Automatisierte Messung von Cryptococcus Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, langwierige manuelle Messungen zu automatisieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Kryptokokken zu beantworten, wie z. B. die Beziehung zwischen Kapsel- oder Zellkörpergröße und die verschiedenen Aspekte der Virulenz. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Analyse enormer Probenvolumina ohne Ermüdung ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie der Kryptokokkose, da die Kapsel- und Zellkörpergröße wichtige Aspekte des Erregers sind. Um einen Tusche-Objektträger vorzubereiten, pipettieren Sie zunächst 10 Mikroliter Kryptokokken-Probe auf einen Objektträger. Jeder kreisförmige yi-Stamm mit Arbeit, aber für dieses Experiment war H99 der einzige Stamm, der verwendet wurde.

Pipettieren Sie zwei Mikroliter Tupfen Sie Tuschelfarbe auf die Probe und mischen Sie sie, indem Sie die Pipettenspitze physisch in die Probe schieben und in kreisenden Bewegungen bewegen, bis die Tusche gleichmäßig verteilt erscheint. Legen Sie einen Deckglas über die Probe, indem Sie die linke Kante des Deckglases gegen die Oberfläche des Objektträgers halten. Senken Sie dann die gegenüberliegende Seite des Deckglases vorsichtig und gleichmäßig über die Probe ab.

Lassen Sie die Folie fünf Minuten lang an der Luft trocknen. Tragen Sie dann eine leichte Schicht Nagellack auf den Deckblattrand auf, um eine Versiegelung zu bilden und den Tuschefleck zu erhalten. Um die Proben abzubilden, legen Sie einen Objektträger mit dem Kameraaufsatz und der bekannten Pixel-zu-Mikrometer-Umwandlung unter ein Hellfeldmikroskop

Passen Sie die Filter, Objektive und Kontraste an und stellen Sie sicher, dass das Sichtfeld dicht, aber nicht überbevölkert ist, mit Kryptokokkenzellen mit klarem Kontrast zwischen der Zellkapsel und dem Hintergrund und richtig fokussiert, wobei der Zellkörper als dunkles Band visualisiert wird. Speichern Sie die Bilder nach der Aufnahme in einem einzigen Verzeichnis mit eindeutigen Titeln, da der Messalgorithmus auf Bilder in einem einzigen Verzeichnis ausgeführt wird und die Ausgabedaten nach den Namen der Bilddateien organisiert werden. Nach der Einrichtung des Algorithmus gemäß dem Textprotokoll führen Sie die Anwendung mit einem Doppelklick auf QCA.py aus.

Während Sie die im Programm beschriebenen Schritte befolgen, geben Sie den Erweiterungstyp der Bilddateien ein, dem ein Punkt vorangestellt und der durch Semikolons getrennt ist. Klicken Sie dann auf die Eingabetaste. Wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem sich die Bilddateien befinden, indem Sie auf die Schaltfläche Verzeichnis auswählen klicken, und wählen Sie den Ordner aus, der die Bilder enthält.

Generieren Sie die Liste der Bilddateien im Verzeichnis, indem Sie auf die Schaltfläche Bildliste generieren klicken. Die Bilder werden im Textfeld auf der rechten Seite aufgelistet. Überprüfen Sie die Liste und stellen Sie sicher, dass sie korrekt und vollständig ist.

Wählen Sie als Nächstes ein zufälliges Bild aus der Liste aus, das Sie als Vorschau verwenden möchten, indem Sie auf die Schaltfläche Zufälliges Bild auswählen klicken. Geben Sie dann die Einstellungen für das Mikroskopobjektiv und das Binning ein. Wenn die Standardeinstellungen nicht mit dem verwendeten Mikroskop übereinstimmen, wählen Sie Benutzerdefinierte Pixelkonvertierung und geben Sie die Pixel-zu-Mikrometer-Konvertierung für die Bilddateien ein.

Klicken Sie nach der Auswahl auf die Schaltfläche Umrechnung berechnen und stellen Sie sicher, dass die Umrechnung gemäß dem Textfeld auf der rechten Seite korrekt ist. Um die Algorithmusparameter für die Kreiserkennung einzugeben, geben Sie den minimalen und maximalen Radius, der für die Erkennung der äußeren Kapsel erkennbar ist, als minimale und maximale Kapselradiuseinträge ein. Geben Sie dann den minimalen und maximalen Radius, der für die Zellenkörpererkennung erkennbar ist, als minimale und maximale Zellenkörperradiuseinträge ein.

Verschieben Sie nun die Schieberegler für die Kapsel- und Zellkörperempfindlichkeit, um den Empfindlichkeitsschwellenwert des Algorithmus anzupassen. Eine niedrige Empfindlichkeit ist streng und reduziert die Erkennung falsch positiver Kreise, kann aber auch weniger echte Kreise erkennen. Umgekehrt erhöht eine hohe Empfindlichkeit die Erkennungsrate, kann aber auch zu falsch positiven Kreisen führen.

Maximieren Sie die Anzahl der erkannten Körper und Kapseln und überprüfen Sie visuell, ob die Kreise richtig zu passen scheinen. Die Anzahl der in den erkannten Kapseln wird im Textfeld auf der rechten Seite angezeigt. Andernfalls bearbeiten Sie die Algorithmusparameter, bis die Ergebnisse korrekt sind.

Führen Sie den Erkennungsalgorithmus für das gesamte Verzeichnis der Bilddateien aus, indem Sie auf die Schaltfläche Analyse starten klicken. Jedes Bild wird analysiert und das Programm zeigt Fertig im Textfeld auf der rechten Seite an, wenn alle Bilder analysiert wurden. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Abgleichen und bereinigen.

Dadurch werden die erkannten Zellkörper mit den erkannten Kapseln abgeglichen, in denen sie sich befinden, und der wahre Kapselradius berechnet, indem der Körper von der Kapsel subtrahiert wird. Suchen Sie im Image-Verzeichnis die abgeschlossenen Daten in CleanedOutput. csv-Datei.

Wenn nur ein Datenelement ausgewählt wurde, wird die Datei als CleanedBodies. csv oder CleanedCapsules.csv bezeichnet. Wie hier in dieser mikroskopischen Aufnahme eines Tuschedias zu sehen, sind die Zellen getrennt und in ausreichend geringer Dichte, um das Sichtfeld nicht zu überfordern.

Es wurde auch genügend Beize verwendet, um einen Kontrast zwischen den Zellen und dem Hintergrund zu erzeugen. Der Algorithmus bestimmt einen für jedes Bild eindeutigen Schwellenwert, indem er den durchschnittlichen Intensitätswert nimmt und die Standardabweichung addiert. Pixelintensitäten mit einer Intensität, die höher als der Schwellenwert ist, werden als weiß und mit einer niedrigeren Intensität als schwarz betrachtet.

Der Zellkörper muss als robuster, schwarzer Kreis auf dem weißen Hintergrund der Kapsel dargestellt werden. Die am besten zu verwendende Fokusebene ist eine, in der der Zellkörper als dunkles, konzentriertes Band erscheint. Diese Fokusebene ist als Standard akzeptabel, da sie die Zelle richtig fokussiert.

Dies wurde durch die Visualisierung der Zellwand mit UVITEX bestätigt, einer Art Färbung, die deutlich eine knackige, fokussierte Zellwand mit einem schwachen Signal in der Mitte zeigt. Wenn das Protokoll genau befolgt wird und optimale Bilder erhalten werden, ist der Algorithmus genau und zuverlässig. Wenn das Protokoll jedoch falsch befolgt wird und aufgrund von schlechter Färbung, Überfüllung oder anderen zuvor genannten Parametern suboptimale Bilder erhalten werden, verliert der Algorithmus an Genauigkeit und kann menschliche Messungen nicht rekapitulieren.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, im Voraus ein Gefühl für die Aufnahme optimaler Bilder zu bekommen, damit Sie auf die Aufnahme echter Proben vorbereitet sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kryptokokken-Forschung, um Kapsel- und Zellkörpergrößen in jedem Bildgebungssystem zu erforschen, in dem beide klar sichtbar sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kryptokokkenkapseln und Zellkörper misst. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Kryptokokken äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die grundlegende BSL2-Sicherheit getroffen werden sollten.