Visualisierung von Leukozyten Rollen und Haftung bei Angiotensin II-infundiert Mäusen: Techniken und Fallstricke

Das übergeordnete Ziel dieser intravitalen Epifluoreszenz-Videomikroskopie (IVM-Protokoll) von Blutgefäßen ist die Visualisierung und Quantifizierung des Rollens und der Adhäsion von Leukozyten in korrodierten Arterien bei Angiotensin-II-induzierter Hypertonie bei Mäusen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Pathologie der vaskulären Dysfunktion und der arteriellen Hypertonie zu beantworten, wie z.B. den Mechanismus der Interaktion zwischen Leukozyten und insbesondere den Lysosomen und positiven Zellen sowie die Funktion der Gefäße. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die in vivo Wechselwirkungen zwischen zirkulierenden Blutzellen und dem vaskulären Verständnis sehen können.

Bereiten Sie eine männliche Maus für die Operation nach sieben Tagen Angiotensin zwei Behandlung mit einer osmatischen Pumpe gemäß dem Text protol vor. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um sie während des Eingriffs zu schützen. Legen Sie das anästhesierte Tier in dorsaler Liege auf eine 39 Grad Celsius heiße chirurgische Platte und führen Sie eine rektale Sonde ein, um die Temperatur zu halten.

Verteilen Sie die Haarentfernungscreme mit einem Wattestäbchen und reiben Sie sie in den Nacken, bis die Haare ausfallen. Verwenden Sie dann nach weiteren 2 Minuten einen Spatel, um die Haare und die Creme zu entfernen. Desinfizieren Sie dann die Haut mit einem alkoholischen Hautantiseptikum.

Nehmen Sie anschließend unter einem Stereomikroskop einen 1 bis 1,5 cm langen Schnitt in die Haut des Halses vor, 1 cm von der Luftröhre entfernt. Machen Sie dann 2 senkrechte Schnitte an beiden Enden des ersten Schnitts. Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe direkt unter der Haut und entfernen Sie das Hautstück, das die linke Halsvene und die Luftröhre bedeckt.

Verwenden Sie anschließend zwei gebogene Pinzetten, um die sublingualen und submaxillären korrodierten Drüsen vorsichtig von der interessierenden Zone zu isolieren. Achten Sie darauf, die Drüsen nicht zu durchtrennen oder zu beschädigen, und positionieren Sie sie so, dass sie den besten Zugang zur Halsvene und den Corridds ermöglichen. Um die Halsvene zu isolieren, führen Sie dann eine dünne Pinzette zwischen das Gefäß und das umgebende Gewebe ein und öffnen und schließen Sie das Instrument langsam, um die Vene sanft vom Gewebe zu befreien.

Sobald die Halsvene vollständig sauber ist, positionieren Sie die Pinzette unter dem Gefäß und legen Sie zwei 10 cm lange 7-0-Nähte darunter. Binden Sie zwei Knoten, um die Naht proximal zum Kopf zu schließen, und bereiten Sie mit der zweiten Naht einen Knoten vor, aber schließen Sie ihn nicht. Halten Sie nun mit einer Pinzette in einer Hand den Katheter, der mit 37 Grad Celsius steriler Kochsalzlösung gefüllt ist, und verwenden Sie dann mit der anderen Hand eine Schere oder eine gebogene 26-Gauge-Nadel, um einen kleinen Schnitt in das Gefäß zu machen.

Führen Sie den Katheter in die Halsvene ein und schließen Sie den Knoten zweimal. Schließen Sie dann die Naht proximal zum Kopf über dem Katheter, um eine vollständige Ruhigstellung zu gewährleisten. Um die korrodierten Arterien zu isolieren und vorzubereiten, verwenden Sie eine dünne, gekrümmte Pinzette, um den Bereich zu präparieren, der die Luftröhre bedeckt.

Sobald die korrodierten Teile vom umgebenden Gewebe befreit sind, entfernen Sie den Vegas-Nerv aus dem Gefäß, ohne ihn zu durchtrennen, indem Sie die dünne Pinzette bei Bedarf langsam schließen und öffnen, um den Nerv sanft zu mobilisieren. Sobald beide Arterien vollständig sauber sind, positionieren Sie die Pinzette unter der ersten korrodierten Arterie und legen Sie einen kleinen, schwarzen, 3 mm x 2,5 cm großen Kunststoffgefäßhalter unter das Gefäß, während Sie darauf achten, das Gefäß nicht zu überdehnen. Sobald der Gefäßhalter angebracht ist, stellen Sie sicher, dass Blutfluss vorhanden ist.

Um eine Dehnung des Gefäßes zu vermeiden, sollte sich die Hand des Bedieners so wenig wie möglich bewegen, mit einer einzigen Bewegung der ersten Pinzette, um die korrodierte Arterie zu isolieren, und mit Hilfe der zweiten Pinzette, um ein Loch unter das Gefäß zu bohren. Wenn der Gefäßhalter richtig positioniert ist, legen Sie die zweite Arterie über das Gerät. Wenn die Maus nicht direkt unter das Mikroskop gelegt wird, legen Sie die Drüsen wieder über die Luftröhre und tragen Sie 37 Grad Celsius sterile Kochsalzlösung auf, um ein Austrocknen der Zone zu vermeiden.

Bereiten Sie in einer 1-ml-Spritze eine 1-4-Verdünnung in steriler Kochsalzlösung von einer aufgetauten Stammlösung von Acridinorange von 2 mg pro ml vor. Schützen Sie die Spritze vor Licht. Um Messungen durchzuführen, positionieren Sie die Maus unter einem Hochgeschwindigkeits-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einem Langstreckenkondensor und einem 10-fach-Wasserimmersionsobjektiv mit einem Monochromater, einem Strahlteiler und einer CCD-Kamera.

Nehmen Sie Bilder in Echtzeit auf, indem Sie das Objektiv in der Mitte der korrodierten Arterie an der Endotheloberfläche fokussieren. Injizieren Sie langsam 50 ml Acridinorange. Stellen Sie dann die Software so ein, dass sie 100 Bilder mit einer Belichtungszeit von 120 Millisekunden pro Bild aufnimmt.

Nehmen Sie für jedes Video vier Videos pro korrodierter Arterie an verschiedenen Stellen der Arterie auf. Wenn das Fluoreszenzsignal abnimmt, injizieren Sie weitere 50 ml Acridinono. Um verschiedene Bedingungen zu testen, injizieren Sie das Acridinorange direkt in die laterale Schwanzvene, wenn kein Jugularkatheter eingeführt wurde, und führen Sie die gleiche Bildaufnahme durch.

Zeichnen Sie als Kontrolle Blütenflussmessungen von nicht injizierten lys-Mcre-positiven, IRG-positiven Mäusen auf. Quantifizieren Sie die Roll- und Adhärenzzellen in einer 200 Mikrometer x 250 Mikrometer großen Rechteckansicht, die für jedes Video in der Mitte des Gefäßes platziert ist und mit einer Geschwindigkeit von 10 Bildern pro Sekunde angezeigt wird. Zählen Sie die rollenden und Adhärenzzellen.

Adhärenzzellen sind definiert als Zellen, die sich innerhalb des 10-Sekunden-Videos nicht bewegen oder vom Endothel lösen. Um die Quantifizierung zu vereinfachen, entfernen Sie den Kanal mit der roten Fluoreszenz und verwenden Sie nur die grüne Fluoreszenz, um rollende und anhaftende Zellen zu zählen. In dieser Studie wurden die korrodierten Mäuse von Lys-mCre-positiven, IRG-positiven Mäusen, die mit Angiotensin 2 infundiert wurden, mittels IVM beobachtet.

Wie hier zu Studienbeginn zu sehen ist, führte das Vorhandensein eines Jugularkatheters zur Adhäsion von Lys-M-positiven fluoreszierenden Zellen. Nach der Injektion von Acridinorange wurden auch die Endothelzellen fluoreszierend. Die Reduzierung des Hintergrunds zur Begrenzung der endothelialen Fluoreszenz ergab dann, dass alle kernhaltigen adhäsierenden Zellen lys-M-positiv waren.

In diesem Experiment wurden nach einer Woche Angiotensin-2-Infusion Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in korrodierten Arterien von Lys-M Cre-positiven IRG-positiven Mäusen abgebildet und mittels IVM mit oder ohne Acridinorange-Injektion, über einen Jugularkatheter oder durch die Schwanzvene sichtbar gemacht. Ohne Katheter oder Injektion nahm das Rollen von Lys-M-positiven Zellen nach der Angiotensin-2-Infusion im Vergleich zu unbehandelten Mäusen signifikant zu. Und auch die Adhäsion wurde erhöht.

Die Injektion von Acridinorange mit einem Jugularkatheter erhöhte die Adhäsion und das Rollen bei mit Angiotensin 2 behandelten Mäusen im Vergleich zu Mäusen ohne Katheter in größerem Maße. Wie in diesen Panels zu sehen ist, führt die Injektion von Acridinorange in die Schwanzvene zu einer ähnlichen Adhäsion und einem ähnlichen Rollen im Vergleich zu den Mäusen, die keine Injektion von Acridinorange erhielten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in dreißig Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Gewebe, das die Gefäße umgibt, nicht zu beschädigen. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern im kardiovaskulären und hämostatischen Bereich den Weg, um Leukozyten und Thrombozytenadhäsion an der Gefäßwand in vivo zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Auswirkungen von Farbstoffinjektionen und Operationen bei der IVM begrenzen können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen äußerst gefährlich sein kann und der Hautkontakt mit dem Farbstoff mit dem richtigen Material, wie z. B. Handschuhen, vermieden werden muss.