Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel für funktionelle Studien

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, von Neutrophilen abgeleitete Mikropartikel für funktionelle Studien zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Rolle von Exozellvesikeln oder Mikropartikeln bei der Zell-Zell-Kommunikation bei verschiedenen physiologischen Prozessen wie Krebs, Entzündungen und Wundheilung zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie relativ schnell und kostengünstig ist und dass sie die Bewertung der p'henotypischen Zusammensetzung von Mikropartikeln oder Mikrovesikeln in funktionellen Vermögenswerten ermöglicht.

Das Verfahren wird von Ariel Finkielsztein, einem Postdoktoranden in meinem Labor, und Joseph Lee, einem Studenten in meinem Labor, demonstriert. Für die Dichtegradiententrennung von polymorphnukleären oder PMN-Zellen des murinen Knochenmarks schichten Sie zunächst langsam drei Milliliter frisch zubereiteter Lösung bei Raumtemperatur von 1,077 Gramm über drei Milliliter frisch zubereiteter Lösung mit einer Dichte von 1,119 Gramm pro Milliliter bei Raumtemperatur in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen pro Knochenmarkzellprobe. Als nächstes wird ein Milliliter frisch isolierter Knochenmarkzellen in eiskaltem PBS auf die oberste Dichtegradientenschicht jedes Röhrchens aufgebracht und die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation getrennt.

Am Ende der Trennung werden die mononukleären Zellschichten an den Grenzflächen zwischen dem PBS und den oberen Dichtegradientenschichten in jedem Röhrchen vorsichtig entfernt, ohne die PMN-Banden zu stören. Sammeln Sie die PMN-Schichten mit einer Transferpipette in einem neuen 15-Milliliter-Röhrchen pro Probe und erhöhen Sie das endgültige Volumen in jedem Röhrchen auf 15 Milliliter mit 0,1 Mikrometer gefiltertem PBS. Pelletieren Sie die PMNs durch Zentrifugation, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation in zwei Millilitern frisch filtriertem PBS pro Röhrchen.

Suspendieren Sie dann die Pellets zum Zählen wieder in einem Milliliter frisch gefiltertem PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen nach dem Zählen erneut und suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern 0,1 Mikrometer gefiltertem HBSS, ergänzt mit dem interessierenden Stimulans pro 10 Millionen Zellen. 20 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Am Ende der Stimulation werden die Zellen durch Zentrifugation entnommen und die zellfreien Überstände in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 1,5 Milliter pro Probe überführt. Zentrifugieren Sie die Überstände, um Zelltrümmer zu entfernen, und übertragen Sie die gereinigten Überstände in neue Ultrazentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie dann die Überstände und lagern Sie die pelletierten Mikropartikel in paraffinversiegelten Ultrazentrifugenröhrchen bei 80 Grad Celsius bis zur weiteren experimentellen Analyse. Um die Mikropartikel in den Dickdarm der Maus zu verabreichen, wird zunächst eine vollnarkostisierte Maus in Bauchlage gebracht und mit einer Biopsiezange und einem Endoskop, das mit einer hochauflösenden Kamera ausgestattet ist, drei bis fünf oberflächliche Wunden entlang der dorsalen Seite des Dickdarms erzeugt.

Bringen Sie die Maus zurück in ihren Käfig und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt hat. Verwenden Sie 24 Stunden später das Endoskop, um Bilder der zugefügten Wunden unter Narkose aufzunehmen. Verwenden Sie dann ein auf Koloskopie basierendes Mikroinjektionssystem, um ein experimentelles Volumen von PMN-Mikropartikeln, die in 100 Mikrolitern HBSS resuspendiert sind, direkt in jede Wundstelle zu verabreichen.

Die Größenheterogenität der PMN-Mikropartikel kann durch den Vergleich der Mikropartikel mit Durchflusszytometrie-Kügelchen bekannter Größe beurteilt werden. Wie gezeigt wurde, kann die Expression von Proteinen, die von Interesse sind, durch die Mikropartikel auch mittels Durchflusszytometrie untersucht werden. In diesem Experiment wurde die Expression wichtiger inflammatorischer und entzündungshemmender Moleküle durch aktivatorstimulierte PMN-abgeleitete Mikropartikel mittels Immunoblot untersucht.

Die Auswirkungen von PMN-Mikropartikeln auf die Heilung von Epithelzellen können durch Bildaufnahme von kratzverwundeten Epithelmonoschichten zu vorher festgelegten Zeitpunkten in vitro sowie nach Biopsiezangenverletzungen in Vivio überwacht werden. Einmal gemeistert, können PMN-abgeleitete Mikropartikel innerhalb von vier Stunden isoliert werden, wenn die Technik richtig angewendet wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass das PMN vor der Stimulation auf Eis gehalten werden sollte, um eine vorzeitige Aktivierung und den Verlust von Mikropartikeln zu verhindern.

Nach diesem Verfahren können Durchflusszytometrie, Immunblotting und Echtzeit-Proliferationsreaktionstechniken verwendet werden, um den Mikropartikelgehalt unter verschiedenen stimulierenden Bedingungen oder aus verschiedenen Ursprungszellen zu bestimmen. Diese Technik ist nützlich, um die Rolle des Beitrags von Mikropartikeln bei der Regulation von Immunantworten, der Barrierefunktion, der Gewebeverletzung und -reparatur sowie bei der Krebsprogression zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man murine Mikropartikel isoliert und markiert und die Mikropartikel in einem funktionellen Wundheilungsmittel in vivo verwendet.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden Tieren gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen das Anlegen der persönlichen Schutzausrüstung und das Absolvieren der entsprechenden Sicherheitsschulungen immer vorsehen, bevor Sie diesen Vorgang durchführen.