Name: Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Erfahren Sie die hybride Strukturanalyse von Proteinen mit geordneten und ungeordneten Domänen durch Röntgenkristallographie und SAXS. Diese Methode ermöglicht die Modellierung dynamischer Proteinregionen in Lösung.

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Beugung im Südosten regionale kooperative Zugriffsteam (SER-CAT) 22-ID und 22-BM Beamlines an der Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory Daten. Die SAXS Daten wurden auf die SIBYLLEN Strahlrohr im Voraus Licht Quelle (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Wir möchten den Mitarbeitern bei der SIBYLLEN Strahlrohr für ihre Hilfe bei remote-Datenerfassung und-Verarbeitung danken. Wir sind dankbar für die National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Mass Spectrometry Forschung und Selbsthilfegruppe für Hilfe bei der Bestimmung der Protein-Domänengrenzen. Diese Arbeit wurde durch das uns nationale Institute der Gesundheit intramuralen Forschungsprogramm unterstützt; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247, R. E. S.) und den kanadischen Institutes of Health Research (CIHR, 146626, M.C.P). Verwendung der APS wurde unterstützt durch das US Department of Energy, Office of Science, Büro der grundlegenden Energiewissenschaften unter Vertragsnr. W-31-109-DEU-38. Verwendung von Advanced Light Source (ALS) wurde unterstützt durch die Direktor des Office of Science, Büro von Energie Grundlagenwissenschaften, des US-Department of Energy unter Vertragsnr. DE-AC02-05CH11231. Zusätzlicher Unterstützung für die SIBYLLEN SAXS Strahlrohr kommt aus dem National Institute of Health Projekt MINOS (R01GM105404) und eine High-End-Instrumentierung Grant S10OD018483. Wir möchten auch Danke Andrea Moon und Dr. Sara Andres für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Unter Verwendung dieses Protokolls, wurde rekombinante Nsa1 aus S. Cerevisiae für strukturelle Studien durch Röntgen-Kristallographie und SAXS generiert. Nsa1 war brav in Lösung und in mehreren Kristallformen kristallisiert. Bei der Optimierung dieser Kristalle entdeckte man, dass der C-Terminus des Nsa1 empfindlich auf Protease-Abbau war. Die hohe Auflösung, orthorhombic Kristallform konnte nur mit C-terminale abschneiden Varianten der Nsa1, wahrscheinlich dupliziert werden, weil der flexible C-Terminus des Nsa...

Ribosomen sind große Ribonucleoprotein Maschinen, die die wesentliche Rolle der Übersetzung von mRNA in Proteine in allen lebenden Zellen durchführen. Ribosomen bestehen aus zwei Untereinheiten, die in einem aufwändigen Verfahren bezeichnet Ribosom Biogenese1,2,3,4hergestellt werden. Eukaryotische Ribosom Versammlung stützt sich auf die Hilfe von Hunderten von wesentlichen ribosomale Montage Faktoren2,3,5. Nsa1 (Nop7 verbunden 1) ist ein eukaryotische Ribosom Versammlung-Faktor, der speziell für die Produktion der großen ribosomalen Untereinheit6erforderlich ist, und ist bekannt als WD-Wiederholung, 74 (WDR74) in höheren Organismen7enthält. WDR74 hat gezeigt, dass für die Blastozyste Bildung in Mäusen8erforderlich und der WDR74-Promoter ist häufig in Krebs Zellen9mutiert. Die Funktion und die genauen Mechanismen der Nsa1/WDR74 im Ribosom Versammlung sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Um zu beginnen, die Rolle der Nsa1/WDR74 während der Reifung eukaryotische Ribosom aufzudecken, wurden mehrere strukturelle Analysen durchgeführt, einschließlich Röntgen-Kristallographie und kleinen Winkel x-ray Scattering (SAXS)10.
Röntgen-Kristallographie, Kernresonanzspektroskopie (NMR), Elektronenmikroskopie und SAXS sind alle wichtigen Techniken für makromolekulare Struktur zu studieren. Größe, Form, Verfügbarkeit und Stabilität der Makromoleküle Einflüsse der Strukturbiologie Methode, für die ein bestimmtes Makromolekül wird am besten sein, geeignet, jedoch kombiniert mehrere Techniken durch einen sogenannten "Hybrid"-Ansatz ist immer ein immer vorteilhaft Werkzeug11. Insbesondere sind Röntgen-Kristallographie und SAXS kraftvoll und ergänzende Methoden zur Strukturaufklärung von Makromolekülen12.
Kristallographie bietet hochauflösende atomare Strukturen von kleinen Molekülen bis hin zu großen zellulären Maschinerie wie das Ribosom und führte zu zahlreichen Durchbrüchen in das Verständnis der biologischen Funktionen von Proteinen und anderen Makromoleküle13. Darüber hinaus nutzt Struktur basierende Wirkstoff-Design die Kraft der Kristallstrukturen zum molekularen Andocken von Berechnungsmethoden, Droge-Entdeckung und Entwicklung14eine kritische Dimension hinzuzufügen. Trotz seiner breiten Anwendbarkeit sind flexibel und ungeordneten Systeme schwer zu beurteilen von Kristallographie da Kristall Verpackung behindert kann oder Elektron Dichte Karten möglicherweise unvollständig oder von schlechter Qualität. Umgekehrt ist SAXS ein lösungsorientierter und mit niedriger Auflösung struktureller Ansatz in der Lage, flexible Systeme, die ungeordneten Schlingen und Termini bis hin zu intrinsisch ungeordneten Proteine12,15,16, zu beschreiben. Wenn man bedenkt, dass es kompatibel mit einer breiten Palette von Teilchen Größen12, kann SAXS synergistisch arbeiten mit Kristallographie, biologische Fragestellungen erweitert, die durch strukturelle Studien behandelt werden können.
Nsa1 eignet sich für ein Hybrid-strukturellen Ansatz, denn es enthält eine gut strukturierte WD40 Domäne gefolgt von einer funktionalen, aber flexible C-Terminus nicht Röntgen-Kristallographie Methoden zugänglich ist. Es folgt ein Protokoll für das Klonen, Ausdruck und Reinigung von S. Cerevisiae Nsa1 für Hybrid Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie und SAXS. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um die Strukturen von anderen Proteinen zu studieren, die aus einer Kombination von geordneten und ungeordneten Regionen bestehen.

<table><tbody><tr><td>Molecular Cloning of Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMBP2 parallel</td><td>vector Sheffield et al., Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td><td></td><td>Wir verwendeten eine modifizierte Version von pMBP2, die einen N-terminalen His-Tag (pHMBP)</td></tr><tr><td>S. cerevisiae genomische DNA</td><td>ATCC</td><td>204508D-5</td><td></td></tr><tr><td>Primer für die Klonierung von Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLFw</td><td>IDT</td><td></td><td>CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGT GGATAG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLRv</td><td>IDT</td><td></td><td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td><td>IDT</td><td></td><td>GGGCGCCATGGGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td><td>IDT</td><td></td><td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td></tr><tr><td>Rekombinante Proteinproduktion und Reinigung von Nsa1</td>Escherichia coli BL21 (DE3) <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Star Cells</td><td>Invitrogen</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>pMBP-NSA1 und verschiedene Trunkierungen</td><td>Lo et al., 2017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selenomethionin</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD12-503B</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Dioxanfrei</td><td>Promega</td><td>V3953</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-freier Proteasehemmer Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Caledon Laborchemikalien</td><td>7560-1-80</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Puffer, 1 m pH7,5</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Invitrogen</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1M Imidazol, pH 8,0</td><td>Teknova</td><td>I6980-06</td><td></td></tr><tr><td>Talon Affinity Resin</td><td>Clonetech</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL Zentrifugalfilter (MWCO 10K)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Gel in Vorbereitungsqualität Filtrationssäule</td><td>GE-Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>TEV-Protease</td><td>Hergestellt von NIEHS Protein Expression Core</td><td>Expression Plasmid bereitgestellt von NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)</td><td></td></tr><tr><td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRad</td><td>456-8056</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisation, Proteolytisches Screening</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristallsieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Kristallsieb 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>Salz Rx</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Indexsieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ionensieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>JCSG+</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD1-37</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Precipitant Synergy</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD15-PS-T</td><td></td></tr><tr><td>Swissci 96-Well 3-Drop UVP Sitz-Drop-Platten</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-05823</td><td></td></tr><tr><td>3 Zoll breites kristallklares Dichtungsband</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-506</td><td></td></tr><tr><td>Proti-Ace Kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-429</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1500</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES/Natriumhydroxid pH 7,5</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-011-Natriumcitrat</td><td></td></tr> <tr><td>tribasisch</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-127</td><td></td></tr><tr><td>22 mm x 0,22 mm Silikonisierte Deckfolien</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten mit Dichtmittel (VDX Platte mit Dichtungsmittel)</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>18 mM montierte Nylonschlaufen (0,05 mm bis 0,5 mM)</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td><td></td></tr><tr><td>Rocaille-Set</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Kristallkappen</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Kryo-Zauberstab</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Schaum Dewar</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Puck System</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td></td></tr><tr><td>Full Skirt 96 Well Clear Plate</td><td>VWR</td><td>10011-228</td><td></td></tr><tr><td>AxyMat Dichtungsmatte</td><td>VWR</td><td>10011-130</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVEX-m</td><td>JAN Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Lite Spektralphotometer</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Robot</td><td>TTP Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software/WebsitesHKL2000</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Otwinoski und Minor, 1997</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Adams et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Coot Emsley et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSAS</td><td>Petoukhov et al., 2012</td><td></td><td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td></tr> <tr><td>Scatter</td><td>Rambo and Tainer, 2013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pymol</td><td>The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schr&ouml; dinger, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUNCH</td><td>Petoukhov und Svergun, 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRYSOL</td><td>Svergun et al., 1995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al., 2003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOM</td><td>Tria et al., 2015</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kombination von röntgen-kristallographie mit kleinen winkel röntgenstreuung, unstrukturierte regionen der nsa1 aus s. cerevisiae zu modellieren

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Bestimmung der Struktur der Ribosom Versammlung Faktor Nsa1 von Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) in voller Länge ist schwierig wegen der ungeordneten und Protease labil C-Terminus des Proteins. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden um rekombinante Nsa1 aus S. Cerevisiae für Baustatik durch Röntgen-Kristallographie und SAXS zu reinigen. Röntgen-Kristallographie wurde eingesetzt, um die Struktur der wohlgeordneten WD40 N-terminale Domäne des Nsa1 zu lösen, und dann SAXS wurde verwendet, um die Struktur des C-Terminus des Nsa1 in Lösung zu beheben. Lösung Streuung Daten wurden von in voller Länge Nsa1 in Lösung. Die theoretische Streuung Amplituden wurden von der hochauflösenden Kristallstruktur des Geschäftsfeldes WD40 berechnet, und dann offenbart eine Kombination des steifen Körpers und ab-initio -Modellierung der C-Terminus des Nsa1. Durch diesen Hybridansatz wurde die quartäre Struktur des gesamten Proteins rekonstruiert. Die hier vorgestellten Methoden sollten in der Regel für die Hybrid-Strukturaufklärung anderer Proteine, bestehend aus einer Mischung aus strukturierten und unstrukturierten Domänen gelten.

Nsa1 war PCR verstärkt aus S. Cerevisiae genomischer DNA und subcloned in einen Vektor mit einer N-terminalen 6 X-Histidin Affinität Tag gefolgt von MBP und ein TEV Protease-Website. Nsa1 verwandelte sich in E. Coli BL21(DE3) Zellen und hohe Erträge der Proteinexpression wurden nach Induktion mit IPTG und Wachstum bei 25 ° C über Nacht (Abb. 1A). Nsa1 war Affinität auf immobilisierte Kobalt Affinität Harz, gefolgt von MBP Spaltung mit TEV Pr...

Diese Methode beschreibt die Klonen, Ausdruck und Reinigung von rekombinanten Nsa1 zur Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie und kleine Winkel Röntgenstreuung (SAXS) und gilt für die Hybrid-Strukturanalyse von anderen Proteinen mit beiden bestellt und Domänen ungeordnet.

Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein rekombinantes Protein herzustellen, das aus einer Mischung von geordneten und ungeordneten Domänen besteht, für die hybride Strukturanalyse sowohl durch Röntgenkristallographie als auch durch Kleinwinkel-Röntgenstreuung. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Strukturbiologie zu beantworten, wie man die biologische Funktion so einstellen kann, dass die Bestimmung aller Lösungen die Struktur des Proteins bleibt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur Modellierung dynamischer Bereiche eines Proteins oder Makromoleküls verwendet werden kann, die mit der Röntgenkristallographie nicht aufgelöst werden können.Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, zu Beginn Schwierigkeiten haben, zu lernen, wie sie die Qualität ihrer SAXS-Daten richtig beurteilen können. Um das Verfahren zu beginnen, transformieren Sie ein Nsa1-Expressionsplasmid in einen geeigneten E.coli-Expressionsstamm. Kultivieren Sie die Zellen, induzieren Sie die Nsa1-Expression und ernten Sie die Zellen.Resuspendieren Sie die Zellen in 25 Millilitern Lysepuffer, kühlen Sie sie auf vier Grad Celsius vor un

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Verarbeitung von Kryo-EM-Bildern mit der Software-Suite SPHIRE vor. Das vorliegende Protokoll kann für fast alle Einzelteilchen-EM-Projekte angewendet werden, die auf eine nahezu atomare Auflösung abzielen.

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

Strukturen der supramolekularen Protein Baugruppen in atomarer Auflösung sind wegen ihre entscheidende Rolle in einer Vielzahl von biologischen Erscheinungen von hoher Relevanz. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um hochauflösende strukturelle Studien unlöslich und nichtkristalline makromolekularen Protein-Assemblys durch Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (MAS-NMR) durchführen.

Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Eine optimierte Protokoll für die Durchführung einer umfangreichen biochemischen und strukturelle Charakterisierung von ein Kohlenhydrat-Substrat-Bindeprotein von Streptococcus Pneumoniae wird vorgestellt.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Dieses Protokoll beschreibt im Detail wie fabrizieren und mikrofluidischen Geräte zur Röntgenbeugung Datenerfassung bei Raumtemperatur betrieben. Darüber hinaus beschreibt die Kristallisation von Proteinen durch dynamische Lichtstreuung zu überwachen und Informationen zum Verarbeiten und analysieren erhalten Beugung Daten.

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Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie ein Modell mit niedriger Auflösung ab-initio und Strukturdetails Waschmittel solubilisiert Membranprotein in Lösung mit kleinen Winkel Neutronenstreuung mit Kontrast-matching des Waschmittels zu erhalten.

Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

Hier zeigen wir, wie kleine Winkel x-ray Scattering (SAXS) genutzt werden können, um Informationen auf niedriger Auflösung Umschläge repräsentieren die makromolekularen Strukturen zu erhalten. Bei Verwendung in Verbindung mit hochauflösenden strukturelle Techniken wie Röntgen-Kristallographie und magnetischen Kernresonanz bieten SAXS detaillierte Einblicke in multidomain Proteine und makromolekulare komplexe in Lösung.

Strukturelle Studien von Makromolekülen in Lösung mit kleinen Winkel Röntgenstreuung

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Neutronenkristallographie Datenerhebung und -verarbeitung zur Modellierung von Wasserstoffatomen in Proteinstrukturen

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Erfahren Sie die hybride Strukturanalyse von Proteinen mit geordneten und ungeordneten Domänen durch Röntgenkristallographie und SAXS. Diese Methode ermöglicht die Modellierung dynamischer Proteinregionen in Lösung.

Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren (Video) | JoVE Journal

Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

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