Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein rekombinantes Protein herzustellen, das aus einer Mischung von geordneten und ungeordneten Domänen besteht, für die hybride Strukturanalyse sowohl durch Röntgenkristallographie als auch durch Kleinwinkel-Röntgenstreuung. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Strukturbiologie zu beantworten, wie man die biologische Funktion so einstellen kann, dass die Bestimmung aller Lösungen die Struktur des Proteins bleibt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur Modellierung dynamischer Bereiche eines Proteins oder Makromoleküls verwendet werden kann, die mit der Röntgenkristallographie nicht aufgelöst werden können.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, zu Beginn Schwierigkeiten haben, zu lernen, wie sie die Qualität ihrer SAXS-Daten richtig beurteilen können. Um das Verfahren zu beginnen, transformieren Sie ein Nsa1-Expressionsplasmid in einen geeigneten E.coli-Expressionsstamm. Kultivieren Sie die Zellen, induzieren Sie die Nsa1-Expression und ernten Sie die Zellen.

Resuspendieren Sie die Zellen in 25 Millilitern Lysepuffer, kühlen Sie sie auf vier Grad Celsius vor und enthalten Sie eine EDTA-freie Proteasehemmer-Tablette. Beschallen Sie die Zellen sieben Minuten lang bei vier Grad Celsius, mit einem Zyklus von zwei Sekunden an, zwei Sekunden aus. Zentrifugieren Sie dann das Lysat bei 26.900-facher Schwerkraft für 45 Minuten bei vier Grad Celsius.

Stellen Sie sicher, dass das Gemisch während des Zentrifugierens nicht gefriert. Als nächstes äquilibrieren Sie eine Schwerkraftflusssäule mit 10 ml immobilisiertem Kobalt-Affinitätsharz mit Lysepuffer. Laden Sie das geklärte Lysat auf die Säule und lassen Sie es bei vier Grad Celsius durch das Harz fließen.

Waschen Sie dann das Harz zweimal mit 100 ml Portionen Lysepuffer. Eluieren Sie Nsa1 aus der Säule mit 20 ml Elutionspuffer. Führen Sie ein 15mcl Aliquot der Eluere auf ein vier bis 15%iges SDS-PAGE-Gel durch, um die Elution des Proteins zu bestätigen.

Geben Sie dann 1 ml der 1 mg/ml TEV-Protease-Stammlösung in die Eluere. Inkubieren Sie die Eluere über Nacht bei vier Grad Celsius, um das MBP-Etikett zu entfernen. Verwenden Sie dann eine 10-Kilodalton-Zentrifugalfiltereinheit, um das MBP-gespaltene Nsa1 auf etwa 5 ml zu konzentrieren, wobei Sie darauf achten sollten, dass es nicht zu stark konzentriert.

Reinigen Sie das konzentrierte Protein auf einer Gelfiltrationssäule, die mit Puffer A voräquilibriert ist.Einer der kritischen Schritte in diesem Verfahren besteht darin, sicherzustellen, dass Sie alle Aggregate während der Reinigung entfernen. Aggregate stören die Kristallisation und die SAXS-Datenerfassung und -analyse. Analysieren Sie 15 mcl-Proben aus jeder Säulenfraktion mit SDS-PAGE, um die Trennung von MBP und Nsa1 zu bestätigen.

Kombinieren Sie die Nsa1, die Fraktionen enthalten. Verwenden Sie eine 10-Kilodalton-Zentrifugalfiltereinheit, um die kombinierten Fraktionen auf etwa 8 mg/ml zu konzentrieren. Messen Sie die Extinktion bei 289 Nanometern und berechnen Sie die Proteinkonzentration.

Fahren Sie sofort mit proteolytischen Screening- und Kristallisationsstudien fort. Um mit dem proteolytischen Screening zu beginnen, bereiten Sie 1 mg/ml Stammlösungen von Alpha-Comotrypsin, Trypsin, Elastase, Capayin, Septilisin und Endoproteinase GluC vor. Verdünnen Sie jede Stammlösung mit Verdünnungspuffer auf 1:10, 1:100 und 1:1.000.

Verdünnen Sie die 8 mg/ml Lösung von Nsa1 auf 1 mg/ml mit Puffer A. Kombinieren Sie dann für jede Proteaseverdünnung 1 mcl der Proteaseverdünnung mit 9 mcl des verdünnten Proteinbestands. Inkubieren Sie die Lösungen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann 10 mcl 2x SDS-PAGE-Probe hinzu, um sie zu puffern, und erhitzen Sie die Lösungen fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Führen Sie die Lösungen auf einem vier bis 15%igen SDS-PAGE-Gel aus, um proteaseresistente Domänen zu identifizieren. Erstellen Sie abgeschnittene Ausdruckskonstrukte, die labile Proteasebereiche ausschließen. Exprimieren und reinigen Sie diese Proteine zur Optimierung der Kristallisation.

Nachdem Sie SAXS-Daten für das Nsa1-Protein über einen bestimmten Konzentrationsbereich erfasst haben, legen Sie den Pfad der Terminalshell-Datei auf das Verzeichnis fest, das die Daten enthält. Starten Sie dann die Analysesoftware. Laden Sie die Streukurven in die Analysesoftware.

Verwenden Sie das automatische RG-Werkzeug, um den Gyrationsradius und die Intensität der Vorwärtsstreuung für jede Kurve zu bestimmen. Generieren Sie dann Kratky-Diagramme für jede Streukurve, um den Grad der Kompaktheit zu bestimmen. Verwenden Sie das Werkzeug Autonom, um die paarweise Verteilungsfunktion für jede Kurve zu berechnen, wobei Sie eine maximale Anfangsabmessung von dem 3-fachen des Gyrationsradius verwenden.

Optimieren Sie die maximale Dimension, um eine glatte, paarweise Verteilungsfunktionskurve zu erhalten, die mit der experimentellen Streukurve konsistent ist. Vergleichen Sie die strukturellen Parameter über Konzentrationen hinweg, um das Fehlen von Strahlenschäden oder konzentrationsabhängigen Effekten zu überprüfen. Es ist wichtig, wichtige strukturelle Parameter, einschließlich des Gyrationsradius, der Molekülmasse, der Vorwärtsstreuung und der Paarabstandsverteilungsfunktionen über eine Konzentrationsreihe zu vergleichen.

Und das soll sicherstellen, dass es keine Strahlenschäden oder Konzentrationseffekte gibt. Führen Sie als Nächstes das Dienstprogramm für die Ensemble-Optimierungsmethode mit der Ausgangsproteinkristallstrukturdatei, der Zielproteinsequenzdatei und der experimentellen SAXS-Datendatei aus. Vergleichen Sie die Chi-Quadrat-Werte aus der Ausgangskristallstrukturdatei mit der Ensemble-Datei, um zu bestimmen, ob das Ensemble-Modell gut zu den experimentellen Daten passt.

Verwenden Sie molekulare Visualisierungssoftware, um die Kristallstruktur mit den erzeugten Konformeren zu überlagern. Notieren Sie die Gesamtzahl der Konformere und den Anteil der Belegung für jedes Konformer, der zur Streukurve beiträgt. Die proteolytische Spaltung des proteaselabilen C-Terminus von Nsa1 führte zur Bildung von orthorhombischen Kristallen.

Das frisch gereinigte Nsa1 bildete kubische Kristalle, aber der Kristallstruktur fehlte noch die Elektronendichte für den labilen c-Terminus. Die n-terminale siebenstufige Beta-Propeller-WD-40-Domäne von Nsa1 war in beiden Strukturen gut aufgelöst. Die Nsa1 WD-40-Domäne allein passte nicht gut zu den experimentellen SAXS-Daten.

Eine Kombination aus Starrkörpermodellierung und abinitialer Rekonstruktion des C-Terminus verbesserte die Passgenauigkeit erheblich. Die Ensemble-Modellierung führte zu einer noch größeren Verbesserung der Passgenauigkeit und enthüllte die bestätigende Probenahme des C-terminalen Schwanzes in Lösung. Obwohl SAXS eine niedrig aufgelöste Strukturtechnik ist, ergänzt sie sehr gut hochauflösende Strukturstudien wie die Röntgenkristallographie.

So können Sie flexible und ungeordnete Regionen modellieren. Durch das Sammeln und Analysieren von SAXS-Daten von Makromolekülen können Sie beginnen, die bestätigende Veränderung zu verstehen, die aufgetreten ist Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Struktur eines Proteins lösen können, das aus geordneten und ungeordneten Bereichen besteht, sowohl durch Röntgenkristallographie als auch durch SAXS.