklappe und berühren Sie die Chipprüfung, dann und OK auf dem Bildschirm, um den Sequenzlauf zu starten. Übertragen Sie nach der Sequenzierungsreaktion die Daten und führen Sie die Datenanalyse-Pipeline auf dem Sequenzierungsserver durch. Die absoluten DNA-Mengen und der RQ-Wert, ein Indikator für den Abbaugrad der genomischen DNA, zeigen, dass mit den TIC-Proben im Vergleich zu den FFPE-Proben eine höhere DNA-Ausbeute erzielt wird.Darüber hinaus waren die RQ-Werte aus der TIC-DNA im Vergleich zu denen der FFPE-DNA über verschiedene Tumorarten hinweg signifikant höher. APC Q1367* wurde sowohl in FFPE- als auch in TIC-DNA identifiziert, die an Stelle eins extrahiert wurde, und APC S1356*KRAS G12D und TP53 M237i wurden sowohl in FFPE- als auch in TIC-DNA nachgewiesen, die an den Stellen zwei, drei und vier extrahiert wurden, was darauf hindeutet, dass die identischen somatischen Mutationen in gepaarten FFPE- und TIC-DNA-Proben identifiziert wurden, die von derselben Tumorstelle hergestellt wurden. Bemerkenswert ist, dass die gleichen somatischen Mutationen zwischen primärem kolorektalem Karzinom und zwei metastasierten Leberkrebsproben nachgewiesen wurden, was darauf hindeutet, dass der Tumor von der zweiten Stelle in die Leber metastasiert.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der molekularen und medizinischen Forschung, um genetische Krebserkrankungen zu identifizieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Zirkulierender Tumorzellen aus dem Blut von Krebspatienten ohne zugleich Zellschäden isoliert. Isolierung von Tumorzellen wird unter Verwendung eines bimolekularen Oberfläche von E-Selektin neben Antikörpern gegen epitheliale Marker. Ein Nanoröhrchen-Beschichtung fördert gezielt Krebs Zelladhäsion was zu hohen Reinheiten Gefangennahme.

Schnelle Isolierung von lebensfähigen zirkulierende Tumorzellen von Patientenblutproben

Dieses Protokoll beschreibt den qPCR-Nachweis von Cytomegalievirus in formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Biopsiegewebe, der schnell, sensitiv, spezifisch und nützlich für die Interpretation von mehrdeutigen Hämatoxylin- und Eosin- oder immunhistochemischen Färbemustern ist.

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle nicht-enzymatische Dissoziation von frischen menschlichen Gewebefragmenten zur qualitativen und quantitativen Beurteilung von CD45+ Zellen (Lymphozyten/Leukozyten), die in verschiedenen normalen und bösartigen menschlichen Geweben vorhanden sind. Zusätzlich kann der aus dem primären Gewebehomogenat gewonnene Überstand gesammelt und für weitere Analysen oder Experimente gelagert werden.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

Hier beschreiben wir eine optimierte und effiziente Entfernung Strategie für die Sammlung von in der heutigen Bio-Partikel 'berühren DNA' Proben, zusammen mit einer verbesserten Amplifikationsprotokoll mit einem einstufigen 5 ul Mikrovolumen Lyse / STR Verstärkung, um die Erholung der erlauben Short Tandem Repeat (STR) Profile der Bio-Korn Spender (n).

Erweiterte Genetische Analyse der Einzelmenschen Biopartikeln von Simplified Mikromanipulation von Forensic &#39;Touch DNA&#39; Evidence Recovered

Dieses Manuskript beschreibt klinische Protokolle für zwei Next-Generation-Sequencing-Panels. Ein Panel befasst sich mit hämatologischen Malignomen, während das andere Panel auf Gene abzielt, die in soliden Tumoren häufig mutiert sind. Die molekulare Klassifikation von Treibermutationen bei humanen Malignomen bietet wertvolle prognostische und prädiktive Informationen.

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

Kutane Tumoren werden oft nach Mohs mikrographischen Chirurgie verworfen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das es dem klinischen Hilfspersonal ermöglicht, kutane Tumor- ( zB Plattenepithelkarzinom-, Basalzellkarzinom- und Melanom-) Proben für nachgeschaltete Laboranwendungen effektiv zu verarbeiten und zu speichern, ohne die klinischen Operationen zu beeinträchtigen.

Errichtung eines klinischen Biorepositorys

Wir präsentieren einen neuen Ansatz zur Charakterisierung von Tumorzellen. Wir kombinierten Immunfluoreszenz mit DNA-Fluoreszenz -in-Situ-Hybridisierung auszuwertende Zellen erfasst durch einen funktionalisierten medizinische Draht in der Lage, in Vivo CTCs direkt aus Patientenblut zu bereichern.

Charakterisierung von Tumorzellen mit einem medizinischen Draht zur Erfassung von zirkulierenden Tumorzellen: 3D Ansatz basierend auf Immunfluoreszenz und DNA-Fisch

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung klonaler und subklonaler Veränderungen zwischen verschiedenen Proben eines bestimmten Patienten. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf einen bestimmten Tumortyp konzentrieren, ist der Ansatz im Großen und Ganzen auf andere solide Tumoren anwendbar.

Vergleichende Lesionsanalyse durch einen gezielten Sequenzierungsansatz

Die Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) ist ein beliebtes Thema in der translationalen Forschung. Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Immunfluoreszenztest (IF) zur PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung von CTCs in Nicht-Kleinzell-Lungenkrebsproben (NSCLC).

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Erhöhung des prozentualen Tumorgehalts von formalinfixierten paraffineingebetteten Gewebeproben vor.

Verbesserung des Tumorgehalts durch Tumormakrodissektion

Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Gewinnung hochwertiger Tumor-DNA aus klinischen Proben mittels Touch-Imprint-Zytologie. Diese Technik ermöglicht eine effiziente Anreicherung von Tumorzellen für die Next-Generation-Sequenzierung.

Einfache und schnelle Methode, um qualitativ hochwertige Tumor DNA von klinischen pathologischen Proben mit Touch Impressum Zytologie zu erhalten (Video) | JoVE Journal

Einfache und schnelle Methode, um qualitativ hochwertige Tumor DNA von klinischen pathologischen Proben mit Touch Impressum Zytologie zu erhalten

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