Name: Visualisierung von Leukozyten Rollen und Haftung bei Angiotensin II-infundiert Mäusen: Techniken und Fallstricke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Erfahren Sie, wie intravitalen Videomikroskopie Leukozyten-Rollen und Haftung in korrodierten Arterien von Angiotensin II-behandelten Mäusen visualisiert. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung immunologischer Prozesse bei Hypertonie.

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Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF-01EO1003 und BMBF 01EO1503) unterstützt.

Auf männliche Mäuse Alter 8 bis 12 Wochen alt unter der Zustimmung der Ethikkommission für Tierversuche aus Rheinland-Pfalz (Genehmigung Nr. 23 177-07/G12-1-002 und 23 177-07/G15-1-051) wurden Experimente durchgeführt.
1. Maus Anästhesie und OP-Vorbereitung
<ol>
	<li>Überprüfen Sie vor der Operation die gute Gesundheit und Kondition der Tiere. Überwachen Sie vor der Operation Tiere einmal pro Tag für 2-3 Tage auf ihren allgemeinen Zustand (aussehen, Haltung, spontanes Verhalten) sowie Körpergewicht, Ernährung und Wasserverbrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie den master-Mix für Anästhesie mit Midazolam (5 mg/kg Körpergewicht), Medetomidine (0,5 mg/kg Körpergewicht) und Fentanyl (0,05 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal (i.p.) 200 µL/30 g-Maus in 1 mL Spritze mit einer 26 G-Nadel zu injizieren.</li>
	<li>Osmotischen Pumpe Implantation und tierische Vorbereitung für IVM Experimente sind in einem Betrieb Feld mit 39 ° C Erwärmung Plattform durchgeführt. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge in einer Desinfektion Wanne und desinfizieren Sie die Erwärmung Plattform.</li>
	<li>Im Verlauf der Verfahren schützen Sie der tierischen Augen mit Augensalbe. Entfernen Sie das Fell mit Rasierer vor der osmotischen Pumpe Implantation. Verwenden Sie eine Haarentfernung Creme und Wattestäbchen zur Isolierung der Halsschlagadern und Vena Katheter Implantation in IVM Experimente. Die Tierhaut mit zwei Haut Desinfektionsmittel desinfizieren: ein Antiseptikum und Desinfektionsmittel mit Povidon-Jod und einer Haut antiseptisch mit Octenidin in Alkohol-basierte Lösung.</li>
	<li>Bereiten Sie den master-Mix zu antagonisieren Anästhesie ("antisedan Mix") mit Atipamezol (0,05 mg/kg Körpergewicht) und Flumazenil (0,01 mg/Kgbody Gewicht) und 200 µL/Maus in 1 mL Spritze mit einer Nadel 26 G subkutan zu bereiten (s.c.) gespritzt.</li>
</ol>
(2) osmotischen Pumpe Vorbereitung und Implantation
Hinweis: Die subkutane AngII Infusion mittels osmotische Pumpen wurde im Detail von Lu Et Al. beschrieben 17
<ol>
	<li>Bereiten Sie die AngII durch Neuaufbau des lyophilisierten Pulvers mit steriler Kochsalzlösung und passen Sie die Konzentration mit dem Tier Gewicht und die Fördermenge der Pumpe. Halten Sie die rekonstituierte AngII in Kunststoffrohren (verwenden Sie nicht Glasröhren).</li>
	<li>Füllen Sie die Pumpen mit AngII Lösung, 1 mg/(kg·d) für 7 Tage zu liefern. Halten Sie nach der Vorbereitung die Pumpen in steriler Kochsalzlösung für 4-6 h mindestens bei 37 ° C.</li>
	<li>Testen Sie die vollständige Anästhesie der Maus nach der Injektion des Anästhesie-Mix mit hinteren Fuß Reflexe und lege ihn auf den warmen Operationsfeld. Induktion der Anästhesie dauert 10-15 Minuten und funktioniert besser, wenn Tiere in einer dunklen Umgebung platziert werden.</li>
	<li>Rasieren Sie den unteren Rücken die Maus und desinfizieren Sie es mit einer alkoholischen Haut antiseptisch.</li>
	<li>Machen Sie einen 1 cm Schnitt senkrecht zur Wirbelsäule mit einer Schere. Eine Tasche für die Pumpe mit einem engen Gefäßklemme erstellen und fügen Sie die Pumpe (Moderator zuerst fließen). Die Tasche muss Freizügigkeit der Pumpe ohne Druck auf die Wunde zu ermöglichen.</li>
	<li>Schließen Sie die Wunde mit Fäden und nicht-Clips, um Entzündung zu begrenzen; dann desinfizieren Sie mit Haut antiseptisch.</li>
	<li>Antagonisieren die Narkose durch s.c. Injektion von 200 µL des antisedan-Mix und die Maus in seinen Käfig zurück.</li>
	<li>Postoperative Analgesie mit Buprenorphin durchführen (0,075 mg/kg s.c.) eine Zeit nach der Operation und bei Bedarf je nach dem Verhalten der Tiere.</li>
</ol>
(3) Vena Katheter Implantation und Halsschlagadern Vorbereitung
<ol>
	<li>Nach Injektion der Narkose mischen mit hinteren Essen Reflexe und das narkotisierten Tier in dorsalen Recumbence auf 39 ° C chirurgische Platte mit einer rektale Sonde um die Temperatur zu halten und die Salbe über testen Sie die komplette Anästhesie der Maus die Augen, sie während des Verfahrens zu schützen.</li>
	<li>Entfernen Sie Nackenhaare mit der Enthaarungscreme. Verwenden Sie ein Wattestäbchen zu verbreiten und reiben Sie die Creme für 2 min, bis die Haare beginnen zu fallen. Entfernen Sie nach einer zusätzlichen 2 min die Creme und Haare mit einem Spatel und desinfizieren Sie die Haut mit einer alkoholischen Haut antiseptisch.</li>
	<li>Führen Sie die Operation unter einem Stereomikroskop. Machen Sie einen 1-1,5 cm langen Schnitt in der Haut längs in den Hals, 1 cm neben der Luftröhre. Dann stellen Sie zwei weitere Einschnitte senkrecht zu beiden Extremitäten der ersten Schnitte.</li>
	<li>Vorsichtig entfernen Sie Gewebe direkt auf der Haut zu, und entfernen Sie das Stück Haut der linken Halsschlagader und Luftröhre.</li>
	<li>Sorgfältig isolieren der Ohrspeicheldrüse; sublinguale und Submaxillardrüsen Drüsen aus der Zone von Interesse mit 2 gebogenen Pinzette. Nicht geschnitten oder beschädigen der Drüsen, legen Sie sie um den besten Zugang zu der Halsschlagader und der Halsschlagadern zu ermöglichen.</li>
	<li>Um die Halsschlagader zu isolieren, verwenden Sie dünne Zange und öffnen Sie langsam und schließen Sie, um das Schiff aus dem umgebenden Gewebe sanft frei. Sobald die Vene vollständig sauber ist, positionieren Sie die Zange unter dem Behälter und platzieren Sie zwei 7-0 Nahtmaterial von 10 cm darunter zu.</li>
	<li>Schließen Sie die Naht proximal zu den Kopf mit zwei Knoten. Auf der anderen Naht bereiten ein Knoten aber nicht schließen.</li>
	<li>Den Katheter (0,28 mm Innendurchmesser 0,61 mm Außendurchmesser) gefüllt mit 37 ° C sterile Kochsalzlösung mit der Pinzette mit einer Hand zu halten; während mit der anderen Hand, machen Sie einen kleinen Schnitt in das Gefäß mit einer feinen Schere oder einer gebogenen 26 G-Nadel. Dann legen Sie den Katheter in die Halsschlagader und schließen Sie zwei Mal den Bund fürs Leben zu. Schließen Sie die Naht proximal zu den Kopf über den Katheter zur Sicherstellung der vollständigen Immobilisierung.</li>
	<li>Um zu isolieren und bereiten die Halsschlagadern, sezieren Sie die Fläche von der Luftröhre mit dünnen gebogenen Pinzette.</li>
	<li>Sobald die Halsschlagadern frei vom umgebenden Gewebe sind, entfernen Sie den Nervus Vagus (es sieht aus wie eine weiße Linie an der a. carotis) aus dem Behälter zu (aber schneiden Sie es nicht). Die dünnen Zange kann geschlossen und langsam geöffnet, um sanft den Nerv zu mobilisieren.</li>
	<li>Sobald beide Arterien ganz sauber sind, legen Sie die Zange unter der ersten Halsschlagader und legen Sie ein kleines schwarzes 3 mm breit x 2,5 cm Länge Plastikteil unter dem Behälter. Es ist sehr wichtig, nicht um das Schiff zu übernehmen und zu prüfen, ob der Blutfluss ist vorhanden, sobald der Schiff Halter platziert wird. Legen Sie die zweite Arterie über dem Schiff Inhaber. Wenn die Maus nicht direkt unter dem Mikroskop platziert ist, setzen Sie wieder die Drüsen über die Luftröhre und gelten Sie 37 ° C sterile Kochsalzlösung um zu vermeiden, Trocknen der Zone.</li>
</ol>
4. Bewertung der Rollen und die Einhaltung von Leukozyten / LysM + Zellen mit IVM
<ol>
	<li>Bereiten Sie Acridin orange aus einer 2 mg/mL Stammlösung bei-20 ° C gelagert und verdünnen Sie es 1:4 in steriler Kochsalzlösung (Endkonzentration 0,5 mg/mL) in einer 1 mL Spritze.</li></ol>Die Spritze vor Licht schützen und 200 µL pro Mausklick verwenden.<ol>
		<li>Unterschiedlichen Testbedingungen: (1) Injektion von Acridin orange mit der Vena Katheter; (2) Injektion von Acridin orange direkt in die Rute seitliche Vene (mit dieser Bedingung, die keine Vena Katheter implantiert wurde); (3) die Messung ohne Acridin orange mit Fluoreszenz LysMCre++ IRG Mäuse (hier wieder keine Vena Katheter implantiert wurde).</li>
	</ol>
	
	<li>Sobald der Katheter vorhanden ist und die zwei Halsschlagadern isoliert sind, positionieren Sie den Mauszeiger unter die Lupe genommen. Messungen mit einem High-Speed-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einem Langstrecken Kondensator und eine 10 X (NA 0,3) Wasser eintauchen Ziel mit einem Monochromator, einen Strahlteiler und ein Ladegerät – Coupled-Kamera. Durchführen Sie Bildaufnahme und Analyse mit Echtzeit-imaging-System.</li>
	<li>Das Mikroskopobjektiv in der Mitte der Halsschlagader an der Endothel-Oberfläche zu konzentrieren. Injizieren Sie langsam 50 µL Acridin orange (0,5 mg/mL) (berücksichtigt das Totvolumen des Katheters für die erste Injektion). Stellen Sie die Software, 100 Bilder mit einer Belichtungszeit von 120 Millisekunden pro Bild aufzuzeichnen.</li>
	<li>Vier Videos pro Halsschlagader (links und rechts) an verschiedenen Standorten auf die Arterie für jedes Video zu machen. Wenn das Fluoreszenzsignal schwächer wird, injizieren Sie ein weiteres 50 µL Acridin orange.</li>
	<li>Nach der Aufnahme des Videos einschläfern Sie das Tier durch zervikale Dislokation.</li>
	<li>Legen Sie die Videogeschwindigkeit mit 10 Bildern pro Sekunde und quantifizieren Sie die Roll- und adhärenten Zellen in einer 200 µm X 250-µm-Rechteck-Ansicht in der Mitte des Schiffes für jedes Video. Roll- und adhärente Zellen zu zählen; adhärente Zellen werden als Zellen definiert, die nicht verschieben oder trennen Sie das Endothel innerhalb von 10 s-Video. Zur Vereinfachung der Quantifizierung entfernen Sie den Kanal mit der rote Fluoreszenz und verwenden Sie nur die grüne Fluoreszenz, um Roll- und anhaftende Zellen zu zählen.</li>
	<li>Machen Sie für Experimente mit Acridin orange eine manuelle Schwelle der Fluoreszenz, um Hintergrund von Endothelzellen gemacht zu entfernen.</li>

<ol><li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality%3A+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li>
<li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosaic+theory+revisited%3A+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Hypertens%22%5BJournal%5D)">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li>
<li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li>
<li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+vascular+remodeling%2C+endothelial+dysfunction%2C+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice%3A+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li>
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<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+the+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: the role of the macrophage.</a> Expert Rev Mol Med. 13, e23(2011).</li>
<li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposal+for+standardized+preanalytical+and+analytical+conditions+for+measuring+thrombin+generation+in+hemophilia%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

LysM+ Monozyten zeigten sich bereits in die Entwicklung von Bluthochdruck5verwickelt werden. Hier zeigen wir, dass Immunzellen LysM+ Rollen und an der endotheliale Schicht als Reaktion auf AngII Infusion haften. Diese Erkenntnis wurde gewonnen, mit LysMCre++ IRG Mäuse aus unseren früheren Studien erforschen die Rolle von Immunzellen in Hypertonie in Vivo durch die Visualisierung Leukozyten mit Einspritzung von Acridin orange6,10. Diskriminierung von Zelltypen, die Einhaltung des Endothels war somit nicht möglich.
Die IVM ist ein sehr nützliches Tool für vaskuläre Untersuchungen und in-Vivo Beobachtungen der Zellen direkt in das Gefäßsystem, aber die Wirkung der Injektion Farbstoffe mit Hilfe von chirurgisch Katheter im Zusammenhang mit entzündlichen Hypertonie bleibt unbekannt. Zur Bewertung der möglichen Wirkung der Katheter und Acridin orange Injektion wir nutzten LysMCre++ IRG Mäuse. AngII Infusion stieg die Zahl der Rollen LysM+ Zellen des Endothels. Einführen eines Katheters in die Halsschlagader verstärkt die Wirkung und rollende und anhaftende Leukozyten erkannt wurden, in AngII infundiert Mäuse mit einem Katheter verglichen mit Mäusen ohne Katheter Implantate instrumentiert. Dies weist darauf hin, dass Implantation einer Halsschlagader Katheter Ursachen eine systemische Entzündungsreaktion im Rahmen der Wundheilung, überlagert mit der Immunreaktion in Hypertonie18gesehen. Darüber hinaus aufgrund der Nähe der Halsschlagader an der Halsschlagader eine zusätzliche Immunaktivierung möglicherweise aufgetreten durch Einwirkung auf die Halsschlagader. Da dieser Effekt nicht anwesend war, als Injektionen direkt in die Vene Heck vorgenommen wurden, ist davon auszugehen, dass der Effekt zurückzuführen war, der Farbstoff nicht aber an die Prozedur des Einsetzens des Katheters. Die Bedeutung von transgenen Reporter Mäusen mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine in Vivo Prozesse während der Experimente nicht stören, die wir hier demonstriert. Darüber hinaus möglicherweise Schweif Vene Injektion von Fluoreszenz Tracer eine mögliche Alternative zur Vena Katheter Injektionen.
Ein wichtiger Schritt des Verfahrens ist die AngII Infusion. Tail kann Manschette des Blutdrucks beurteilt werden um die Wirksamkeit der AngII Lieferung kontrollieren von der Pumpe. Nach 2−3 Tagen der Infusion sollte den Blutdruck erhöhen. Um Entzündung zu begrenzen, die LysM+ Zellen Aktivierung beeinflussen könnten, sollten die Schließung des Schnittes, wo die Pumpe implantiert wird, mit Nähten statt Clips erfolgen. Eine Einschränkung über Heck Vene Injektion zu beachten: um die beste mögliche Datenerfassung machen, 4 Videos stammen in der Regel für jede carotis. Sinkt das Fluoreszenzsignal 50 µL Acridin Orange gespritzt, aber mit Schweif Injektion ist es schwieriger, mehrere Injektionen zu machen und um die Halsschlagadern unter dem Mikroskopobjektiv stabil zu halten. Die Dauer der Anwesenheit eines Katheters in die Halsschlagader könnte auch die Aktivierung von Immunzellen modulieren, da es die Gerinnung Aktivierung im Platelet-Rich Plasma vorbereitet 4 h nach der Katheter Implantation19betroffen sind. Dieser Aspekt der Katheter Implantation bedarf weiterer Untersuchung.
Schließlich, auch wenn wir die Auswirkungen der Vena Katheter Implantation auf LysM+ -Zell-Aktivierung nach AngII Infusion schätzen, können wir voll die Rolle der Vorbereitung, Haut entfernen und Karotis Isolation auf eine mögliche LysM+ -Zelle nicht einschätzen Aktivierung. Wir schlussfolgern, dass die Nutzung von Fluoreszenz Reporter Mäusen wie LysMCre++ IRG Maus wird empfohlen, die Störung des Schiffes Integrität während der tierischen Vorbereitung für die in-Vivo Bildgebung zu vermeiden.

Arterielle Hypertonie erhöht das Risiko von Herz-Kreislauf-Krankheit und Tod und fördert die Entwicklung von Arteriosklerose, koronare Herzkrankheit und arteriellen oder venösen Thromboembolisms1. Die Entwicklung von Bluthochdruck hängt das Zusammenspiel von ökologischen, genetische, endokrine und hämodynamischen Faktoren. Derzeit sind Immunität und damit verbundene Entzündungen geschätzt, um eine wichtige Rolle in der Ätiologie der Hypertonie2.
Unter den Immunzellen fanden T-Lymphozyten sowie Monozyten und Makrophagen in AngII-induzierten vaskulären Entzündung und Bluthochdruck, teilweise im Zusammenhang mit ihrer Fähigkeit, reaktive Sauerstoff Spezies3auslösen ursächlich beteiligt sein. Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor mangelhaft Mäuse zeigten verringerte Reaktion auf AngII zu Blutdruckanstieg und vaskulären Entzündung4. In einer früheren Arbeit konnten wir zeigen, dass LysM + Monozyten vaskuläre Dysfunktion und Entzündungen im AngII-induzierte Hypertonie5fahren. Vor kurzem haben wir einen neuartigen Weg in die, den Gerinnung Faktor XI mit Thrombozyten und der Gefäßwand kooperiert induzieren Thrombin-abhängige vaskulären Entzündung6beschrieben. Das aktuelle Wissen über die Rolle des Immunsystems bei Hypertonie wurde vor kurzem zusammengefasst und bewertet von Rodriguez-Iturbe Et Al. 7
Da die Beteiligung von Immunzellen in die Entwicklung von Bluthochdruck deutlich wurde, wurde Modelle und Techniken, um die Interaktion zwischen dem Schiff und Immunzellen zu studieren notwendig. Epifluorescence IVM der Blutgefäße ist ein nützliches Tool um in Vivo Interaktionen zwischen den zirkulierenden Blutzellen und das Endothel8,9,10zu beobachten. Mit dieser Technik kann die Injektion von Farbstoffen (z. B. Acridin Orange) mit DNA verschuppen kernhaltigen Zellen (zirkulierende sowie aus dem Endothel) visualisieren. Isolierte Blutplättchen gebeizt ex Vivo mit Rhodamin 6 G oder Dichlorofluoresceins (DCF) Platelet-Rich Thrombus im arteriellen oder venösen Verletzungen Modelle visualisieren injiziert werden kann.
In der Regel ein Halsschlagader Katheter ist Tracer injiziert oder markierte Thrombozyten. Änderung des Endothels und anschließende Aktivierung der Gerinnung Kaskade sind beide bekannt, auf Monocyte Aktivierung auswirken. Endotheliale Schädigung führt sofort zur Thrombozyten Aktivierung über subendothelial Matrix Moleküle, die Gewebe mit anschließenden Monocyte Attraktion und Aktivierung11zu versiegeln. Im Gegenteil, eine intakte Endothel bekanntermaßen gerinnungshemmenden Eigenschaften (z. B. über Gewebe Factor Pathway Inhibitor oder Thrombomodulin)12 und direkte hemmende Wirkungen auf die Monocyte, z. B.durch die Sekretion von extrazelluläre Vesikel mit Micro-RNAs13. Monozyten sind dafür bekannt, produzieren einen Gewebe-Faktor, der extrinsischen Aktivator der Koagulation Kaskade und ausdrückliche Protease-aktivierten Rezeptoren (PARs), die durch Thrombin aktiviert werden können und an Monocyte Aktivierung14,15 . Daher Aktivierung der Blutplättchen oder der Koagulation Kaskade durch Gefäßverletzung möglicherweise unerwartete Auswirkungen auf Monocyte Aktivierung und stören das beobachtete Phänomen. Mit Hilfe der IRG transgenen LysM Cre transgene Mäuse, eine Doppel-fluoreszierende Cre Reporter Maus (LysMCre+IRG+) schlagen wir im Detail studieren die Wirkung der Injektionen mit einem Katheter und Alternative Methoden auf LysM+ Myelomonocytic Zellen in einem Mausmodell der arteriellen Hypertonie16.

<table><tbody><tr><td>Midazolam</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td>Anästhesiemischung</td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Pfizer Deutschland GmbH</td><td></td><td>Anästhesiemischung</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen-Cilag GmbH</td><td></td><td>Anästhesiemischung</td></tr><tr><td>Alzane</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Antisedan Mischung</td></tr><tr><td>Flumazenil</td><td>Hikma pharma</td><td></td><td>Antisedan Mischung</td></tr><tr><td>Braunol</td><td>B Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octeniderm</td><td>Sch&uuml; lke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmotische Pumpen</td><td>Alzet</td><td>1007D</td><td>Osmotische Pumpe Implantation</td></tr><tr><td>Angiotensin II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Osmotische Pumpe</td></tr><tr><td>Implantation 7-0 Prolene</td><td>Naht Ethicon</td><td></td><td>Osmotische Pumpe Implantation</td></tr><tr><td>Acridin orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katheter</td><td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td><td></td><td>Innendurchmesser 0,28 mm; Außendurchmesser, 0,61 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI Fluoreszenzmikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Strahlteiler</td><td>Photometrie</td><td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10X</td><td>Wasserimmersionsobjektiv mit Monochromator</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Bilderfassung und -analyse Software</td><td>Olympus</td><td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Jax 008705</td><td>B6. Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td></tr><tr><td>Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Jax 004781</td><td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td></tr></tbody></table>

visualisierung von leukozyten rollen und haftung bei angiotensin ii-infundiert mäusen: techniken und fallstricke

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluoreszenz intravitalen Videomikroskopie (IVM) der Blutgefäße ist eine etablierte Methode der Aktivierung von Immunzellen und ihre Fähigkeit zur Rolle zu beurteilen und haften an der endotheliale Schicht. Visualisierung der zirkulierenden Zellen durch Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen oder Fluorophor-gekoppelten Antikörper wird häufig verwendet. Alternativ können fluoreszierende Reporter Mäuse verwendet werden. Wechselwirkungen von Leukozyten, in bestimmten Lysozym M+ (LysM+) Monozyten mit der Gefäßwand spielen entscheidende Rolle bei der Förderung vaskuläre Dysfunktion und arterielle Hypertonie. Wir präsentieren hier die Technik zu visualisieren und zu quantifizieren, Leukozyten Rollen und Haftung in Halsschlagadern in Angiotensin II (AngII)-induzierte Hypertonie bei Mäusen durch IVM.
Die Implantation eines Katheters die Gefäßwand schädigt und führt zu veränderten Blutkörperchen Reaktionen. Wir gegenüber verschiedenen Injektionstechniken und Verwaltung Routen zu visualisieren, Leukozyten in einem LysMCre++ IRG Maus mit weit verbreiteten Ausdruck rot fluoreszierenden Proteins und bedingten Ausdruck des grün fluoreszierenden Proteins in LysM + Zellen. LysM+ -Zell-Aktivierung zu studieren, verwendeten wir AngII infundiert Mäuse in welche Rollen und Adhäsion von Leukozyten des Endothels erhöht wird. Wir entweder Acridin orange mit einer Halsschlagader Katheter injiziert oder direkt wenn das Heck Vene und verglich die Höhe der Rollen und die Einhaltung von Zellen. Wir fanden, dass Vena Katheter Implantation schlechthin die Zahl der Rollen stieg und anhaftende LysM+ Zellen in Sham-LysMCre+IRG+ -Mäuse im Vergleich zu Kontrollen Infusion. Diese Aktivierung wurde bei Mäusen AngII infundiert ergänzt. Interessanterweise Injektion Acridin orange direkt durch den Schweif Vene nicht zu einer Erhöhung LysM+ Zelladhäsion oder Rollen in Sham-infundiert Mäuse. Damit beweisen wir die Bedeutung der transgenen Reporter Mäuse mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine in Vivo Prozesse während der Experimente nicht stören. Darüber hinaus möglicherweise Schweif Vene Injektion von Fluoreszenz Tracer eine mögliche Alternative zur Vena Katheter Injektionen.

Halsschlagadern von LysMCre++ IRG wurden Mäuse mit AngII infundiert mit IVM beobachtet. Acridin Orange wurde mit einem Vena Katheter injiziert. Wir wollten den Anteil der LysM+ Zellen in Kontakt mit der Gefäßwand im Vergleich zu allen kernhaltigen zirkulierenden Zellen (die auch mit dem Schiff interagieren konnte, da Diskriminierung des Zelltyps Interaktion mit dem Schiff eine offene blieb Schau Frage von unserer bisherigen Arbeit). Bei Studienbeginn führt die Anwesenheit eines Vena Katheters Adhäsion LysM+ Zellen (Abb. 2A, D). Nach der Injektion Acridin orange, dieselben Zellen fluoreszierende, aber auch die Endothelzellen waren fluoreszierende (Abb. 2 b, E). Nach der Reduzierung des Hintergrunds an Endothelzellen zu begrenzen im Zusammenhang mit Fluoreszenz, zeigen die Daten, dass alle kernhaltigen anhaftende Zellen sind LysM+ (Abbildung 2, F); Diese Ergebnisse gelten nach AngII Infusion bestätigt unsere bisherige Ergebnisse und zeigen, dass die LysMCre++ IRG ein gutes Modell, die Wirkung von AngII auf LysM+ -Zell-Aktivierung zu beobachten ist.
Wir bewerten die Rolle der Verwaltung Routen von Acridin orange auf LysM+ -Zell-Aktivierung nach AngII Infusion in LysMCre++IRG. Nach einer Woche AngII Infusion, Leukozyten-Endothel-Interaktion in Halsschlagadern von LysMCre++ IRG Mäuse waren abgebildet und visualisiert durch IVM mit oder ohne Injektion von Acridin orange über einen Vena Katheter oder durch die Rute Vene. Ohne Katheter oder Injektion wurde Rollen LysM+ -Zellen deutlich erhöht, nach AngII Infusion im Vergleich zu unbehandelten Mäusen und Adhäsion eine Zunahme (Abbildung 3 zeigten). Injektion von Acridin orange mit einem Vena Katheter erhöhte Adhäsion und rollt in AngII behandelten Mäuse in einem größeren Ausmaß im Vergleich zu Mäusen ohne einen Katheter (Abbildung 3). Injektion von Acridin orange in der Rute Ader führt zu ähnlichen Adhäsion und Rollen im Vergleich zu den Mäusen, die Injektion von Acridin orange (Abbildung 3) nicht erhalten haben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
Abbildung 1. Regelung für Angiotensin-II-Infusion und Bewertung von LysM+ Zellen Rollen und Haftung bei Mäusen. LysMCre++ IRG Mäuse waren 7 Tage mit AngII infundiert und Einhaltung sowie Rollen LysM+ Zellen über die Halsschlagadern wurden quantifiziert, mit oder ohne Injektion von Acridin orange durch eine Vena Katheter oder Schweif Vene Injektion. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
Abbildung 2. Bewertung von+ LysM Zelladhäsion und Rollen in Halsschlagadern von LysMCre++ IRG Mäuse. Haftung des LysM+ Zellen in LysMCre++ IRG Mäuse vor (A, D) und nach (B, E) Acridin Injektion über einen Vena Katheter. Rote und grüne Fluoreszenz verzeichneten, LysM+ Zellen (in grün) und glatten Muskelzellen (in rot) waren zu sehen. Nach Injektion von Acridin Orange Endothelzellen sind auch sichtbar in grün aber entfernen Hintergrundfluoreszenz ermöglicht, dass nur im Umlauf kernhaltigen Zelle Visualisierung (C, F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Bewertung der Verwaltung Routen von Fluoreszenzfarbstoffen in Angiotensin II infundiert LysMCre++ IRG Mäuse. Quantifizierung der Rollen (A) und (B) LysM+ die Einhaltung Zellen im Schein betrieben oder AngII infundiert Tiere und mit oder ohne Injektion von Acridin Orange mit einem Vena Katheter oder durch Rute Vene Injektion. Repräsentative Bilder die unterschiedlichen Bedingungen (C). Ergebnisse sind Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. 2-Way ANOVA durchgeführt wurde und Bonferronis post Hoc Test, n = 3-12/Gruppen; p &lt; 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von transgenen Reporter Mäuse und verschiedenen Verwaltung Routen von Fluoreszenzfarbstoffen in Angiotensin-II-induzierte Hypertonie mit intravitalen Videomikroskopie der Blutgefäße, um die Aktivierung von Immunzellen zu bewerten und ihre Fähigkeit, Rollen und halten uns an das Endothel.

Visualisierung von Leukozyten Rollen und Haftung bei Angiotensin II-infundiert Mäusen: Techniken und Fallstricke

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Das übergeordnete Ziel dieser intravitalen Epifluoreszenz-Videomikroskopie (IVM-Protokoll) von Blutgefäßen ist die Visualisierung und Quantifizierung des Rollens und der Adhäsion von Leukozyten in korrodierten Arterien bei Angiotensin-II-induzierter Hypertonie bei Mäusen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Pathologie der vaskulären Dysfunktion und der arteriellen Hypertonie zu beantworten, wie z.B. den Mechanismus der Interaktion zwischen Leukozyten und insbesondere den Lysosomen und positiven Zellen sowie die Funktion der Gefäße. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die in vivo Wechselwirkungen zwischen zirkulierenden Blutzellen und dem vaskulären Verständnis sehen können.Bereiten Sie eine männliche Maus für die Operation nach sieben Tagen Angiotensin zwei Behandlung mit einer osmatischen Pumpe gemäß dem Text protol vor. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um sie während des Eingriffs zu schützen. Legen Sie das anästhesierte Tier in dorsaler Liege auf eine 39 Grad Celsius heiße chirurgische Platte und führen Sie eine rektale Sonde ein, um die Temperatur zu halten.Verteilen Sie die Haarentfernungscreme mit einem Wattestäbchen und reiben Sie sie in den Nacken, bis die Haare ausfallen. Verwenden Sie dann nach weiteren 2 Minuten einen Spatel, um die Haare und die Creme zu entfernen. Desinfizieren Sie dann die Haut mit einem alkoholischen Hautantiseptikum.Nehmen Sie anschließend unter einem Stereomikroskop einen 1 bis 1,5 cm langen Schnitt in die Haut des Halses vor, 1 cm von der Luftröhre entfernt. Machen Sie dann 2 senkrechte Schnitte an beiden Enden des ersten Schnitts. Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe direkt unter der Haut und entfernen Sie das Hautstück, das die linke Halsvene und die Luftröhre bedeckt.Verwenden Sie anschließend zwei gebogene Pinzetten, um die sublingualen und submaxillären korrodierten Drüsen vorsichtig von der interessierenden Zone zu isolieren. Achten Sie darauf, die Drüsen nicht zu durchtrennen oder zu beschädigen, und positionieren Sie sie so, dass sie den besten Zugang zur Halsvene und den Corridds ermöglichen. Um die Halsvene zu isolieren, führen Sie dann eine dünne Pinzette zwischen das Gefäß und das umgebende Gewebe ein und öffnen und schließen Sie das Instrument langsam, um die Vene sanft vom Gewebe zu befreien.Sobald die Halsvene vollständig sauber ist, positionieren Sie die Pinzette unter dem Gefäß und legen Sie zwei 10 cm lange 7-0-Nähte darunter. Binden Sie zwei Knoten, um die Naht proximal zum Kopf zu schließen, und bereiten Sie mit der zweiten Naht einen Knoten vor, aber schließen Sie ihn nicht. Halten Sie nun mit einer Pinzette in einer Hand den Katheter, der mit 37 Grad Celsius steriler Kochsalzlösung gefüllt ist, und verwenden Sie dann mit der anderen Hand eine Schere oder eine gebogene 26-Gauge-Nadel, um einen kleinen Schnitt in das Gefäß zu machen.Führen Sie den Katheter in die Halsvene ein und schließen Sie den Knoten zweimal. Schließen Sie dann die Naht proximal zum Kopf über dem Katheter, um eine vollständige Ruhigstellung zu gewährleisten. Um die korrodierten Arterien zu isolieren und vorzubereiten, verwenden Sie eine dünne, gekrümmte Pinzette, um den Bereich zu präparieren, der die Luftröhre bedeckt.Sobald die korrodierten Teile vom umgebenden Gewebe befreit sind, entfernen Sie den Vegas-Nerv aus dem Gefäß, ohne ihn zu durchtrennen, indem Sie die dünne Pinzette bei Bedarf langsam schließen und öffnen, um den Nerv sanft zu mobilisieren. Sobald beide Arterien vollständig sauber sind, positionieren Sie die Pinzette unter der ersten korrodierten Arterie und legen Sie einen kleinen, schwarzen, 3 mm x 2,5 cm großen Kunststoffgefäßhalter unter das Gefäß, während Sie darauf achten, das Gefäß nicht zu überdehnen. Sobald der Gefäßhalter angebracht ist, stellen Sie sicher, dass Blutfluss vorhanden ist.Um eine Dehnung des Gefäßes zu vermeiden, sollte sich die Hand des Bedieners so wenig wie möglich bewegen, mit einer einzigen Bewegung der ersten Pinzette, um die korrodierte Arterie zu isolieren, und mit Hilfe der zweiten Pinzette, um ein Loch unter das Gefäß zu bohren. Wenn der Gefäßhalter richtig positioniert ist, legen Sie die zweite Arterie über das Gerät. Wenn die Maus nicht direkt unter das Mikroskop gelegt wird, legen Sie die Drüsen wieder über die Luftröhre und tragen Sie 37 Grad Celsius sterile Kochsalzlösung auf, um ein Austrocknen der Zone zu vermeiden.Bereiten Sie in einer 1-ml-Spritze eine 1-4-Verdünnung in steriler Kochsalzlösung von einer aufgetauten Stammlösung von Acridinorange von 2 mg pro ml vor. Schützen Sie die Spritze vor Licht. Um Messungen durchzuführen, positionieren Sie die Maus unter einem Hochgeschwindigkeits-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einem Langstreckenkondensor und einem 10-fach-Wasserimmersionsobjektiv mit einem Monochromater, einem Strahlteiler und einer CCD-Kamera.Nehmen Sie Bilder in Echtzeit auf, indem Sie das Objektiv in der Mitte der korrodierten Arterie an der Endotheloberfläche fokussieren. Injizieren Sie langsam 50 ml Acridinorange. Stellen Sie dann die Software so ein, dass sie 100 Bilder mit einer Belichtungszeit von 120 Millisekunden pro Bild aufnimmt.Nehmen Sie für jedes Video vier Videos pro korrodierter Arterie an verschiedenen Stellen der Arterie auf. Wenn das Fluoreszenzsignal abnimmt, injizieren Sie weitere 50 ml Acridinono. Um verschiedene Bedingungen zu testen, injizieren Sie das Acridinorange direkt in die laterale Schwanzvene, wenn kein Jugularkatheter eingeführt wurde, und führen Sie die gleiche Bildaufnahme durch.Zeichnen Sie als Kontrolle Blütenflussmessungen von nicht injizierten lys-Mcre-positiven, IRG-positiven Mäusen auf. Quantifizieren Sie die Roll- und Adhärenzzellen in einer 200 Mikrometer x 250 Mikrometer großen Rechteckansicht, die für jedes Video in der Mitte des Gefäßes platziert ist und mit einer Geschwindigkeit von 10 Bildern pro Sekunde angezeigt wird. Zählen Sie die rollenden und Adhärenzzellen.Adhärenzzellen sind definiert als Zellen, die sich innerhalb des 10-Sekunden-Videos nicht bewegen oder vom Endothel lösen. Um die Quantifizierung zu vereinfachen, entfernen Sie den Kanal mit der roten Fluoreszenz und verwenden Sie nur die grüne Fluoreszenz, um rollende und anhaftende Zellen zu zählen. In dieser Studie wurden die korrodierten Mäuse von Lys-mCre-positiven, IRG-positiven Mäusen, die mit Angiotensin 2 infundiert wurden, mittels IVM beobachtet.Wie hier zu Studienbeginn zu sehen ist, führte das Vorhandensein eines Jugularkatheters zur Adhäsion von Lys-M-positiven fluoreszierenden Zellen. Nach der Injektion von Acridinorange wurden auch die Endothelzellen fluoreszierend. Die Reduzierung des Hintergrunds zur Begrenzung der endothelialen Fluoreszenz ergab dann, dass alle kernhaltigen adhäsierenden Zellen lys-M-positiv waren.In diesem Experiment wurden nach einer Woche Angiotensin-2-Infusion Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in korrodierten Arterien von Lys-M Cre-positiven IRG-positiven Mäusen abgebildet und mittels IVM mit oder ohne Acridinorange-Injektion, über einen Jugularkatheter oder durch die Schwanzvene sichtbar gemacht. Ohne Katheter oder Injektion nahm das Rollen von Lys-M-positiven Zellen nach der Angiotensin-2-Infusion im Vergleich zu unbehandelten Mäusen signifikant zu. Und auch die Adhäsion wurde erhöht.Die Injektion von Acridinorange mit einem Jugularkatheter erhöhte die Adhäsion und das Rollen bei mit Angiotensin 2 behandelten Mäusen im Vergleich zu Mäusen ohne Katheter in größerem Maße. Wie in diesen Panels zu sehen ist, führt die Injektion von Acridinorange in die Schwanzvene zu einer ähnlichen Adhäsion und einem ähnlichen Rollen im Vergleich zu den Mäusen, die keine Injektion von Acridinorange erhielten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in dreißig Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Gewebe, das die Gefäße umgibt, nicht zu beschädigen. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern im kardiovaskulären und hämostatischen Bereich den Weg, um Leukozyten und Thrombozytenadhäsion an der Gefäßwand in vivo zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Auswirkungen von Farbstoffinjektionen und Operationen bei der IVM begrenzen können.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen äußerst gefährlich sein kann und der Hautkontakt mit dem Farbstoff mit dem richtigen Material, wie z. B. Handschuhen, vermieden werden muss.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

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