Visualisierung von Lignification Dynamik in Anlagen mit Klicken Sie auf Chemie: doppelte Kennzeichnung ist Glückseligkeit!

Das übergeordnete Ziel dieser dualen Markierungsmethode ist es, aktiv verholzende Zonen von Pflanzengeweben zu beobachten. In diesem Arbeitsablauf wird die chemische Reporterstrategie unter Verwendung von zwei unterschiedlichen chemischen Reportern in einer sequentiellen Kombination von bioorthogonalen Klick-Chemiereaktionen angewendet. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Pflanzenbiologie zu entschlüsseln, z. B. die Bestimmung, welche Faktoren die räumliche oder zeitliche Bildung von Lignin in Pflanzen und Wänden regulieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ausschließlich auf das Lignin abzielt, das beim metabolischen Einbau entsteht. Es unterscheidet es von bereits vorhandenem Lignin in der Probe. Obwohl wir diese Methode ursprünglich entwickelt haben, um Verholzungsflaggen zu untersuchen, könnte sie auch bei anderen Arten wie Arabidopsis, Pappel oder jeder anderen Pflanze, die Lignin produziert, angewendet werden.

Um diese Technik vorzustellen, haben wir Clemence Simon, eine Doktorandin, die an der Schnittstelle zwischen Chemie und Biologie arbeitet und diese Technik verwendet, um die Verholzungsdynamik zu untersuchen. Bereiten Sie zunächst eine chemische Reporterlösung mit 300 Mikrolitern vor, die zehn Mikromuller des mit Alkin markierten G-Reporters enthält. Und zehn Mikromüller mit Azid-markiertem H-Reporter und flüssigem sterilem 1/2 MS-Medium.

Wirbeln Sie die Lösung vor und überführen Sie sie mit einer Transferpipette in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte. Es wird eine 300-Mikroliter-Negativkontrolllösung hergestellt, die zehn Mikromüller von G und zehn Mikromüller von H und flüssiges steriles 1/2 MS-Medium enthält. Wirbeln Sie die Lösung vor und überführen Sie sie in eine zweite Vertiefung derselben 48-Well-Platte.

Schneiden Sie mit einer sauberen Rasierklinge den Stiel einer zwei Monate alten Flachspflanze zehn Zentimeter über dem Bodenniveau ab. Bereiten Sie mit der Rasierklinge fleißig 50 freihändige Querschnitte des Stiels vor und legen Sie diese sofort in ein 1/2 MS-Medium. Wählen Sie dann intakte, ganze Querschnitte aus und verteilen Sie zehn davon nach dem Zufallsprinzip in der mit der chemischen Reporterlösung gefüllten Vertiefung, wobei darauf zu achten ist, dass das Gewebe nicht beschädigt wird.

Die Querschnitte müssen fest und sauber geschnitten werden und der Querschnitt muss gerade sein. Du brauchst eine ruhige Hand und eine scharfe Rasierklinge, um das Taschentuch intakt zu halten. Es wird empfohlen, vorher zu üben.

Nachdem Sie zehn intakte Querschnitte in der Negativkontrolllösung verteilt haben, inkubieren Sie die Platte 20 Stunden lang in kontinuierlichem Licht in einer Wachstumskammer bei 20 Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag die monolignale Lösung in jeder Vertiefung mit einer Mikropipette. Geben Sie 500 Mikroliter 1/2 MS Medium in jede Vertiefung und rühren Sie zehn Minuten lang vorsichtig um.

Entfernen Sie dann die Spüllösung mit einer Mikropipette. Bereiten Sie einen Milliliter einer stammgeförderten Azid-Alkin-Cycloadditionslösung vor. Enthält fünf Mikromuller mit Cycloocten-markiertem Fluoreszenzfarbstoff und flüssigem, sterilem 1/2 MS-Medium.

Wirbeln Sie dann die Lösung. Entfernen Sie nach den letzten Waschschritten des metabolischen Inkorporationsprotokolls das 1/2 MS-Medium und geben Sie mit einer Mikropipette 300 Mikroliter der SPAAC-Lösung in jede Vertiefung. Schützen Sie die 48-Well-Platte vor Licht, indem Sie sie in eine Box legen.

Rühren Sie die Platte dann eine Stunde lang im Dunkeln bei Umgebungstemperatur vorsichtig auf einem mechanischen Shaker um. Anschließend jede Platte wie zuvor beschrieben viermal gut mit 1/2 MS Medium waschen, dabei die Platte im Dunkeln halten. Bereiten Sie einen Milliliter kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloadditionslösung vor, die Natriumascorbat, Kupfersulfat und azidmarkierten Fluoreszenzfarbstoff enthält, sowie flüssiges steriles 1/2 MS-Medium.

Wirbeln Sie dann die Lösung ein. Nachdem Sie das 1/2 MS-Medium entfernt haben, legen Sie die Platte in eine Schachtel und geben Sie mit einer Mikropipette 300 Mikroliter der CuAAC-Lösung in jede Vertiefung. Rühren Sie die Platte auf einem mechanischen Shaker eine Stunde lang im Dunkeln bei Umgebungstemperatur vorsichtig um.

Entfernen Sie die Platte aus dem mechanischen Schüttler und entfernen Sie die CuAAC-Lösung mit einer Mikropipette aus jeder Vertiefung. Fügen Sie dann 500 Mikroliter 1/2 MS Medium hinzu und rühren Sie die Platte auf dem mechanischen Shaker zehn Minuten lang im Dunkeln um. Nachdem Sie noch zwei Mal mit 1/2 MS Medium gewaschen haben, geben Sie 500 Mikroliter einer 7:3 Methanol- und Wasserlösung in jede Vertiefung

Rühren Sie die Platte auf dem mechanischen Shaker eine Stunde lang im Dunkeln um. Entferne dann die Lösung aus den Vertiefungen. Geben Sie dann 500 Mikroliter 1/2 MS Medium in jede Vertiefung und rühren Sie zehn Minuten lang im Dunkeln um.

Nachdem Sie diese Wäsche viermal wiederholt haben, bewahren Sie die Querschnitte in 1/2 MS Medium lichtgeschützt auf. Geben Sie fünf Tropfen Eindeckmedium auf einen Objektträger aus Glasmikroskop. Legen Sie dann jeden mit chemischen Reporter-Tags versehenen Querschnitt vorsichtig auf den Objektträger.

Tragen Sie Nagellack auf zwei gegenüberliegende Seiten der Folie auf. Decken Sie die Folie mit einem Deckglas ab und achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Entfernen Sie dann überschüssiges Einbettmedium mit einem Papiertuch.

Versiegeln Sie anschließend die Probe an allen vier Seiten mit Nagellack. Nachdem der Nagellack getrocknet ist, lagern Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius im Dunkeln bis zur Betrachtung unter einem Konfokalmikroskop. Pflanzenteile neigen dazu, nach dem Trocknen knackig zu werden.

Achten Sie darauf, diese immer in Lösung zu halten und die Deckgläser von allen Seiten mit Nagellack zu versiegeln. Es erhöht die Haltbarkeit der gerahmten Objektträger. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch unter die Objektivlinse.

Beobachten und drehen Sie die Probe, um die gewünschte Region des Pflanzengewebes zu identifizieren. Wählen Sie als Nächstes die fluoreszierendste Ebene in der Z-Achse aus. Passen Sie die Verstärkung, den Offset und die Laserleistung an, um die optimale Signalverteilung über den gesamten Graustufenbereich für jeden Kanal zu erreichen.

Und schließlich können Sie hochwertige konfokale Bilder aufnehmen. BLISS bietet drei Farblokalisierungskarten von Lignin in pflanzlichen Zellwänden, zielt ausschließlich auf das Lignin ab, das während des metabolischen Einbaus in novo produziert wird, und unterscheidet es vom bereits vorhandenen Lignin in der Probe. Sie hebt die aktiven Verholzungsstellen in verschiedenen Geweben eines Organs, innerhalb verschiedener Zelltypen eines Gewebes oder innerhalb verschiedener Wandschichten oder Substrukturen einer Zelle hervor.

Die Alkin-markierten G- und Azid-markierten H-Reporter-Inkorporationsprofile vom Kambium bis zum Mark innerhalb des flachssekundären Xylems deuten darauf hin, dass die maximale Verholzung in Fasertracheiden während der Entwicklung schnell erreicht wird, während Rassezellen Lignin auch in viel späteren Stadien ihres Lebens aufnehmen. Die Variation des chemischen Reporterverhältnisses zeigt, dass die Ligninzusammensetzung in sekundären Xylemgeweben direkt von der monolignalen Verfügbarkeit innerhalb der Zellwände abhängt. Anstatt auf die Peroxidase- oder Laccase-Spezifität während der Ligninpolymerisation.

Der Einbau chemischer Reporter ist bei einigen, aber nicht allen Bastfasern auf die Zellecken und die mittlere Lamellen-Primärzellwand beschränkt. In Flachswurzeln sind die chemischen Reporter in die Wände von endodermalen Zellen eingebaut, wo das Casparianband fehlt. Zur besseren Visualisierung der Gewebearchitektur können auch 3D-Z-Stack-Rekonstruktionen generiert werden.

Im Anschluss an diese Visualisierung kann auch eine umfassende Datenaufbereitung durchgeführt werden. Trotz aller getroffenen Vorsichtsmaßnahmen ist es möglich, durch relativen Vergleich, das Ablesen einer Probe zwischen verschiedenen Proben, konstante Ergebnisse zu erhalten. Dies kann zusätzlich zur Lokalisierung des aktiven Führens in verschiedenen Bereichen erfolgen.

Diese Methode ist ein wunderbares Werkzeug für Pflanzenbiologen wie mich, die die Zellwand untersuchen. Sobald es gemeistert ist, kann es in ein paar Stunden erledigt werden. Es ist sehr empfindlich und kann auf eine ganze Reihe verschiedener experimenteller In-vitro-In-vivo-Modellsysteme angewendet werden.

Die Anwendung der chemischen Reporterstrategie auf Lignin ebnet dem chemischen Biologen den Weg, die Verholzungsdynamik zu erforschen und herauszufinden, was diesen Polymerisationsprozess steuert, der in vielerlei Hinsicht noch Neuland darstellt.