In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

In vivo Einzelmolekül-Tracking an der präsynaptischen motorischen Nervenendigung von Drosophila. Diese Technik beschreibt, wie einzelne Proteine in vivo an den motorischen Nervenendigungen von Drosophila-Larven im dritten Stadium verfolgt und abgebildet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, einzelne Proteine mit hohen Auflösungen abzubilden, zu verfolgen und zu lokalisieren, ähnlich wie sie in In-vitro-Systemen beobachtet werden.

Design von transgenen Drosophila. Das synaptische Protein von Interesse ist mit einem photokonvertierbaren Fluorophor markiert, und dies wird in Drosophila melanogaster exprimiert. Sektion der Drosophila-Larve im dritten Stadium.

Setze eine wandernde Larve des dritten Stadiums auf eine zylindrische oder halbzylindrisch geformte Sylgard-Basis. Geben Sie 40 Mikroliter Schneider's Insect Medium auf die Larve. Stechen Sie unter einem Präpariermikroskop eine winzige Nadel durch den Kopf und eine weitere durch den Schwanz der Larve, um sie ruhig zu stellen.

Um den Zugang zu erleichtern, verwenden Sie eine winzige Stecknadel, um einen schmalen Schnitt an der Mittellinie der dorsalen Seite des Bauchbereichs der Larve zu machen. Von diesem Schnittpunkt aus schneiden Sie mit einer Federschere entlang der Körperwand in vorder-hinterer Richtung. Entnehmen Sie der Larve mit Hilfe einer feinen Pinzette und einer Federschere innere Organe.

Waschen Sie die präparierte Larve mit Schneider's Insect Medium. Stecken Sie je zwei winzige Stecknadeln durch die beiden Körperwandklappen, um eine sechseckige präparierte Larvenpräparation herzustellen. Löse das Larvengehirn mit einer Federschere vom ventralen Nervenstrang.

Schiebe mit einer gebogenen Pinzette die winzigen Stifte in den Sylgard-Boden. Einzelpartikel-Tracking photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie. Drehen Sie die Sylgard-Basis der Larve auf eine Kulturschale mit Glasboden, die mit zwei Millilitern zimmerwarmem Schneider's Insect Medium gefüllt ist.

Tragen Sie Wasser auf das 63x Wasserimmersionsobjektiv eines ELYRA PS.1 Mikroskops auf und stellen Sie die Schale dann auf den Tisch. Schalten Sie das Durchlicht ein und lokalisieren Sie mit dem Okular die Larve auf der Sylgard-Basis mit Hilfe des 10-fach-Luftobjektivs. Wechseln Sie zum 63-fachen Wasserimmersionsobjektiv und identifizieren Sie Muskel sechs mithilfe der Hellfeldbeleuchtung.

Wählen Sie mit der ZEN Black Acquisition Software die Konfiguration Totalreflexionsfluoreszenz, TIRF, aus. Schalten Sie den 488-Nanometer-Laser um, um eMos2 in Grün zu visualisieren. Lokalisieren Sie die neuromuskulären Verbindungen, die wie Kügelchen auf einer Schnur aussehen, und nehmen Sie ein TIRF-Bild mit niedriger Auflösung auf, schalten Sie gleichzeitig den 405-Nanometer-Laser und den 561-Nanometer-Laser ein, um die Photokonvertierung und die Abbildung roter eMos2-Spezies zu ermöglichen.

Verwendung einer sehr geringen Laserleistung für den 405-Nanometer-Laser, um mäßig konstante stochastische Photokonversionen zu ermöglichen. Hier wird ein 405-Nanometer-Laser mit 0,09 % betrieben, während ein 561-Nanometer-Laser mit 50 % betrieben wird. Schieben Sie in den TIRF-Winkeloptionen in der Software den TIRF-kritischen Winkel leicht heraus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 30 Millisekunden ein.

Erfassen Sie eine Zeitreihe von Bildern der neuromuskulären Verbindung. Hier wurde ein Film mit 15.000 Bildern aufgenommen. Speichern Sie den Film als Datei im czi-Format.

Datenanalyse. Analysieren Sie die aufgenommenen Filme mit einer geeigneten Einzelmolekular-Tracking-Analysesoftware. Lokalisieren Sie die x- und y-Koordinaten jeder fluoreszierenden Proteinlokalisierung durch die Gaußsche Anpassung der Intensitätspunkt-Spreizungsfunktion.

Um die Trajektorie jeder Lokalisierung nachzuzeichnen, legen Sie einen Schwellenwert von mindestens acht kontinuierlichen unterschiedlichen Frame-Darstellungen für jede Lokalisierung und einer maximalen Beweglichkeit von drei Pixeln zwischen den einzelnen Frames fest. Erhalten Sie das Trajektorienbild, die mittlere quadratische Verschiebung sowie den Diffusionskoeffizienten aller verfolgten Lokalisierungen. Repräsentative Ergebnisse.

Die mittlere quadratische Verschiebung einzelner Trajektorien von Syntaxin-1A-eMos2 aus mehreren neuromuskulären Verbindungen in drei verschiedenen Larven wurde aufgetragen, als Mittelwert plus minus Standardfehler des Mittelwerts. Die Fläche unter der mittleren quadratischen Verschiebungskurve wurde ebenfalls dargestellt. Der Diffusionskoeffizient von Syntaxin-1A-mEos2 wurde in ähnlicher Weise aus mehreren neuromuskulären Verbindungen ermittelt und als Histogramm der relativen Häufigkeitsverteilung aufgetragen.

Die Schwelle des Diffusionskoeffizienten zeigte zwei Populationen von Syntaxin-1A, eine mobile und eine immobile Population. Es wurde das Verhältnis der mobilen zu immobilen Populationen von Syntaxin-1A-mEos2 berechnet. Schlussfolgerung. Dieses Video soll ein Verständnis dafür vermitteln, wie das Einzelprotein-Tracking an der neuromuskulären Verbindung von Drosophila-Larven durchgeführt werden kann.

Die Technik bietet Forschern auf dem Gebiet der neuronalen Kommunikation die Möglichkeit, die Mobilität und Organisation einzelner Proteine mit hoher Auflösung in vivo zu visualisieren und zu beobachten.