Name: In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Erfahren Sie Einzelmolekül-Tracking in vivo an präsynaptischen motorischen Nervterminalen von Drosophila melanogaster-Larven mittels PALM. Diese Methode ermöglicht die hochauflösende Visualisierung synaptischer Proteindynamik.

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Wir danken Jean-Baptiste Sibarita und Daniel Choquet (IINS, CNRS/Universität von Bordeaux) für die freundliche Unterstützung mit der Einzelmolekül-Analyse. Wir bedanken uns besonders bei Nick Valmas und Jessica Mcgaw (QBI, University of Queensland) für ihre Hilfe mit dem Video Aufnahme, Voice-over sowie Grafikdesign herauszufinden. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Australian Research Council (AR) Discovery Project (DP170100125, F.A.M.), Australian Research Council (LIEF Grant LE0882864, F.A.M.), Zukunft Fellowship (FT100100725, B.V.S.), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078, F.A.M.) und NHMRC Projekt gewähren (APP1103923, B.V.S.). F.A.M. ist NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).

1. Aufbau von transgenen Drosophila mit dem Ausdruck mEos2 Tagged Proteine
<ol><li>Wählen Sie das Protein, die mit dem mEos2 Protein markiert werden. Um die bildgebenden Erfolgsquote zu erhöhen, wählen Sie Proteine mit einer transmembrane Domäne in der neuronalen Plasmamembran14 (z.B.Syntaxin-1A), Proteine auf synaptischen Vesikel oder Autophagosom26,27 (z. B. Synaptobrevin-2), oder cytosolischen Proteine mit enge Interaktion mit neuronalen Plasmamembran Proteine (z.B.Munc18-1).</li>
	<li>Konstruieren Sie transgene Codierung mEos2-tagged Proteins (Abbildung 1). Entwerfen Sie die Forward- und reverse Primer für die Protein- und mEos2. Hinweis: Die kodierende Sequenz des mEos2 kann aus der pmEos2-N1-Plasmid verstärkt werden soll, an den C-Terminus des Proteins des Interesses zu verschmelzen. Klonen kann zum Beispiel durch in-Vivo -Rekombination in Saccharomyces Cerevisiae mit der pFL44S durchgeführt werden-AttB-MCS-w + Vektor14,28, abwechselnd andere Klonen Methoden genutzt werden, wie z. B. Gibson Montage Protokoll29.<ol>
<li>Den Vektor mit BamHI und XbaI linearisieren und Co ura3 - Hefezellen zusammen mit der PCR-Fragmente, Kodierung, mEos2 und das Protein des Interesses verwandeln. Injizieren Sie Drosophila Embryos mit dem Konstrukt einer transgenen Fliegenschnur30zu generieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hinten Sie die transgenen fliegen Kulturen auf Hefe und Melasse Standardmedium oder einigen anderen geeigneten Ersatz in Kunststoff-Flaschen enthalten. Um gesund und ziemlich große synaptischen Boutons31zu gewährleisten, vermeiden Überbelegung fliegen in das Fläschchen und flip fliegen neue Fläschchen nach jedem Tag der Eiablage; Dadurch werden die dritte Instar Larven sind gut genährt und durch die Zeit, die Sie beginnen die Wanderung auf dem Medium, angemessene Größe erreichen. Heben Sie die transgene fliegen bei Raumtemperatur (25 ° C). Hinweis: Größere synaptischen Boutons tendenziell größere Mengen von Proteinen während der Bildgebung visualisiert ergeben.</li>
</ol>2. Präparation der dritte Instar Larve
<ol><li>Machen Sie eine zylindrische oder erhielt geformte Polydimethylsiloxan (PDMS) Basis ≤20 mm im Durchmesser und ≤20 mm in der Höhe mit einem geeigneten Silikon Elastomer Kit (Abbildung 2A). Mischen Sie Silikon-Elastomer mit einer Silikon Härten Agent im Verhältnis 10:1.<ol>
<li>Rühren Sie die Mischung gründlich für 5 min. Gießen Sie die Mischung in eine Form mit den Dimsensions oben aufgeführt. Lassen Sie es im Ofen bei 100 ° C für 45 Minuten Härten. Die PDMS-Basis dient als Grundlage, auf der Dissektion durchzuführen. Stellen Sie sicher, die PDMS-Basis in den Brunnen der Glasboden-Kulturschale passt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie eine wandernde dritte Instar Larve aus der Durchstechflasche Wand. Verwenden Sie ein optische Stereo-Mikroskop bei 4,5 Vergrößerung, um die Larve auf die PDMS zylindrischen Basis mit der dorsalen Seite oben platziert zu visualisieren.</li>
	<li>Gebogen und abgewinkelt Pinzette Minutien Pins auf dem Kopf über die Mund-Haken, zwischen den beiden vorderen Atemlöcher erweitern und an der Rute über den Anus, zwischen den beiden hinteren Luftlöcher bleiben. 40 µL des Schneiders Insekt Medium bei Raumtemperatur auf die immobilisierten Larve hinzufügen. Hinweis: Hemolyph-ähnlichen Lösungen (HL3 oder HL6) können auch anstelle Schneiders Lösung32,33verwendet werden.</li>
	<li>Zugriff durch die dorsale Seite der Bauchwand Körper der Larve durch Verwendung von Minutien Pin zum in der Mittellinie der Wand einzuschneiden.</li>
	<li>Verwendung-Feder-Schere zu schneiden der Körperwand öffnen aus dem Schnitt-Punkt. Schneiden Sie entlang der Mittellinie in der anterior-posterioren Richtung34.</li>
	<li>Feine Pinzette verwenden und Schere um die Larve Ausweiden Frühling: die inneren Organe einschließlich der Speicheldrüsen, die Luftröhre und den Darm entfernen. Waschen Sie die Larve zweimal mit Schneiders Insekt Medium.</li>
	<li>Halten Sie mit einer feinen Pinzette die beiden Klappen der Körperwand, sanft dehnen sie aus und kleben Sie zwei Minutien Stifte auf jeder Seite. Dies sollte eine sechseckige Vorbereitung (Abbildung 2A) produzieren.</li>
	<li>Lösen Sie das Gehirn aus den ventralen Nervenstrang mit Feder Schere um die Möglichkeit der Muskelbewegung während der Bildgebung zu verringern; Dies dient auch die Vorbereitung flach gegen die bildgebenden Gericht zu halten. Die gebogenen Pinzette, um alle sechs Minutien Stifte in PDMS-Basis zu schieben. Hinweis: Nur ein kleiner Teil der Stifte sollten in der Bauchwand verankert sein.</li>
	<li>Zu bestätigen, dass die Larve die Dissektion Prozedur überlebt hat, leicht stoßen die ventrale Nerv Schnur, sollte dies eine peristaltische Kontraktion der Larve Bauchwand entlocken.</li>
</ol>3. leicht Schrägbeleuchtung Single-Particle Tracking Mikroskopie
<ol><li>Invertieren der seziert Larve-PDMS-Basis auf einem Glasboden Kulturschale. Füllen Sie die bildgebende Schale mit 2 mL Raumtemperatur Schneider Insekt Medium (Abb. 2 b).</li>
	<li>Suchen Sie motorischen Neuronen in der zweiten und dritten Segmente mit Synapsen auf Bauchmuskeln 6 und 735 mit dem 63 X / 1,2 NA eintauchen in Wasser Ziel auf eine fluoreszierende Totalreflexion Fluoreszenzmikroskop (TIRF).</li>
	<li>Verwenden Sie die Okulare des Mikroskops, um die sezierte Larve zu finden; identifizieren Sie Muskel 6 durch Verwendung von Hellfeld-Beleuchtung.</li>
	<li>Die Mikroskop-Datenerfassungs-Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), in TIRF Konfiguration; Schieben Sie den Kollimator Kamerawinkel um 1° um die Eindringtiefe zu erhöhen, sonst verschieben TIRF Grenzwinkel Schrägbeleuchtung zu erreichen.</li>
	<li>Schalten Sie den 488 nm Laser mEos2 in grün zu visualisieren. Verwenden Sie eine geringe Laserleistung (weniger als 5 % von 22,8 mW) um zu vermeiden, bleichen die grüne Fluoreszenz. Suchen Sie die neuromuskulären Verbindungen (die aussehen wie Perlen an einer Schnur) und erwerben Sie ein Bild mit niedriger Auflösung TIRF zu.</li>
	<li>Schalten Sie gleichzeitig den 405 nm-Laser (Photoconverts mEos2 von Grün zu rot Arten) und der 561 nm Laser (Bild Photoconverted rot-mEos2), stochastisch einzelne mEos2 fluoreszierende Proteine zu lokalisieren. Hinweis: 405 nm Laser Schwachstrom wird empfohlen (0,005 bis 0,9 % von 4,78 mW) denn dies eine relativ konstante Ladungszustand Rate während der Film-Akquisition ermöglicht. Zwischen 50 und 75 % der 561 nm Laser (20,1 mW), da dies ausreicht, Fluoreszenz von den roten mEos2 Arten zu erwerben, ohne negative Auswirkungen auf die Morphologie des Muskelgewebes rund um die neuromuskuläre Synapse.</li>
	<li>Erwerben Sie für jede Kette neuromuskulären eine Zeit, die Serie von mindestens 15.000 Frames bei 33 Hz. as.czi Speicherformat zusammengesetzt, um die zugehörigen Metadaten möglich zu Referenzzwecken zu bewahren.</li>
	<li>Verwenden Sie ImageJ ".tiff" Dateien ".czi"-Film-Dateien konvertieren.</li>
	<li>Analysieren Sie die erworbenen Filme mit geeigneten Einzelmolekül-tracking-Analyse-Software,11,14,36 wie TrackMate auf Fidschi/ImageJ37 (siehe Tabelle der Materialien). Sucht den "X" und "y" Koordinaten von jeder Lokalisation durch die Gaußsche Passform des vorliegenden Intensität verbreiten Funktion (PSF). Hinweis: Troubleshooting: Wenn grün fluoreszieren nicht beachtet oder zu dunkel an der neuromuskulären Synapse bei Kontakt mit der 488 nm Laser ist, kurz einschalten der Photoconverting und imaging-Laser (405 nm und 561 nm), da dies hilft, um mehr rot zu produzieren Arten von mEos2. Wechseln Sie zurück zu den 488 nm-Laser und nehmen Sie eine TIRF Bild.</li>
</ol>4. Einzelmolekül-Lokalisierung in festen Larven
<ol><li>Nanocluster Proteingröße über PALM zu messen, ersetzen Sie den Schneider Insekt Medium nach Dissektion mit einem Fixativ - 4 % Paraformaldehyd in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) verdünnt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Larve für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie die Dissektion Stifte und legen Sie die feste Larve in einen 1,7 mL klare Snap-Lock Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Sezieren Sie und zu beheben Sie, wie viele andere Larven nach Bedarf, dann dreimal mit PBS waschen.</li>
	<li>Ersetzen Sie die PBS mit Blockpuffer (eine Lösung von PBS, 0,1 % Triton x-100 und 3 % normalem Ziegenserum).</li>
	<li>Die Larven mit PBS dreimal waschen, dann mit den erforderlichen primären Antikörper (in der Block-Pufferlösung verdünnt) inkubieren.</li>
	<li>Inkubation über Nacht bei 4 oC.</li>
	<li>Die Larven dreimal mit PBS waschen, dann mit dem notwendigen sekundären Antikörper (in der Block-Pufferlösung verdünnt) inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Larven dreimal mit PBS, legen Sie die Larve wieder auf die PDMS Basis und Bild wie oben beschrieben für die Einzelmolekül-Verfolgung.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt Einzelmolekül-Tracking der mEos2-markierten Proteine an der neuromuskulären Synapse von Drosophila dritte Instar Larve. Zur Vermeidung von Überexpression von transgenen Proteinen trieb Syntaxin-1A-mEos2 Ausdruck von endogenen Syntaxin-1A-Promoter. Studien der synaptischen Protein Mobilität wurden meist beschränkt auf in-vitro- Untersuchungen der kultivierten Zellen und kortikalen Neuronen9,11,12,13. Ob diese Proteine ähnliche Mobilität Signaturen in ein lebendes Tier weisen ist weitgehend unbekannt. Um Single-Protein Mobilität in Vivozu visualisieren, Einschränkungen z. B. optische Transparenz, Zugänglichkeit und Durchdringung Tiefe müssen überwunden werden. Sezieren die Larven Vorbereitung und Visualisierung der neuromuskulären Kreuzungen auf der Oberfläche des Muskels eingebettet, vermeiden wir die Frage der optischen Transparenz und Zugänglichkeit. Versuche, Bild Einzelmolekül-Mobilität in normalen TIRF Konfiguration als erfolglos erwiesen. Jedoch ermöglicht die Verwendung von leicht schräg Beleuchtung für erhöhte Erregung Laser tiefe Eindringen. Darüber hinaus half die Minutien Pins verwendet, um die Larven zu immobilisieren, um mögliche nachteilige Auswirkungen der Narkose Nutzung auf Protein Mobilität zu vermeiden. Es ist möglich, höhere Vergrößerung Ziele, wie die 100 x Öl Immersion Ziele zu verwenden, um einzelne Moleküle in Vivozu visualisieren. Höhere Vergrößerung erhöht jedoch das Auftreten der Abbaustrecken unscharf. Darüber hinaus haben wir eine geringere Intensität (~ 30 %) verwendet. 561 nm Laser erfolgreich Bild einzelne Moleküle bei motorischen Nervenenden. Zusätzliche Tests muss gegebenenfalls geringere Laserleistung zu verwenden.
Dieses Protokoll eignet sich für die Mobilität der synaptischen Proteine in der Nähe der neuronalen Plasmamembran zu visualisieren. Mit diesem Ansatz, die Mobilität des SNARE - Syntaxin-1A und das Autophagosome Protein Atg18a gebunden - Proteins wurden erfolgreich abgebildeten in Vivo14,26. Die Mobilität der Proteine auf Motoneuron können Axone auch sein untersucht27. Untersuchung der Mobilität der Proteine im Gehirn oder ventralen Nervenstrang erweisen sich jedoch schwierig, aufgrund der hohen Hintergrundsignal produziert durch das darunter liegende Gewebe zu beurteilen; Darüber hinaus visualisieren Protein Mobilität auf die gleichen Gehirnstruktur benötigen Eindringmittel tagging die Gehirnstruktur (um die Nachvollziehbarkeit zu gewährleisten), und Verwendung von Dual-Kamera-Bildgebung erforderlich sein würde.
Aktuelle Methoden zur Verfügung, für die Super-Auflösung Mikroskopie in Drosophila beschränken sich meist auf bildgebende Embryonen, anstatt mehr dritte Instar Larve38,39entwickelt. Das Hauptproblem mit diesen Protokollen ist, dass sie eine geringe Anzahl von Trajektorien im Bereich abgebildet ergeben, und daher eingehende Analyse der Mobilität Staaten22,40 verhindern. Unsere in Vivo Einzelmolekül tracking-Protokoll hat die Fähigkeit, eine hohe Anzahl von Trajektorien zu generieren, und daher in anderen Tiermodellen wie Caenorhabiditis Elegans und Zebrafisch verwendet werden konnten. In der Tat, erzeugt jede NMJ-Kette ~ 2.400 Trajektorien eignet sich somit für die Analyse der verschiedenen mobilen Zustände und Übergänge zwischen diesen Staaten14,27. Darüber hinaus setzen viele in Vivo Einzelmolekül bildgebende Strategien auf die Verwendung von Anästhetika, die Tiere20,22, die physiologische Funktion verändern könnten, unter der die Bildgebung erfolgt, zu immobilisieren. Hier haben wir ein Protokoll "Anästhesie-frei", um die Larven, die mit Hilfe der Minutien Pins zu immobilisieren optimiert.
Eine mögliche Verwendung dieses Protokolls möglicherweise für die Mobilität von Proteinen in drei Dimensionen zu visualisieren. Jüngste Fortschritte in der Super-Auflösung Mikroskopie ermöglichen Protein Mobilität visualisiert in Vitro in 'X', 'y' und 'Z' Abmessungen41,42. Unsere aktuelle Methode berücksichtigt nicht die Mobilität der Proteine in der 'Z'-Achse. Noch der motorischen Nervenendigung Drosophila ist eine kugelförmige Struktur und eine wertvolle Zukunft werden Protein Mobilität in ein dreidimensionales Volumen43zu quantifizieren. Bildgebung in der Z-Dimension ist machbar mit einem astigmatischen Objektiv. Alternativ ist die Z-Auflösung in TIRF Modus44,45, auch erhöht. In unseren Experimenten haben wir jedoch leicht schräg Beleuchtung verwendet, um einzelne Moleküle des syntaxin1A-mEos2 ohne die astigmatische Linse zu visualisieren.
Abschließend Verfügbarkeit sowohl einer transgenen Drosophila fliegen Aktie mit dem Ausdruck Proteine markiert mit einem Photoconvertible Protein, ein PDMS Basis zu sezieren die transgenen Larve sowie einem TIRF-Mikroskop verfügt über die Möglichkeit einer Änderung der Winkel der Beleuchtung sind die wichtigsten Werkzeuge, um einzelne Proteine zu visualisieren, wie in diesem Protokoll beschrieben.

Neuronale Kommunikation beruht auf Neurotransmitter-Freisetzung, die durch die regulierte Fusion von Neurotransmitter-haltigen synaptischen Vesikel mit der Plasmamembran1auftritt. Dieser Prozess namens Exozytose2,3,4,5,6 kann ist sehr dynamisch und Up - oder Down-reguliert nach Schwankungen in der Rate der Stimulation7. Die Proteine, die in diesen Prozessen Brownsche Bewegung unterliegen und daher anzeigen nanoskopische Organisation in der Lage eine Reihe von verbindlichen Maßnahmen, die diese physiologischen Funktionen zu untermauern. Plasmamembran Proteine sind sehr dynamisch, so dass seitliche Trapping von Molekülen in Nanocluster auf der Plasmamembran7,8,9,10,11, 12. So hilft untersucht die Mobilität dieser Proteine, ihre Art der Maßnahme8aufzuklären. Synaptischen Proteine wie die löslichen N-Ethylmaleimide sensiblen Faktor Anhang Protein Rezeptoren (SNAREs), z. B. Syntaxin-1A, sind nun bekannt, seitliche schnelle Mobilität aufweisen, sowie seitliche Trapping innerhalb Nanocluster, die als molekulare dienen können Depots und Websites für Vesicle Fusion9,13,14,15.
Die jüngste Entwicklung der Photoconvertible fluoreszierende Proteine, wie z.B. Monomere (m) Eos16,17 und Kaede18, ermöglichte nanoskopischen Auflösung der neuronalen Plasmamembran Proteine durch den Einsatz von Ansätze solcher als Foto-aktivierte Lokalisierung Mikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)14,15,19. Diese Entwicklungen haben Untersuchungen bezüglich der Mobilität und Nanoclustering der biologischen Proteine in lebenden Zellen kultiviert und Neuronen aktiviert. Vor kurzem wurden Studien durchgeführt, (mit ähnlich hohen Auflösungen) die Dynamik und Organisation dieser Membran Proteine in den Neuronen intakt Lebewesen so Mus Musculus, Caenorhabditis Elegans und aufzuklären Drosophila Melanogaster14,20,21,22.
Die Dynamik und Organisation eines Proteins in Vivo zu untersuchen erfordert nicht nur Einsatz von neu entwickelten Super-Resolution imaging-Tools (z. B. PALM, Sturm und Photoconvertible Fluorophore), sondern auch die Fähigkeit, solche Hindernisse zu überwinden als Zugänglichkeit des Proteins und die Eindringtiefe des Lasers imaging. Imaging intrazelluläre Proteine in einem intakten Tier ist von Natur aus herausfordernd wie Proteine auf Strukturen eingebettet tief in lebendes Gewebe des intakten Tieres, z. B. im Hippocampus, einer intakten Maus imaging ist. Daher werden Proteine auf oder nah an der Oberfläche des Gewebes leichter abgebildet. Eine weitere Schwierigkeit mit in-Vivo imaging ist bei der Sicherstellung der Reproduzierbarkeit über Tiere. Da die Anatomie von einer Probe zur anderen unterscheiden könnte, könnte Auswahl einer strukturiertes mit Leichtigkeit der Replikation in verschiedenen intakten Tier Proben auch anspruchsvolle. Die Verwendung von Stereotypen Strukturen, wie z. B. Synapsen, helfen einige dieser Schwierigkeiten zu überwinden.
Jüngste Studien haben Protein Mobilität bei Tieren mit einer optisch transparente Epidermis wie Caenorhabditis Elegans22, abgebildet, während andere Untersuchungen Organisation Protein auf der Oberfläche eines Gewebes/Organs, zum Beispiel abgebildet haben Aktin Bildgebung in kortikalen Neuronen durch den Schädel einer live Maus21. In einigen Fällen haben Anästhetika eingesetzt, um das Tier unbeweglich zu halten; jedoch können bestimmte Anästhetika Proteins des Interesses beeinträchtigen. Alternative Mittel, Tiere während der in-Vivo Bildgebung unbeweglich zu halten sollte daher geprüft werden, um Fehler zu minimieren.
Ein weiterer Vorbehalt zu super-Resolution imaging in Vivo ist, dass die Laser verwendet, um die Proteine des Interesses zu beleuchten das umliegende Gewebe negativ beeinflussen könnten, und sich daher die Anregung Intensität möglichst gering zu halten empfiehlt. Beleuchtung des umliegenden Gewebes durch den Laser neigt auch dazu, das Hintergrundsignal zu erhöhen. Die Verwendung von niedrigen Anregung Intensität verringert den Hintergrund, der Nachteil, es könnte auch zu einem Rückgang der fluoreszierenden Proteins Photon Ertrag führen. Hintergrundabzug während der Analyse könnte verwendet werden, als Alternative Mittel um das Hintergrundsignal vor Bildanalyse zu reduzieren.
Drosophila präsentiert Organismus idealen für in-Vivo imaging, da es etablierte genetische Werkzeuge für die Untersuchung der spezifischen Proteinfunktion bietet. Die vorgelagerten aktivierende Sequenz (FH)-Gal4-System ermöglicht die zeitliche und räumliche Expression von Proteinen und können daher verwendet werden, um Neurotransmission23, verändern so dass Thermo-genetische Stimulation mit Drosophila transiente potenzielle Unterfamilie Rezeptor A1 (dTRPA1)24 oder Opto-genetische Stimulation mit weite rote verschoben CsChrimson25 kombinierbar mit imaging-14. Wir haben viele der Komplikationen des Durchführens in Vivo Einzelmolekül-Bildgebung in dieses System überwunden und nun beschreiben, wie Single-Particle tracking in Drosophila Melanogaster dritte Instar Larven durchgeführt werden kann.

<table><tbody><tr><td>PDMS (Sylgard 184 Silikonelastomer-Kit)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>In-vitro-Kulturschale mit Glasboden</td><td>Scientific</td><td>D29-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>gebogene Pinzette (Typ 5/45)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>0208-5AC-PO</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Stifte (0,1 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma, Life Sciences</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>PS.1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16%)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maxyclear Snaplock-Mikrozentrifugenröhrchen (1,7 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black Erfassungssoftware</td><td>Carl Zeiss, 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Molecular Devices</td><td>7.7.8</td><td>PALM Tracer Plugin</td></tr><tr><td>Fly Stamm</td><td></td><td>w1118; HA-Sx1A-mEos2</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo einzelmolekül-tracking bei drosophila präsynaptischen motorischen nerv terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Eine wachsende Zahl von Höchstauflösung Mikroskopiertechniken tragen dazu bei, die Mechanismen aufzudecken, die die nanoskaligen zellulären Welt regieren. Einzelmolekül-Bildgebung gewinnt an Dynamik bietet außergewöhnlichen Zugang zur Visualisierung einzelner Moleküle in lebenden Zellen. Hier beschreiben wir eine Technik, die wir entwickelt, um Single-Particle Tracking Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie (SptPALM) in Drosophila Larven führen. Synaptische Kommunikation stützt sich auf wichtige präsynaptischen Proteine, die Handeln durch Andocken, Grundieren und fördern die Verschmelzung von Neurotransmitter-haltige Vesikel mit der Plasmamembran. Eine Reihe von Protein-Protein und Protein-Lipid-Interaktionen fest regelt diese Prozesse und die präsynaptischen Proteine weisen daher Änderungen in Mobilität mit jedem von diesen wichtigen Ereignissen verbunden. Untersuchen, wie die Mobilität dieser Proteine mit ihre physiologische Funktion in einer intakten lebendes Tier korreliert ist für das Verständnis ihrer genauen Wirkmechanismus. Extrahieren von Protein Mobilität mit hoher Auflösung in Vivo erfordert die Überwindung der Einschränkungen z. B. optische Transparenz, Zugänglichkeit und Eindringtiefe. Wir beschreiben, wie Photoconvertible fluoreszierende Proteine markiert mit dem präsynaptischen Protein, das Syntaxin-1A kann über leichte Schrägbeleuchtung visualisiert und verfolgt auf dem motorischen Nerv-Terminal oder entlang der Motoneuron Axon des dritten, Drosophila instar Larve.

Mit Hilfe des Protokolls wurden oben aufgeführt, Syntaxin-1A-mEos2 transgenen Drosophilamelanogaster erzeugt (Abbildung 1). Transgene dritte instar Drosophila Larven wurden seziert, auf dem PDMS zylindrischen Sockel (Abbildung 2A-F). Um einzelne Moleküle von Syntaxin-1A zu visualisieren, haben wir auf einem TIRF-Mikroskop mit leicht schräg Laser Beleuchtung14PALM verwendet.
Einzelne Moleküle von Syntaxin-1A wurden an den Klemmen von präsynaptischen motorischen Nerv auf den Muskel 6 der zweite Abdominalsegment verfolgt. Die grünen Fluoreszenz des mEos2 konnte nachgewiesen werden, wie das Bild mit niedriger Auflösung von Syntaxin-1A-mEos2 auf Typ 1 b Boutons bei Erregung mit 488 nm Laser (Abbildung 3A) gezeigt. In den bildgebenden Experimenten, die 405 nm und 561 nm Anregung Laser imaging tiefen waren 133,5 nm und 165,6 nm, beziehungsweise. Das grüne Bild wurde als durchschnittlich 16 Einzelbilder erworben. Diese "grüne" Image wurde zur Erstellung des Interessenbereichs verwendet, um die Analyse der Lokalisierungen in dem Photoconverted Film an den präsynaptischen motorischen Nerv Klemmen allein beschränken.
Die Analyse der erworbenen Photoconverted SptPALM Filme erzeugt eine super gelöst Intensität, Diffusionskoeffizienten, und Flugbahn Karten (Abb. 3A). Syntaxin-1A-mEos2 Mobilität wurde weiter durch Analyse der mittlere quadratische Verschiebung (MSD) der einzelnen Bahnen (Abb. 3 b) quantifiziert. Statistische Vergleiche möglich ist mit der Fläche unter der Kurve MSD (Abb. 3 b). Weitere Analyse der Mobilität ergibt die Diffusion Coefficient Verteilung von Syntaxin-1A-mEos2, und dies kann statistisch ausgewertet werden, durch einen Vergleich des Handys, die unbeweglichen Populationen (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> Abbildung 1 : Generierung von mEos2 getaggt Konstrukte. Die pFL44S-AttB-MCS-w + Vektor ist mit BamHI und XbaI linearisiert. Überlappende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Fragmente Codierung des Proteins von Interesse (POI) und mEos2, bzw. können geklont werden, beispielsweise durch in-Vivo -Rekombination in ura3 - Hefezellen oder Gibson Montage. Beachten Sie, dass wir um das Transgen Syntaxin-1A-mEos2 zu erzeugen, das Konstrukt der endogenen Syntaxin-1A-Promotor und Terminator-Sequenzen flankiert geklont. Das entstehende Konstrukt kann anschließend in Drosophila Embryos erstelle ich eine transgene Fliegenschnur mit dem Ausdruck des Proteins von Interesse (POI) verschmolzen, mEos2 injiziert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> Abbildung 2 : Drosophila Larve Dissektion und Schrägbeleuchtung. (A) Schema zeigt Drosophila Larve Dissektion auf halb-zylindrischen PDMS-Basis durchgeführt. Eine abgerundete Larve fand auf dem PDMS gel durch Verwendung von Minutien Pins. (B-C) Die Larve-PDMS-Prep wurde im Inneren ein Glasboden Kulturschale mit Schneiders Insekt Medium gelegt. TIRF Mikroskop in einer leicht schrägen Beleuchtung-Konfiguration wurde verwendet, um Syntaxin-1A-mEos2 in den motorischen Nerv-Terminals zu visualisieren. (D-F) Eine halb-zylindrischen PDMS-Basis mit seziert Drosophila Larve. Die Larve-PDMS-Vorbereitung wurde in einer bildgebenden Schale mit Schneiders Medium gefüllt, und die Larve auf die Super-Resolution-PALM-Mikroskopie abgebildet war. Maßstabsleiste, 10 mm. (diese Zahl wurde von14geändert). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> Abbildung 3 : In vivo tracking von Syntaxin-1A-mEos2 an der präsynaptischen motorischen Nervenendigung. (A) A Bild mit niedriger Auflösung TIRF von Syntaxin-1A-mEos2 auf einen Typ 1 b motor Nervenendigung. Analyse der Ladungszustand Filme abgebildet 33 Hz erzeugt SptPALM super gelöst Intensität, Diffusionskoeffizienten und Flugbahn Karten. 5.309 einzelnen Bahnen wurden abgebildeten über 16.000 Bilder Film Erwerb. Maßstabsleiste, 3 μm. (B-C) Mittlere quadratische Verschiebung (MSD) von Syntaxin-1A-mEos2 wurde aus 6 verschiedenen motorischen Nerv Klemmen gezeichnet; Fläche unter der MSD-Kurve (AUC) wurde verwendet, um das Niveau der Mobilität zu quantifizieren. Die Diffusion Coefficient Verteilung zeigt mobile und immobile Syntaxin-1A-Populationen, die als Verhältnis von einander quantifiziert werden können; durchschnittlich ~ 2.400 Trajektorien erhielten pro motor Nervenendigung (n = 3 Larven). Daten als mittlere Standardfehler von Mittelwert dargestellt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

In vivo Einzelmolekül-Tracking an der präsynaptischen motorischen Nervenendigung von Drosophila. Diese Technik beschreibt, wie einzelne Proteine in vivo an den motorischen Nervenendigungen von Drosophila-Larven im dritten Stadium verfolgt und abgebildet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, einzelne Proteine mit hohen Auflösungen abzubilden, zu verfolgen und zu lokalisieren, ähnlich wie sie in In-vitro-Systemen beobachtet werden.Design von transgenen Drosophila. Das synaptische Protein von Interesse ist mit einem photokonvertierbaren Fluorophor markiert, und dies wird in Drosophila melanogaster exprimiert. Sektion der Drosophila-Larve im dritten Stadium.Setze eine wandernde Larve des dritten Stadiums auf eine zylindrische oder halbzylindrisch geformte Sylgard-Basis. Geben Sie 40 Mikroliter Schneider's Insect Medium auf die Larve. Stechen Sie unter einem Präpariermikroskop eine winzige Nadel durch den Kopf und eine weitere durch den Schwanz der Larve, um sie ruhig zu stellen.Um den Zugang zu erleichtern, verwenden Sie eine winzige Stecknadel, um einen schmalen Schnitt an der Mittellinie der dorsalen Seite des Bauchbereichs der Larve zu machen. Von diesem Schnittpunkt aus schneiden Sie mit einer Federschere entlang der Körperwand in vorder-hinterer Richtung. Entnehmen Sie der Larve mit Hilfe einer feinen Pinzette und einer Federschere innere Organe.Waschen Sie die präparierte Larve mit Schneider's Insect Medium. Stecken Sie je zwei winzige Stecknadeln durch die beiden Körperwandklappen, um eine sechseckige präparierte Larvenpräparation herzustellen. Löse das Larvengehirn mit einer Federschere vom ventralen Nervenstrang.Schiebe mit einer gebogenen Pinzette die winzigen Stifte in den Sylgard-Boden. Einzelpartikel-Tracking photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie. Drehen Sie die Sylgard-Basis der Larve auf eine Kulturschale mit Glasboden, die mit zwei Millilitern zimmerwarmem Schneider's Insect Medium gefüllt ist.Tragen Sie Wasser auf das 63x Wasserimmersionsobjektiv eines ELYRA PS.1 Mikroskops auf und stellen Sie die Schale dann auf den Tisch. Schalten Sie das Durchlicht ein und lokalisieren Sie mit dem Okular die Larve auf der Sylgard-Basis mit Hilfe des 10-fach-Luftobjektivs. Wechseln Sie zum 63-fachen Wasserimmersionsobjektiv und identifizieren Sie Muskel sechs mithilfe der Hellfeldbeleuchtung.Wählen Sie mit der ZEN Black Acquisition Software die Konfiguration Totalreflexionsfluoreszenz, TIRF, aus. Schalten Sie den 488-Nanometer-Laser um, um eMos2 in Grün zu visualisieren. Lokalisieren Sie die neuromuskulären Verbindungen, die wie Kügelchen auf einer Schnur aussehen, und nehmen Sie ein TIRF-Bild mit niedriger Auflösung auf, schalten Sie gleichzeitig den 405-Nanometer-Laser und den 561-Nanometer-Laser ein, um die Photokonvertierung und die Abbildung roter eMos2-Spezies zu ermöglichen.Verwendung einer sehr geringen Laserleistung für den 405-Nanometer-Laser, um mäßig konstante stochastische Photokonversionen zu ermöglichen. Hier wird ein 405-Nanometer-Laser mit 0,09 % betrieben, während ein 561-Nanometer-Laser mit 50 % betrieben wird. Schieben Sie in den TIRF-Winkeloptionen in der Software den TIRF-kritischen Winkel leicht heraus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 30 Millisekunden ein.Erfassen Sie eine Zeitreihe von Bildern der neuromuskulären Verbindung. Hier wurde ein Film mit 15.000 Bildern aufgenommen. Speichern Sie den Film als Datei im czi-Format.Datenanalyse. Analysieren Sie die aufgenommenen Filme mit einer geeigneten Einzelmolekular-Tracking-Analysesoftware. Lokalisieren Sie die x- und y-Koordinaten jeder fluoreszierenden Proteinlokalisierung durch die Gaußsche Anpassung der Intensitätspunkt-Spreizungsfunktion.Um die Trajektorie jeder Lokalisierung nachzuzeichnen, legen Sie einen Schwellenwert von mindestens acht kontinuierlichen unterschiedlichen Frame-Darstellungen für jede Lokalisierung und einer maximalen Beweglichkeit von drei Pixeln zwischen den einzelnen Frames fest. Erhalten Sie das Trajektorienbild, die mittlere quadratische Verschiebung sowie den Diffusionskoeffizienten aller verfolgten Lokalisierungen. Repräsentative Ergebnisse.Die mittlere quadratische Verschiebung einzelner Trajektorien von Syntaxin-1A-eMos2 aus mehreren neuromuskulären Verbindungen in drei verschiedenen Larven wurde aufgetragen, als Mittelwert plus minus Standardfehler des Mittelwerts. Die Fläche unter der mittleren quadratischen Verschiebungskurve wurde ebenfalls dargestellt. Der Diffusionskoeffizient von Syntaxin-1A-mEos2 wurde in ähnlicher Weise aus mehreren neuromuskulären Verbindungen ermittelt und als Histogramm der relativen Häufigkeitsverteilung aufgetragen.Die Schwelle des Diffusionskoeffizienten zeigte zwei Populationen von Syntaxin-1A, eine mobile und eine immobile Population. Es wurde das Verhältnis der mobilen zu immobilen Populationen von Syntaxin-1A-mEos2 berechnet. Schlussfolgerung. Dieses Video soll ein Verständnis dafür vermitteln, wie das Einzelprotein-Tracking an der neuromuskulären Verbindung von Drosophila-Larven durchgeführt werden kann.Die Technik bietet Forschern auf dem Gebiet der neuronalen Kommunikation die Möglichkeit, die Mobilität und Organisation einzelner Proteine mit hoher Auflösung in vivo zu visualisieren und zu beobachten.

in-vivo-single-molecule-tracking-at-drosophila-presynaptic-motor

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Aufzeichnung synaptischer Ströme an der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Larve

In diesem Video werden die Nervenfasern der Drosophila-Larven in FM-Farbstoff getaucht, der an die Lipide der Zellmembran bindet. Saugmikroelektrode und elektrische Impulse stimulieren den Endozytoseprozess, indem der FM-Farbstoff in neu gebildete endozytäre Vesikel eingebaut wird. Diese Methode, die präsynaptische Stadien der Neurotransmission sichtbar macht, ist nützlich, um die synaptische Funktion und die Freisetzung von Neurotransmittern zu untersuchen.

Mikroelektrodenvermitteltes Be- und Entladen von FM-Farbstoffen in Nervenzellen von Drosophila-Larven

Hier zeigen wir , wie die Anzahl und die räumliche Verteilung der synaptischen aktiven Zonen in Drosophila melanogaster Photorezeptoren zu quantifizieren, markiert mit einem genetisch molekularen Marker codiert und deren Modulation nach längerer Einwirkung von Licht.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

Hier beschreiben wir die Methode, die wir angewendet haben, um hochmotile dendritische Filopodia in einer Live-Vorbereitung des Drosophila-Larvenhirns abzubilden, und das Protokoll, das wir entwickelt haben, um Zeitraffer-3D-Bildgebungsdatensätze für quantitative Bewertungen von Dendriten zu quantifizieren. Dynamik bei der Entwicklung von Neuronen.

Zeitraffer Live Imaging und Quantifizierung der schnellen dendritischen Zweigdynamik bei der Entwicklung von Drosophila Neuronen

Wir beschreiben eine Methode zur retrograden Rückverfolgung der embryonalen motorischen Neuronen Von Drosophila mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen.

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Erfahren Sie Einzelmolekül-Tracking in vivo an präsynaptischen motorischen Nervterminalen von Drosophila melanogaster-Larven mittels PALM. Diese Methode ermöglicht die hochauflösende Visualisierung synaptischer Proteindynamik.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

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