Mikrosonde Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry für einzellige Metabolomik in Live-Frosch (Xenopus Laevis) Embryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Charakterisierung von Metaboliten in lebenden Zellen sich entwickelnder Embryonen durch in situ Mikroprobenahme, Kapillarelektrophorese und Massenspektrometrie. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zell- und Entwicklungsbiologie zu beantworten, da sie die Analyse des Stoffwechsels in einzelnen Zellen direkt in lebenden sich entwickelnden Embryonen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell und skalierbar auf verschiedene Zellgrößen ist und eine minimalinvasive Probenahme einzelner Zellen in lebenden Embryonen ermöglicht.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da einige Schritte schwer zu erlernen sind, da sich der Embryo relativ schnell entwickelt und ein speziell angefertigtes Kapillarelektrophorese-Elektrospray-Ionisationsinstrument verwendet wird. Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Zubereitung von 2%Agarose in einer 1X Steinberg-Lösung. Beschichten Sie den Boden von 60-Millimeter-Petrischalen mit der Lösung, solange er noch flüssig ist.

Sobald das Agarose-Gel abgekühlt und fest geworden ist, flammen Sie das Ende einer sechs Zoll großen Pasteur-Pipette ab, bis es eine Kugel bildet. Berühren Sie dann leicht das erhitzte Ende, um fünf bis 10 Vertiefungen etwa einen Millimeter tief in die Agarose zu prägen. Um Mikropipetten mit konischer Spitze herzustellen, ziehen Sie zunächst Borosilikatkapillaren in einen Kapillarabzieher vom Typ Flaming/Brown, wobei Sie die Einstellungen im Textprotokoll verwenden.

Brechen Sie dann die Spitze der gezogenen Mikropipette mit einer feinen, scharfen Pinzette ab, um einen Außendurchmesser der Kapillarspitze von etwa 20 Mikrometern zu erhalten. Führen Sie diesen Schritt unter einem Stereomikroskop durch, um die Präzision und Reproduzierbarkeit zu verbessern. Gewinnung von Embryonen durch Gonadotropin-induzierte natürliche Verpaarung von adultem Xenopus laevis oder durch In-vitro-Fertilisation, wie im Textprotokoll beschrieben.

Entfernen Sie die Geleehüllen, die die Embryonen umgeben, wenn sie beginnen, sich in das Zweizellstadium zu spalten, indem Sie die Embryonen zunächst zwei Minuten lang in der Entgummierungslösung ruhen lassen. Schwenken Sie sie dann vorsichtig für weitere zwei Minuten, um zu verhindern, dass die Embryonen an der Oberfläche der Entnahmeschale haften bleiben. Gießen Sie den Schaleninhalt vorsichtig in ein sauberes Becherglas und füllen Sie die Entmarmeladenlösung schnell aus dem Becherglas um.

Bedecken Sie die Eier sofort mit der 0,1-fachen Steinberg-Lösung, um die restliche Entmarmeladenlösung abzuspülen. Die Lösung vorsichtig schwenken und dann dekantieren. Wiederholen Sie diesen Schritt viermal, um die Embryonen gründlich zu waschen.

Übertragen Sie die dejelliierten Embryonen in die 1X Steinberg-Lösung in einer Petrischale. Um das Gedränge in den Platten zu minimieren, platzieren Sie etwa 100 Embryonen pro 100-Millimeter-Schale. Sortieren Sie die spaltenden Embryonen im Zweizellstadium in eine separate Schale, in der die stereotype Pigmentierung den dorsalen ventralen Zugang sicher markiert, um Sulfatkarten zu erstellen.

Identifizieren Sie korrekt spaltende Embryonen, indem Sie sicherstellen, dass die erste Spaltfurche, die die mittlere Sagittalebene markiert, den dunkel pigmentierten Tierzug und den leicht pigmentierten Tierzug halbiert, so dass die beiden Hälften Spiegelbilder sind. Montieren Sie als Nächstes eine gefertigte Mikropipette auf einem mehrachsigen Mikromanipulator. Verbinden Sie die Mikropipette mit einem Mikroinjektor.

Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um etwa fünf der achtzelligen Embryonen zu aspirieren und sie in die Probenschale mit der 0,5-fachen Steinberg-Lösung zu übertragen. Positionieren Sie den zu entnehmenden Embryo mit einer Haarschlaufe in einer individuellen Vertiefung und stellen Sie sicher, dass die korrekt identifizierte Zelle von Interesse in einem Winkel von etwa 90 Grad zur Mikrosonde zeigt. Führen Sie bei der Arbeit unter dem Stereomikroskop die Spitze der Mikropipette in die identifizierte Einzelzelle im lebenden Embryo.

Entnehmen Sie einen gewünschten Teil des Zellinhalts, indem Sie mit dem Mikroinjektor Unterdruckimpulse an die Mikrokapillare anlegen. Ziehen Sie die Mikrosonde vorsichtig aus der Zelle zurück und geben Sie ihre Spitze in vier Mikroliter des Metaboliten-Extraktionslösungsmittels, das in einem Mikrofläschchen gekühlt wird. Üben Sie anschließend einen Druckstoß von positiven 80 psi für eine Sekunde auf die Kapillare aus, indem Sie den Mikroinjektor verwenden, um das Aspirat in das Lösungsmittel auszustoßen.

Verschließen Sie das Fläschchen fest, um eine Verdunstung zu verhindern, und stellen Sie das Fläschchen wieder auf Eis, bis die Probenahme abgeschlossen ist. Sobald die Probenahme abgeschlossen ist, wird die Probe mit Mikrozentrifugenfläschchen etwa eine Minute lang vortex-gemischt, um die Extraktion der Metaboliten zu beschleunigen. Zentrifugieren Sie dann die Fläschchen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 8.000 g Celsius, um Zelltrümmer und andere Partikel zu pelletieren.

Lagern Sie die Zellextrakte zusammen mit den Zelltrümmern und fällen Sie einen Tag lang bei minus 20 Grad Celsius oder bis zu einem Monat lang bei minus 80 Grad Celsius bis zur Messung mittels CE-ESI-MS. Konstruktion der CE-Injektionsplattform, die in der Lage ist, eine schnelle vertikale Translation eines Tisches zu ermöglichen, der das Hintergrund-Elektrolytfläschchen und das Probenlademikrofläschchen enthält, wie im Textprotokoll angegeben. Montieren Sie die CE-ESI-Schnittstelle, indem Sie zuerst den Elektrospray-Metallemitter in eine T-Verbindung mit drei Anschlüssen einbauen.

Führen Sie dann die Trenn-CE-Kapillare durch den Elektrospray-Emitter, so dass sie etwa 40 bis 100 Mikrometer über die Spitze des Emitters hinausragen kann. Arbeiten Sie unter einem Stereomikroskop, um die Genauigkeit zu verbessern. Verbinden Sie die Kapillare der Blattlösung mit dem verbleibenden Anschluss, um die Elektrospray-Lösung zuzuführen.

Verwenden Sie geeignete Hülsen und fingerfeste Anschlüsse für einen leckagefreien Betrieb der CE-ESI-Schnittstelle. Montieren Sie die CE-ESI-Schnittstelle mit einem Plattenhalter auf einen dreiachsigen Translationstisch und positionieren Sie die Elektrospray-Emitterspitze etwa zwei Millimeter von der Blende des Massenspektrometers entfernt. Um die Bestandteile der Grenzfläche zu reinigen, wird zunächst die Elektrospray-Plattenlösung mit einem Mikroliter pro Minute durch den Elektrospray-Strahler und die BGE durch die CE-Trennkapillare zugeführt.

Verwenden Sie Spritzenpumpen, um die Lösungsmittel mit einer gleichmäßigen Geschwindigkeit zu fördern. Spülen Sie dann vor jeder Messung die CE-Trennkapillare, indem Sie eine Spritze an das Kapillareinlassende anschließen. Verwenden Sie effizient große Spritzen, um das Nachfüllen und Ansaugen der Lösungsmittelzuleitungen zu minimieren.

Nachdem Sie die Trennkapillare etwa fünf Minuten lang gespült haben, überführen Sie den Einlass in die BGE-Lösung, die sich im Edelstahlfläschchen befindet. Positionieren Sie die Elektrospray-Strahlerspitze etwa zwei Millimeter von der Blende des Massenspektrometers entfernt. Stellen Sie diesen Abstand mit einem Translationstisch fein ein, um Elektrospray im stabilen Kegelstrahlbereich zu erzeugen, während Sie das Spray mit einem Stereomikroskop überwachen.

Überwachen Sie die Stabilität des Gesamtionenstroms oder der TIC für etwa 30 bis 45 Minuten, um einen stabilen Betrieb zu gewährleisten. Wenden Sie 21 plus oder minus zwei Kilovolt an das BGE-Fläschchen an, indem Sie das Potential über etwa 15 Sekunden allmählich erhöhen, wobei in der Regel etwa 7,5 Mikroampere Strom über die Trennkapillare erzeugt wird, wobei 1 % Ameisensäure als BGE verwendet wird. Stellen Sie vor jeder Messung die Systemstabilität sicher, indem Sie das TIC-Profil etwa fünf bis 10 Minuten lang überwachen und dann das Trennpotenzial schrittweise auf null Volt absenken.

Pipettieren Sie einen Mikroliter der Acetyl-Kühlstandardlösung in das Injektionsfläschchen und übertragen Sie die Trennkapillare aus dem BGE-Fläschchen in das Injektionsfläschchen. Heben Sie die CE-Injektionsstufe in einer Sekunde um 15 Zentimeter an. Nach 60 Sekunden injizieren Sie hydrodynamisch sechs Nanoliter der Probe in die Trennkapillare.

Übersetzen Sie anschließend die Stufe zurück auf die Ausgangsebenen und schieben Sie das Kapillareinlassende vorsichtig in die BGE. Erhöhen Sie unmittelbar danach die CE-Spannung, um die elektrophoretische Trennung und die EMA-Zustandserfassung zu starten. Sobald das Normal erkannt wurde, stoppen Sie die Datenerfassung und senken Sie die Trennspannung schrittweise auf null Volt.

Ziehen Sie dann den Emitter bis zu zwei Zentimeter von der Öffnung entfernt. Spülen Sie die Trennkapillare fünf Minuten lang, bevor Sie den Zellextrakt analysieren. Messen Sie 10 Nanoliter des Einzelzellextrakts, indem Sie diese Schritte innerhalb von 90 Sekunden wiederholen, um die Probe hydrodynamisch zu injizieren.

Hier ist ein repräsentatives Elektropherogramm des Zellextrakts dargestellt, in dem die Trennung einer Reihe von identifizierten Metaboliten dargestellt ist. 70 verschiedene Signale wurden mit hoher Sicherheit als kleine polare Metaboliten identifiziert, basierend auf der Migrationszeit und den MS/MS-Fragmentierungsmustern der Zellextraktsignale im Vergleich zu denen aus einer Standard- oder Tandem-Massenspektralbibliothek. Die Identifizierung von Metaboliten erfolgt durch den Vergleich der genauen Masse, der Migrationszeit und des Fragmentierungsverhaltens des unbekannten Signals aus der Probe mit dem Metabolitenstandard oder den in einer Metabolitendatenbank verfügbaren Daten.

Dieser Schritt wird für Histidin demonstriert. Hier werden die einzelnen dorsalen Zellen, die mit der Mikrosonde CE-ESI-MS identifiziert und beprobt wurden, im Embryonalstadium mit acht Zellen, 16 Zellen und 32 Zellen gezeigt. Die vielfältige Analyse der identifizierten Metaboliten in den drei verschiedenen Zelltypen deckte unterschiedliche Stoffwechselprofile und komplexe Stoffwechseltrends über die Zellstadien hinweg auf.

Die Hauptkomponentenanalyse der quantitativen Metadaten deckte metabolische Veränderungen auf, da sich eine identifizierte Vorläuferzelle des achtzelligen Embryos im 16-zelligen und 32-zelligen Embryo zu einem Zellklon teilte. Für ausgewählte Metaboliten sind repräsentative Trends dargestellt. Metaboliten wie Acetylcholin nahmen mit der Zellteilung ab, während Trolamin und Serin/Arginin bei diesen Zelltypen gegensätzliche Trends zeigten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik sehr schnell durchgeführt werden, normalerweise in weniger als 10 Sekunden für jede Zelle. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir mit der Kartierung der metabolischen Zellheterogenität im frühen Xenopus laevis Embryo begannen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Mikrosonden-Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur Analyse von Metaboliten in einzelnen embryonalen Zellen verwenden können.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, schnell zu arbeiten, da das Metabolom dynamisch ist und sich die Zellen im sich entwickelnden Embryo schnell teilen. Untersuchen Sie auch analytische Details, um sicherzustellen, dass Daten mit hoher qualitativer Genauigkeit über den Zellstoffwechsel gesammelt werden. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Diagnose lebender Proben, da unser Mikrosonden-Massenspektrometrie-Ansatz schnell funktioniert, minimalinvasiv und mit kleinen Proben kompatibel ist.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie z.B. die Sulfatverfolgung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie den Einfluss von Metaboliten auf die Gewebespezifikation zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Hochspannungsnetzteilen äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das galvanische Trennen von elektrifizierten Schnittstellen getroffen werden sollten.