Name: Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Erfahren Sie, wie genetisch kodierte fluorogene Sensoren die toxikologische Bildgebung von oxidativem Stress in lebenden Zellen ermöglichen. Diese Methode bietet hohe räumliche und zeitliche Auflösung sowie Sensitivität für die Untersuchung von Redox-Homöostase.

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Die Autoren möchten Katelyn Lavrich danken für Unterstützung bei der Versuchsplanung und Manuskript bearbeitet.

1. Vorbereitung der Zellen
Hinweis: Diese Vorgehensweise beschreibt die Lentivirale Transduktion eine immortalisierte Zelllinie (BEAS-2 b; ATCC, Manassas, VA) die gewünschten Reporter (roGFP2 oder HyPer) zum Ausdruck bringen. Andere Linien/Zelltypen und/oder Methoden des Gentransfers, einschließlich Transfection können genutzt werden, solange dadurch ein Maß an Reporter Ausdruck ausreichend, um eine ausreichende Anzahl von Sensor exprimierenden Zellen pro Gesichtsfeld (in der Regel 5 bis 10 Zellen) zu visualisieren. Wenn Transfektion Methoden zu verwenden, sollte das Verfahren durchgeführt werden, in der Schale, die letztlich für die Methode der Analyse verwendet werden (z. B. transfizieren Zellen in das gleiche Gericht, die das Mikroskop vorgelegt werden wird). Die unten beschriebenen Schritte geben Sie Details für die Zubereitung von Zelle Transductions in einer 6-Well Zellplatte Kultur durchgeführt werden. Wenn dieses Format keine geeignete Größe für die gewünschte Anwendung ist, können andere Schiffe ersetzt werden.
<ol><li>Wachsen Sie Zellen bis ca. 40-60 % Zusammenfluss in normales Wachstumsmedien. Hinweis: Diese Studie verwendet die menschlichen bronchialen Epithelzelle Linie, BEAS-2 b, in Keratinozyten Wachstumsmedium (KGM) angebaut.</li>
	<li>Kurz vor der Transduktion ersetzen Sie die Wachstumsmedien auf die Zellen mit 500 µL serumfreie Medien mit der entsprechenden Menge des Virus, berechnet nach der Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq1.jpg"><ol>
<li>Verwenden Sie für die Transduktion von BEAS-2 b-Zellen basalen Keratinozyten serumfreien Medium (KBM) zum der KGM Wachstumsmedien während virale Inkubationen ersetzen. Hinweis: Die obige Berechnung ist für einen einzigen Transduktion von einem gut von den Zellen in einem 6-Well-Format. Bei Bedarf führen Sie Transductions aus mehreren Brunnen durchgeführt werden können, durch eine Anpassung der Formel mit einer Multiplikation mit der Anzahl der Bohrungen, die ausgestrahlt werden. Verwenden Sie für Lentivirale Transductions eine Vielzahl von Infektionen (MOI) zwischen 5 und 20. Verwenden Sie für adenovirale Transductions einer MOI zwischen 100 und 500.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen mit der viralen Mischung bei 37 ° C für 4 h, Umverteilung der Viruspartikel in der Schale alle 30 bis 60 Minuten mit einer kurzen Schaukeln oder wirbelnden Bewegung.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der komplette Wachstumsmedien in die Schale und Inkubation bei 37 ° C für weitere 4-16 h.</li>
	<li>Entfernen Sie alle Medien und ersetzen Sie durch frische komplette Wachstumsmedium.</li>
	<li>Weiter wachsen und Durchgang Zellen, je nach Bedarf zu erweitern. Hinweis: Zellen sollte beginnen, den Sensor innerhalb von 12-48 h deutlich zum Ausdruck zu bringen. Wenn ein Lentivirale Vektor für die Transduktion verwendet wurde, sollte stabile Expression des gewünschten Sensors über Passagen weiter.</li>
	<li>Für Mikroskopie-Bewertungen Samenzellen in Glas Mikroskop Gerichte die Talsohle und wachsen, um gewünschte Zusammenfluss (≥70 - 80 %) vor der Bildgebung. Hinweis: Seeding Dichte hängt von der Größe der Schale, Wachstumsrate der Zelllinie verwendet wird und die Zeit der Bewertung nach Aussaat. Z. B. 300.000 BEAS-2 b Samenzellen in eine 35-mm-Schale um ca. 70-80 % Zusammenfluss nach 1 Tag Wachstum zu erzielen.</li>
</ol>2. Mikroskopie-Set-up
Hinweis: Die unten beschriebene Protokoll erfolgt mit einem konfokalen Mikroskop mit Laserlinien bei 404 und 488 nm ausgestattet. Andere Mittel, um fluorometrisch Bewertungen der Sensoren innerhalb dieses Protokolls bei ihrer vorgeschriebenen Erregungen/Emission beschrieben sollte auch brauchbare Daten liefern. Wichtiger ist, variieren die Geräteeinstellungen stark je nach Art, Alter und Zustand des Instruments verwendet wird; so genannten Werten jedes Instrument spezifisch für die Ausrüstung, die in anderen Labors verwendet möglicherweise nicht.
<ol><li>Führen Sie alle bildgebenden Analyse mit Umweltkontrollen weiterhin eine entsprechende Temperatur (z. B. 37 ° C), Luftfeuchtigkeit (in der Regel &gt; 95 % Relative Luftfeuchtigkeit), und/oder gas-Konzentration (z.B. 5 % CO2) geeignet für die Zellen im ganzen den während des Experiments.</li>
	<li>Wenn hohe Werte der relativen Luftfeuchtigkeit zu verwenden, halten Sie alle Oberflächen, die in Kontakt mit der feuchte Atmosphäre kommen können (zB., das Mikroskopobjektiv) an oder leicht über die Temperatur, bei der die Luftfeuchtigkeit generiert wird, um Kondensation zu verhindern. Dies kann mit dem Einsatz von einer objektiven Heizung und/oder Heizung Tape und eine entsprechende Heizungssteuerung erreicht werden.</li>
	<li>Schalten Sie alle Mikroskopkomponenten und richten Sie alle notwendige Ausstattung für sequentielle Anregung bei 488 und 404 nm mit Emission bei 510 nm. Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten der optischen Konfiguration für Echtzeit-Erwerb entsprechend festgelegt sind.</li>
	<li>Richten Sie eine Bühne-Top Klimakammer, konstante Temperatur bei 37 ° C, 5 % CO2 Atmosphäre und &gt; 95 % Luftfeuchtigkeit. Vor dem Beginn der Bildaufnahme, equilibrate der Klimakammer für mindestens 10 min nach der Ersteinrichtung des alle Umweltauflagen. Hinweis: Umweltbedingungen können beseitigt oder angepasst, je nach Experiment Länge, Zelltyp und Belichtung verwendet wird.</li>
	<li>Legen Sie die Schale der Zellen (Schritt 1.7) auf der Bühne-Top in der Klimakammer.</li>
	<li>Mit dem gewünschten Ziel Objektiv die Brennebene der Zellen mit dem Okular und weißes Licht zu finden, und normale Morphologie zu gewährleisten. Hinweis: Ein 1.4 NA 60 X violett-korrigiert, Ölbad-Objektiv wird häufig verwendet, ermöglicht die Identifizierung der intrazellulären Kompartimenten bei gleichzeitiger Maximierung der optischen Auflösung des konfokalen Systems.</li>
	<li>Überprüfen Sie den Fluoreszenz-Ausdruck der Zellen in das Blickfeld. Tun Sie es, während die Zellen unter Weitfeld-Fluoreszenz Beleuchtung mit einem entsprechenden Filter, wie z. B. Fluorescein erfolgt (FITC) zu visualisieren. An dieser Stelle mit Weitfeld-Beleuchtung, während die Blick durch das Okular ist bequemer, weil es einfacher ist, verschieben Sie die Schüssel, wählen einen Bereich von Zellen zu studieren. Wählen Sie in der Regel eine Sichtfeld, die enthält mindestens 5 bis 10 Zellen, die den Sensor zum Ausdruck bringen, wie durch grüne Fluoreszenz.<ol>
<li>Alternativ führen Sie diese Einschätzung konfokal mit Laseranregung bei einer Wellenlänge, die kompatibel mit dem Sensor zum Ausdruck gebracht wird (488 nm funktioniert in der Regel am besten). Hinweis: Aufgrund ihrer inneren fluoreszierenden Eigenschaften, es wird schwieriger sein, Zellen mit dem Ausdruck HyPer als jene mit dem Ausdruck ihrer roGFP2 mit entweder FITC zu visualisieren oder bei 488 nm. Es sollte jedoch immer noch möglich, schwache Zellen zu sehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald eine gewünschte Sichtfeld gefunden wird, schließen Sie die Klimakammer. Hinweis: Die Funktion Fokus beibehalten, oftmals auch auf fortgeschrittene Mikroskop steht, Wartung von einer stabilen Brennebene während der gesamten Studie zu erleichtern.</li>
	<li>Richten Sie Aufnahmeparameter, optimale Beurteilung des Sensors von Interesse über den gewünschten Zeitraum zu gewährleisten. Hier sind Empfehlungen und Ansätze für confocal Imaging Sensor Antworten:<ol>
<li>Passen Sie die Laserleistung für Erregung bei 488 nm und Emission bei 510 nm. Wählen Sie eine Laser-Leistungsstufe, die Visualisierung der Zellen ermöglicht, und halten Sie dies konstant zwischen Proben oder replizieren Gerichte zu. Hinweis: Für diese Studie wurden 12 % und 1,5 % Laserleistung für die 488 und 404 nm Laser-Linien bzw. verwendet.</li>
		<li>Verwenden Sie die konfokale Steuerelemente der Datenerfassungs-Software, um sicherzustellen, dass die ausgewählte Brennebene für maximale Fluoreszenz Emissionsintensität in der Mitte der Zellen (z-Achse) optimiert worden ist, durch das Scannen auf 488 nm während der Anpassung der Z-Ebene. Dies wird erleichtert durch den Einsatz einer high-Gain-Einstellung bei der Suche nach der Z-Ebene, die sich in den meisten überbelichtet Zellen ergibt. Sobald die entsprechende Brennebene gefunden worden, den Gewinn zurück zu einem Ambiente, das optimale für die Fluoreszenz des Reporters ohne Übersättigung beobachtet Pixel verwendet werden. Hinweis: Die Laser und Gain Einstellungen, die für die Suche und Beobachtung von Zellen während der Experimente eignen ist völlig abhängig von der konfokalen System genutzt wird. Im Allgemeinen, wenn die Zellen in das Sichtfeld gefunden haben, es wird empfohlen, eine minimale Menge der Laserleistung werden verwendet (in der Regel ≤20 %), wie übermäßige Scannen von Zellen unter Verwendung von High-Power-Laser-Licht oxidative Veränderungen nachweisbar durch den Sensor auslösen kann.</li>
		<li>Verwenden Sie die Verstärkung, um die Basislinie Fluoreszenz zu optimieren. Richten Sie mit roGFP2 die Basislinie in der Nähe der Obergrenze (≈ 90 % relative Intensität) des Gerätes ohne Übersättigung, wie diese Zellen 510 nm Fluoreszenz induziert durch 488 nm Anregung verlieren, wenn EGSH erhöht. Im Gegensatz dazu sollte der Fluoreszenzintensität mit 488 nm Anregung niedrig (≈ 10 % relative Intensität) bei Studienbeginn für HyPer Zellen, auszudrücken, wie diese Zellen 510 nm Fluoreszenzintensität gewinnen, wenn H2O2 erkannt wird.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.9.2 und 2.9.3 mit Erregung bei 404 nm und Emission bei 510 nm. Gain-Einstellungen für die 404 nm Anregung Wellenlänge sind gegenüber denen mit 488 nm Anregung für jeden Sensor (d.h., niedrigen Ausgangswert Fluoreszenz (≈ 10 % relative Intensität) auf 404 nm für roGFP2, hohe Ausgangswert Fluoreszenz (≈ 90 % relative Intensität) für die H2 O2 Sensor). Hinweis: im Allgemeinen werden die Fluoreszenz (510 Emission) bei 404 nm Anregung deutlich niedriger als sein, dass erhältlich mit 488 nm Anregung in Zellen mit dem Ausdruck roGFP2 und HyPer als 404 nm Gipfel eine relativ geringe Anregung für diese beiden maximale Sensoren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Datenerfassung
<ol><li>Richten Sie die Software zur Datenerfassung nacheinander die beiden Erregung Wellenlängen begeistern (erste 488 nm und dann 404 nm) und sammeln Sie Emissionen für beide bei 510 nm in einem vorgegebenen Zeitintervall über die gewünschte Länge des Experiments (z. B. Bilder erfassen alle 60 s für 60 min).<ol>
<li>Alternativ erwerben Sie Bilder manuell vor und nach der Exposition, wenn der ungefähren Zeitpunkt der Änderungen in EGSH oder H2O2 für die Harnblase zu testenden bekannt sind. Jedoch kann dies zum Verlust der zeitlichen Auflösung führen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie für Echtzeit-Bewertung der Versuchsparameter mindestens 5-10 Sensor exprimierenden Zellen im Feld und etablieren sie als Regionen von Interesse ("ROIs"), deren Fluoreszenz-Veränderungen während des Experiments zu überwachen. Hinweis: Dieser Schritt ist optional und kann nach dem Experiment durchgeführt werden, wenn die direkte Beobachtung in Echtzeit unerwünscht ist oder Softwareeinschränkungen zu verhindern, dass die kontinuierliche Überwachung. Je nach Zell-Population könnte die Auswahl des Sensors mit dem Ausdruck Zellen als ROIs einen Ausdruck Niveaus zellenübergreifend darzustellen.<ol>
<li>Fügen Sie für diese Studien Umwelt vergiftendes 9,10-Phenanthrenequinone (9,10-PQ) oder Wasserstoffperoxid (H2O2 hinzu) nach einem 5-min Basisperiode.</li>
		<li>Bereiten Sie alle Reagenzien für die spätere Verwendung in diesem Protokoll.  Lösen Sie 9,10-PQ in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) zu einer Konzentration von 15 mM zu, und verdünnen Sie Basalzell-Medien eine 250 µM funktionierende Lösung zu liefern.  Darüber hinaus bereiten Sie eine funktionierende Lösung von Wasserstoffperoxid in Wasser, das eine Endkonzentration von 1 mM nach Einspritzung erbringt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald der experimentellen Parameter definiert wurden, beginnt der Kurs Erwerb. Etablieren einer Basisperiode mindestens 5 min (oder 5 Datenpunkte) vor dem Beginn der Xenobiotika Belichtungen.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen, die die Schlüpfzeit untersucht mit herkömmlichen Ansätzen zur in-vitro- Dosierung. Bereiten Sie lösliche Verbindungen in Wasser oder anderen geeigneten Lösungsmittel und Spritzen Sie direkt in den Medien.<ol>
<li>Wenn organische Lösungsmittel (z.B. Dimethyl Sulfoxid oder Ethanol) erforderlich sind, halten Sie die endgültige Lösungsmittelkonzentration bei oder unter 0,1 %. Stellen Sie sicher, dass das Lösungsmittel keine auf EGSH oder H2O2 Produktion mit einer Fahrzeugkontrolle in eine separate Schüssel mit Zellen Wirkung.</li>
		<li>Fügen Sie für Verbindungen mit niedriger Löslichkeit einen Mischschritt mit einer Mikropipette des Protokolls nach die Injektion erfolgt. Pumpen Sie gasförmige Aufnahmen direkt in der Klimakammer mit der entsprechenden Träger-Gas-Gemisch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überwachen Sie Änderungen in Fluoreszenz während der Expositionszeit. Führen Sie nachfolgende Injektionen je nach Bedarf. Sorgsam nicht die Schüssel während Injektionen, verschieben, dass die gleichen Zellen im Laufe die ganze Zeit während in der gleichen Brennebene abgebildet eingehalten werden.</li>
	<li>Am Ende des Experiments setzen Sie die Zellen, die entsprechenden Kontrollen. Fügen Sie für beide Sensoren genetisch codierte Fluorogenic bestimmte Konzentrationen von Verbindungen zu oxidieren und reduzieren diese Sensoren in einer Spitzen Demonstration ihrer Reaktionsfähigkeit ratiometrischen bekannt hinzu. H2O2 und Dithiothreitol (DTT) dienen als angemessene Kontrollen zu oxidieren und beide Sensoren verringern. In der Regel ermöglicht eine Endkonzentration von 100-1.000 µM H2O2, gefolgt von 1-5 mM Dithiothreitol (DTT), dem Benutzer vollständig zu oxidieren und reduzieren diese Sensoren.<ol>
<li>Verwenden Sie für diese Studien 1 mM H2O2 , gefolgt von 5 mM DTT, um die maximale Sensor Reaktion zu bestimmen.</li>
		<li>Warten Sie mindestens 5 min um den Sensor zu reagieren zu ermöglichen, und dann Spritzen Sie Reduktionsmittel, wie DVB-t, reduzieren die Senor und auf ein Niveau von Fluoreszenz an oder nahe der etablierten Grundlinie zurück. Hinweis: Die Verwendung von Steuerelementen in diesem Schritt ist entscheidend für die Normalisierung und sollte durchgeführt werden, am Ende von jedem Versuch, den Dynamikumfang des Sensors in jeder Zelle zu bestimmen. Für roGFP2 kann Aldrithiol auch am Ende des Experiments hinzugefügt werden. Aldrithiol umgeht das roGFP2 Redox-Relais um den Sensor direkt oxidieren. Dies ist nützlich, um Sensor-Funktion nach Xenobiotika Exposition zu beurteilen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Datenanalyse
<ol><li>Wenn nicht bereits etabliert, ROIs zeichnen um die Zellen analysiert werden. Verwenden Sie die entsprechende Software, um der Fluoreszenzintensität von jedem ROI bei jeder Wellenlänge im Laufe der Zeit zu messen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht bewegen oder die Platte während des Laufs nicht verschieben. Hinweis: Die Einrichtung des ROIs geschieht am einfachsten indem man einen geschlossenen Bereich, der das fluoreszierende Expressionsmuster von jeder Zelle folgt. Um weiter mit diesem Prozess zu unterstützen, kann eine übertragene Licht (oder Hellfeld) Bild der Zellen innerhalb der etablierten Sichtfeld bei Bemühungen um Zellengrenzen definieren auf das fluoreszierende Bild überlagert werden. Allerdings erfordert die Verwendung der übermittelten Lichtbild den Benutzer einen zusätzlichen Kanal (Satz von Bildern) im Laufe des Experiments zu erfassen. Alternativ übernehmen bestimmte Hersteller Algorithmen in ihrer imaging-Software, mit denen bestimmte Parameter z. B. Intensität Schwellenwerte um ROIs in einer mehr quantitative, weniger subjektive Methode zu etablieren.</li>
	<li>Exportieren Sie die Daten in der gewünschten Analyse-Software (z. B. elektronische Arbeitsblatt).</li>
	<li>Berechnen Sie die ratiometrischen Sensor Antwort für jedes ROI zu jedem Zeitpunkt mit den Formeln: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq3.jpg">
</li>
	<li>Für jeden Zeitpunkt Durchschnittswerte der berechneten ratiometrischen alle Rois.</li>
	<li>Berechnen Sie den Baselinewert, der verwendet wird, um die Daten zu normieren, indem man die vorher berechnete ratiometrischen Werte (Schritt 4.4) vor Zugabe der Harnblase (z. B. die ersten fünf Mal Punkte) gesammelt.</li>
	<li>Normalisieren Sie die ratiometrischen Werte aus Schritt 4.4 durch Teilung jeder Wert durch den Ausgangswert in 4.5 berechnet. Normalisierte Verhältnisse zentriert um einen Wert von 1 zu Studienbeginn, während der Anstieg der EGSH oder H2O2 folgende Injektionen werden dazu führen, dass das Verhältnis zu erhöhen. Bewertungen der Harnblase, die oxidative Veränderungen zu bewirken sind in der Regel um Werte in einem Bereich von 3 - 6 Mal den Ausgangswert zu erzielen.</li>
	<li>Zur Unterstützung beim Vergleich der Antworten innerhalb und zwischen den Experimenten express normalisierten Daten als Prozentsatz der maximalen Sensor Reaktion durch die Reaktion auf das Steuerelement Oxidationsmittel (z. B. 1 mM H2O2) als 100 % definiert. Hinweis: Wenn Daten als Prozentsatz der maximalen Sensor Antwort zum Ausdruck zu bringen, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die gleiche Konzentration des Oxidationsmittels Kontrolle über Experimente konsistent verwendet wird. Alle Daten aus live Cell imaging Analyse ist offen für konventionelle paarweisen und unternehmensweite statistische Analyse im Ermessen des Prüfers gewählt werden.</li>
</ol>

Die Forschung in diesem Artikel beschriebenen wurde bewertet von National Health und ökologischen Auswirkungen Research Laboratory, US Environmental Protection Agency, und zur Veröffentlichung freigegeben. Der Inhalt dieses Artikels dürfen nicht so ausgelegt werden, um die Agentur Politik vertreten, noch stellt die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte Billigung oder Empfehlung für den Einsatz.

Die Verwendung von roGFP2 und HyPer bei der Erkennung von Änderungen im intrazellulären EGSH und H2O2, bzw. wurde gut beschrieben in früheren physiologische und toxikologische Studien 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Das Protokoll...

Der Begriff "oxidativer Stress" häufig als einen Mechanismus in der Toxikologie, zitiert ist noch ist selten dieser Begriff konkret beschrieben. Oxidativer Stress kann beziehen sich auf verschiedene intrazelluläre Prozesse, einschließlich der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies, Schäden durch freie Radikale, die Oxidation von antioxidativen Molekülen, und auch die Aktivierung der spezifischen Signalisierung Kaskaden. Ein breites Spektrum von Umweltkontaminanten1,2 und pharmazeutische Wirkstoffe3,4 , oxidativen Stress durch entweder direkte Aktion der Xenobiotika Verbindung selbst5 induzieren dokumentiert wurden ,6 oder sekundär durch Produktion von Oxidationsmittel Arten im Rahmen einer zellulären Antwort7,8,9,10. Es ist daher von großem Interesse in der Toxikologie genau zu beobachten und charakterisieren die oxidative Prozesse, die zu unerwünschten Ergebnissen führen. Herkömmliche Methoden der Messung von oxidativen Stress beteiligt Identifizierung von oxidierter Biomoleküle11,12,13,14,15 oder Antioxidantien16 ,17,18,19,20, oder die direkte Messung von reaktiven Spezies sich21,22,23, 24. Diese Methoden erfordern jedoch in der Regel zellulären Störungen, die oft verbraucht die Probe, beseitigt räumlichen Auflösung und potenziell stellt Artefakte25. Die Entwicklung sensitiver und spezifischer Methoden für die Erkennung von Oxidationsmittel Arten und Marker des oxidativen Stresses ist breit anwendbar für die Untersuchung der Nebenwirkungen von Xenobiotika Exposition.
Live-Cell-Mikroskopie mit einer neuen Generation von genetisch codierte Fluorogenic Sensoren ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung des intrazellulären Redox-Status von lebenden Zellen entstanden. Diese Sensoren sind in der Regel durch einen Vektor unter der Kontrolle von viralen Promotor, der über Transfektion oder Transduktion Methoden eingeführt wird ausgedrückt. Hohe Expression Wirkungsgrade sind nicht notwendig, da Zellen, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Sensors optisch leicht identifiziert werden können. Für die toxikologische Beurteilung können Zellen, die mit dem Ausdruck dieser Sensoren mit Fluoreszenz-Mikroskopie, wie sie, insbesondere Verbindungen in Echtzeit ausgesetzt sind beobachtet werden. Diese Versuchsanordnung erlaubt wiederholte Messungen in der gleichen Zelle, so dass jede Zelle etablierten Grundlinie als seine eigene Kontrolle zu handeln. Die hohe zeitliche Auflösung, die gebotene live Cell Imaging eignet sich gut für die Erkennung von oxidativen Ereignisse, insbesondere solche, die bescheiden in Größe oder Transienten in der Natur sind. Abgesehen davon, dass Sensitivität und Spezifität zu ihren Zielmolekülen, kann die Fluoreszenz von einigen dieser Sensoren mit zwei Wellenlängen des Lichts angeregt werden. Dieses Phänomen ermöglicht die fluoreszente Emission als Verhältnis, ausgedrückt werden, das ermöglicht die Unterscheidung der Signal Veränderungen im Zusammenhang mit authentischen Sensor Antworten von denen verursacht durch Artefakte wie Variationen im Sensor Ausdruck, Zelle Dicke, Lampe Intensität, Immunofluoreszenz und Empfindlichkeit der Fluoreszenz-Detektor-26. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Fluorogenic Sensoren ist, dass sie können, um spezifische zelluläre Fächer ausgerichtet werden, erstellen ein Maß an räumlicher Auflösung, der durch konventionelle Methoden25,26,27unübertroffen ist.
Eine große Familie von genetisch codierten Sensoren basierend auf grün fluoreszierendes Protein (GFP) entwickelt und charakterisiert, Bericht über eine Vielzahl von physiologischer Marker, einschließlich pH-Wert, Temperatur, Kalzium-Konzentrationen und das ATP/ADP-Verhältnis25 ,28,29,30,31. Unter diesen sind Sensoren des Glutathion Redoxpotential (EGSH) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Während diese Sensoren für Anwendungen in der Redox-Biologie und Physiologie entwickelt wurden, wurden sie auch angepasst, Fremdstoff-induzierten oxidativen Stress zu studieren. Insbesondere beschreibt das Protokoll hier skizzierten die Nutzung von E-GSH -Sensor roGFP2 und H2O2 Sensor HyPer.
roGFP2 berichtet über das Redoxpotential von intrazellulären reduzierte und oxidierte Glutathion (GSH/GSSG) über ein Redox-Relais mit Glutathion-Peroxidase (GPx), Glutaredoxin (Grx) und Glutathion-Reduktase (GR) (Abbildung 1)25, 32 , 33. Glutathion ist das vorherrschende zelluläre antioxidative Molekül und ist in erster Linie in seiner reduzierten Form (GSH) in millimolaren Konzentrationen im Zytosol25,34. Während EGSH nicht mit irgendeinem funktionellen Ergebnis verbunden worden ist, wird es als ein wichtiger Indikator der intrazellulären oxidativen Status34erkannt. Eine relativ geringe Erhöhung der Konzentration von GSSG führt zu einer Erhöhung in EGSH , die durch roGFP2 nachweisbar ist. Ebenso wichtig, Überwachung der EGSH mit roGFP2 bei Xenobiotika Belichtungszeiten kann potenziell verraten viel über den Wirkmechanismus an mehreren Stellen in der Redox-Staffel und damit verbundenen Wege, wie die Pentose-Phosphat-shunt (Abbildung 1 )35. Der zweite Sensor hier diskutiert, HyPer, ist eine intrazelluläre H2O2 Sonde abgeleitet aus der Einfügung gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) in der regulatorischen Domäne von bakteriellen H2O2-sensible Transkription Faktor OxyR136. Obwohl es zuvor eine schädliche reaktiven Sauerstoff Mittelstufe behandelt hat, ist H2O2 zunehmend als eine wichtige intrazelluläre Signalmolekül unter physiologischen Bedingungen37, erkannt 38, was darauf hindeutet, dass unbekannte Rollen für H2O2 in der Toxikologie als auch vorhanden sind. Zum Beispiel könnte überschüssige H2O2 induziert durch Xenobiotika Exposition eine Vorstufe zu Dysregulation in zellulären Signal- oder eine Verschiebung der Bioenergetik.
Beide Fluorogenic genetisch codierten Sensoren wurden in mehrere etablierte Zelllinien, einschließlich der menschlichen epidermoid Carcinoma Zelle A431 und menschlichen bronchialen Epithelzelle Linie BEAS-2 b, zu Änderungen in EGSH und H2 beobachten geäußert O2 in Reaktion auf eine Vielzahl von toxikologischen Belichtungen. Dazu gehören gasförmige Schadstoffe (Ozon-35), lösliche Bestandteile von Feinstaub (1,2 Naphthoquinone39,40 und Zink41) und Nickel-Nanopartikel (unveröffentlichte Daten). Diese Studien stellen nur eine kleine Teilmenge der möglichen Anwendungen der beiden Sensoren. Theoretisch kann jeden Zelltyp, der empfangen und mit dem Ausdruck der DNS dieser Sensoren durch konventionelle molekularbiologische Techniken kann, genutzt werden, um die Beurteilung der Auswirkungen von Xenobiotika im Verdacht, den zellulären oxidativen Status ändern. Bis heute hat eine oder mehrere dieser Sensoren in verschiedenen Prokaryoten und Eukaryoten, darunter mehrere Säugetier, Pflanze, Bakterien und Hefe Zelle Arten25,26,36,42geäußert. Die Anzeige für EGSH und H2O2 Sensoren ist eine Änderung in der Intensität der Fluoreszenz emittiert bei 510 nm bei Anregung mit 488 und 404 nm-Licht. Diese Methode ist allgemein anpassungsfähig auf fluorometrisch Plattformen, einschließlich verschiedene Arten von Mikroskopie (konfokale und Weitfeld-) und Platte Leser. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht empfindliche und spezifische Beobachtung der intrazellulären EGSH und H2O2 in in-vitro- toxikologischen Systeme.

<table><tbody><tr><td>roGFP2 Plasmid</td><td>University of Oregon</td><td>N/A</td><td>Großzügiges Geschenk von S.J. Remington</td></tr><tr><td>HyPer Plasmid</td><td>Evrogen</td><td>FP941</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708984001</td><td></td></tr><tr><td>9,10-Phenanthrenequinon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156507</td><td></td></tr><tr><td>Schwarz Wandschalen mit Glasboden</td><td>Ted Pella</td><td>14029-20</td> BEAS-2B <td></td></tr><tr><td>Zelllinie</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Keratinozyten-Basalmedium</td><td>Lonza</td><td>192151</td><td></td></tr><tr><td>Keratinozyten-Wachstumsmedium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Excel&nbsp;</td><td>Microsoft Office Suite</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR Imaging Software</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1si Konfokales Imaging System</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging-ansätze zur bewertung der toxikologischen oxidativen stress mit genetisch codierte fluorogenic sensoren

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Während oxidativer Stress eine häufig zitierte toxikologischen Mechanismus ist, leiden einige Mängel, einschließlich Zerstörung der Probe, Einführung der möglichen Artefakte und mangelnder Spezifität für die reaktive konventionelle Methoden zu studieren beteiligten Spezies. So gibt es einen aktuellen Bedarf auf dem Gebiet der Toxikologie für die zerstörungsfreie, sensitive und spezifische Methoden, die verwendet werden können, zu beobachten und zu quantifizieren, intrazellulären Redox-Störungen, häufiger als oxidativer Stress bezeichnet. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die Verwendung von zwei genetisch codierte Fluorogenic Sensoren, roGFP2 und HyPer in live Cell imaging Studien verwendet werden, um Fremdstoff-induzierte oxidative Reaktionen zu beobachten. roGFP2 gestalten mit der Glutathion-Redoxpotential (EGSH), während HyPer direkt erkennt Wasserstoffperoxid (H2O2). Beide Sensoren in verschiedenen Zelltypen über Transfektion oder Transduktion ausgedrückt werden können, und können zu bestimmten zellulären Kompartimenten ausgerichtet sein. Am wichtigsten ist, bietet live-Cell-Mikroskopie mit diesen Sensoren hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung, der mit herkömmlichen Methoden nicht möglich ist. Änderungen in der Fluoreszenzintensität überwacht bei 510 nm dient als Anzeige für beide genetisch codierte Fluorogenic Sensoren nacheinander begeistert von 404 nm und 488 nm Licht. Diese Eigenschaft macht beide Sensoren ratiometrischen, Beseitigung von gemeinsamen Mikroskopie Artefakte und Berichtigung für Unterschiede bei den Sensor Ausdruck zwischen den Zellen. Diese Methodik kann über eine Vielzahl von fluorometrisch Plattformen in der Lage, spannende und sammeln von Emissionen bei der vorgeschriebenen Wellenlängen, bildet es verwendbar für Gebrauch mit konfokale bildgebenden Systemen, konventionellen Weitfeld-Mikroskopie und Platte Leserinnen und Leser. Beide Fluorogenic genetisch codierten Sensoren wurden in einer Vielzahl von Zelltypen und toxikologischen Studien zur zellulären EGSH und H2O2 Generation in Echtzeit zu überwachen. Die hier skizzierten ist eine standardisierte Methode, die allgemein anpassungsfähig Zelltypen und fluorometrisch plattformübergreifend für die Anwendung von roGFP2 und HyPer im Leben-Zelle toxikologische Bewertungen von oxidativem Stress.

Die Verwendung von roGFP2 und HyPer bei der Erkennung von Änderungen im EGSH und intrazellulären H2O2 wurde zuvor beschriebenen25,36,42,43 und wird hier gezeigt. Konfokale Bilder mit dem Ausdruck roGFP2 bei Baseline und folgenden Zusatz von H2O2 und DVB-t-Zellen sind in Abbildung 2</stro...

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von genetisch codierte Fluorogenic Reporter in einer live Cell Imaging-Anwendung für die Prüfung der Harnblase-induzierten oxidativen Stress. Diese experimentelle Ansatz bietet unvergleichliche räumlich-zeitliche Auflösung, Sensitivität und Spezifität vieler die Unzulänglichkeiten der konventionellen Methoden zur Erkennung von toxikologischen oxidativen Stress zu vermeiden.

Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die Verwendung von genetisch kodierten Redoxsensoren für die spezifische Bewertung von Giftstoff-induzierten Störungen in der Redoxhomöostase zu etablieren. Durch die Überwindung der erheblichen Einschränkungen herkömmlicher Ansätze, die bei oxidativem Stress verwendet werden, wird diese Methode dazu beitragen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit toxikologischem oxidativem Stress zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein hohes Maß an Spezifität und Sensitivität mit einer beispiellosen räumlich-zeitlichen Auflösung kombiniert, um toxikologischen oxidativen Stress in lebenden Zellen zu untersuchen.Führen Sie alle bildgebenden Analysen mit einem konfokalen Mikroskop durch, das mit Laserlinien bei 404 und 488 Nanometern und Umgebungskontrollen ausgestattet ist, um während der gesamten Dauer des Experiments eine für die Zellen geeignete Temperatur, Luftfeuchtigkeit und/oder Gaskonzentration aufrechtzuerhalten. Wenn Sie hohe Werte für die relative Luftfeuchtigkeit verwenden, verwenden Sie eine objektive Heizung und/oder ein Heizband, um Oberflächen, die mit der befeuchteten Atmosphäre in Berührung kommen könnten, auf oder leicht über der Temperatur zu halten, bei der die Feuchtigkeit erzeugt wird, um Kondensation zu vermeiden. Schalten Sie alle Mikroskopkomponenten ein und richten Sie alle erforderlichen Geräte für die sequentielle Anregung bei 488 und 404 Nanometern mit der Emission bei 510 Nanometern ein.Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten der optischen Konfiguration für die Echtzeiterfassung entsprechend eingestellt sind. Richten Sie eine Bühnenklimakammer ein, um eine konstante Temperatur von 37 Grad Celsius, 5 % CO2-Atmosphäre und mehr als 95 % Luftfeuchtigkeit zu halten. Bevor Sie mit der Bildaufnahme beginnen, äquilibrieren Sie die Klimakammer für mindestens 10 Minuten nach der ersten Einrichtung aller Umgebungskontrollen.Stellen Sie die Zellschale auf die Tischplatte in der Klimakammer. Finden Sie mit der gewünschten Objektive die Brennebene der Zellen mit dem Okular und weißem Licht und stellen Sie sicher, dass die Morphologie normal ist. Häufig wird eine ölgetauchte Objektivlinse mit numerischer Apertur und 60 x violetter Apertur verwendet, die die Identifizierung intrazellulärer Kompartimente ermöglicht und gleichzeitig die optische Auflösung des konfokalen Systems maximiert.Überprüfen Sie die Fluoreszenzexpression der Zellen im Sichtfeld, während Sie die Zellen unter Weitfeld-Fluoreszenzbeleuchtung mit einem geeigneten Filterset wie Fluoreszian-Isothioanat oder FITC visualisieren. An dieser Stelle ist die Verwendung einer Weitfeldbeleuchtung beim Blick durch das Okular bequemer, da es einfacher ist, die Schale zu bewegen, um ein zu untersuchendes Zellfeld auszuwählen. Sobald ein gewünschtes Sichtfeld gefunden ist, schließen Sie die Klimakammer.Verwenden Sie die Funktion zur Beibehaltung des Fokus, um die Aufrechterhaltung einer stabilen Fokusebene während der gesamten Studie zu erleichtern. Richten Sie anschließend Erfassungsparameter ein, um eine optimale Bewertung des interessierenden Sensors über die gewünschte Belichtungszeit zu gewährleisten. Stellen Sie dazu die Laserleistung für die Anregung bei 488 Nanometern und die Emission bei 510 Nanometern ein.Wählen Sie eine Laserleistung, die die Visualisierung der Zellen ermöglicht, und halten Sie diese zwischen den Proben oder Replikatschalen konstant. Verwenden Sie die konfokalen Steuerungen der Erfassungssoftware, um sicherzustellen, dass die ausgewählte Fokusebene für die maximale Intensität der Fluoreszenzemission im Zentrum der Zellen optimiert wurde, indem Sie bei 488 Nanometern scannen, während Sie die Z-Ebene einstellen. Verwenden Sie eine hohe Verstärkungseinstellung, während Sie die Z-Ebene mit den am stärksten belichteten Zellen anpassen.Nachdem die geeignete Fokusebene gefunden wurde, setzen Sie die Verstärkung auf eine Einstellung zurück, die für die Fluoreszenz des verwendeten Reporters am optimalsten ist, ohne die beobachteten Pixel zu übersättigen. Verwenden Sie dann die Verstärkung, um die Basisfluoreszenz fein abzustimmen. Mit roGFP2 legen Sie die Basislinie nahe der oberen Grenze des Instruments ohne Übersättigung fest, da diese Zellen eine durch 488 Nanometer Anregung induzierte Fluoreszenz von 510 Nanometern verlieren, wenn das Glutathion-Redoxpotential zunimmt.Wiederholen Sie diese Schritte mit Anregung bei 404 Nanometern und Emission bei 510 Nanometern. Die Verstärkungseinstellungen für die Anregungswellenlänge von 404 Nanometern sind gegensätzlich zu denen, die für jeden Sensor mit einer Anregung von 488 Nanometern verwendet werden. Im Allgemeinen ist die Fluoreszenz der 404-Nanometer-Anregung erheblich geringer als die mit der 488-Nanometer-Anregung in Zellen, die roGFP2 exprimieren, erreicht werden kann, da ein 404-Nanometer-Peek ein relativ geringes Anregungsmaximum für diesen Sensor darstellt.Richten Sie die Erfassungssoftware so ein, dass die beiden Anregungswellenlängen nacheinander angeregt und die Emissionen für beide bei 510 Nanometern und in einem vorgegebenen Zeitintervall über die gewünschte Länge des Experiments gesammelt werden. Für die Echtzeitbewertung der experimentellen Parameter wählen Sie mindestens fünf bis 10 sensorexprimierende Zellen im Feld aus und richten Sie sie als interessante Regionen ein, um ihre Fluoreszenzänderungen während des Experiments zu überwachen. Als nächstes lösen Sie das Umweltgift, 9,10-PQ in Dimethylsulfoxid bis zu einer Konzentration von 15 Millimolar.Das gelöste Toxin wird in Basalzellmedien auf eine 250 μmolare Arbeitslösung für eine Endkonzentration von 25 μmolar verdünnt. Bereiten Sie zusätzlich eine Arbeitslösung aus Wasserstoffperoxid für die spätere Verwendung in diesem Protokoll vor. Nachdem die experimentellen Parameter definiert wurden, beginnen Sie mit der Erfassung des Zeitverlaufs.Legen Sie einen Basiszeitraum von mindestens fünf Minuten fest, bevor Sie mit der Xenobiotika-Exposition beginnen. Setzen Sie die Zellen dem zu untersuchenden Giftstoff mit herkömmlichen Ansätzen für die In-vitro-Dosierung aus. Überwachen Sie Änderungen der Fluoreszenz während der Expositionsperiode.Führen Sie bei Bedarf nachfolgende Injektionen durch. Achten Sie sehr darauf, dass sich die Schale während der Injektionen nicht verschiebt, so dass während des gesamten Zeitverlaufs dieselben Zellen verfolgt werden, während sie in derselben Brennebene abgebildet werden. Am Ende des Experiments werden die Zellen den entsprechenden Kontrollen ausgesetzt, um roGFP2 vollständig zu oxidieren und zu reduzieren.Die Hinzufügung von Kontrollsimulationen validiert die Reaktionsfähigkeit des Sensors am Ende der Exposition und bestätigt, dass die beobachteten Reaktionen nicht die direkte Folge einer Beschädigung des Detektors sind. Daher ist es besonders wichtig bei der ersten Bewertung eines Toxins. Verwenden Sie für diese Studien ein millimolares Wasserstoffperoxid, um die maximale Sensorreaktion zu bestimmen.Warten Sie mindestens fünf Minuten, bis der Sensor reagiert, und injizieren Sie dann ein Reduktionsmittel wie DVB-T, um den Sensor zu reduzieren und ihn wieder auf ein Fluoreszenzniveau zu bringen, das dem festgelegten Ausgangswert entspricht oder nahe kommt. Führen Sie abschließend die Datenanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier sind repräsentative Ergebnisse gezeigt, die eine etablierte Dosisreaktion veranschaulichen, die mit der bronchialen Epithelzelllinie Bees 2B erzeugt wurde, die roGFP2 exprimiert.Der Cursor zeigt die Exposition von fünf mikromolaren, 25 mikromolaren oder 100 mikromolaren Dosen Wasserstoffperoxid. Die Exposition von Bienen-2B-Zellen gegenüber einem bisher ungetesteten Umweltgift, 9, 10-PQ, induziert einen allmählichen, aber starken Anstieg des intrazellulären Glutathion-Redoxpotentials, wie mit roGFP2 bewertet. Hier stellt jede Zeile das rohe roGFP2-Verhältnis der einzelnen Zellen in der Schale dar.Obwohl die Testverbindung eine maximale Reaktion erzeugt, die mit einem millimolaren Wasserstoffperoxid vergleichbar ist, verursachte dieser bekannte Redoxcycler eine Veränderung des Sensors, die durch die Zugabe von fünf millimolaren DTT vollständig reduziert wurde, was darauf hindeutet, dass der Sensor nach Exposition gegenüber dieser redoxaktiven organischen Verbindung funktionsfähig bleibt. Dieser Ansatz wird Toxikologen bei der Untersuchung wichtiger mechanistischer Ereignisse bei toxischem, induziertem oxidativem Stress helfen und den Weg für gezieltere Studien auf dem aufstrebenden Gebiet der Redoxtoxikologie über ein breites Spektrum von Giftstoffen und Zelltypen ebnen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie genetisch kodierte Sensoren und Lebendzellmikroskopie einsetzen können, um zentrale Marker für toxikologisch-oxidativen Stress mit hoher Sensitivität und Spezifität bei unübertroffener räumlich-zeitlicher Auflösung zu überwachen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

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