Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Durchlässigkeit der Epithelbarriere in menschlichen Darmorganoiden im Laufe der Zeit zu messen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Gastroenterologie zu beantworten, z. B. wie bestimmte Toxine, bakterielle Produkte oder sogar pharmakologische Behandlungen die Durchlässigkeit der Epithelbarriere verändern können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sowohl die Visualisierung als auch die quantitative Messung der Durchlässigkeit der Epithelbarriere in Echtzeit und unter Verwendung von menschlichem Darmepithelgewebe ermöglicht.

Vor der Mikroinjektion von menschlichen Darmorganoiden muss der Mikroinjektor eingerichtet und die Mikrokapillare vorbereitet, installiert und getestet werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Mikrokapillare mit dem Injektionsmaterial zu füllen, tauchen Sie die Spitze der Glasmikrokapillare in die FITC-Dextran-Injektionssuspension und achten Sie darauf, dass die Spitze der Mikrokapillare nicht an der Seite oder am Boden des Röhrchens bricht. Ziehen Sie die Mineralölspritze zurück, um ca. 10 Mikroliter der FITC-Dextran-Suspension in die Mikrokapillare zu ziehen.

Wenn die Mikroinjektionssuspension 90 % der Länge der Glasmikrokapillare ausfüllt, hören Sie auf, die Mikrokapillare zu füllen. Drücken Sie die Spritze leicht zusammen, bevor Sie die Mikrokapillare aus der Mikroinjektionslösung herausziehen, um sicherzustellen, dass die Spitze der Mikrokapillare keine Lufteinschlüsse enthält. Nehmen Sie die humane Darm-Organoid-Kulturplatte aus dem Zellkultur-Inkubator und stellen Sie sie mit dem Mikroinjektor in die Biosicherheitswerkbank um.

Nehmen Sie den Deckel von der Kulturplatte und zentrieren Sie die erste Vertiefung auf dem Mikroskoptisch, so dass sie bei der niedrigsten Vergrößerungseinstellung durch das Okular des Zielfernrohrs gut sichtbar ist. Drehen Sie den Mikromanipulatorarm so, dass die Mikrokapillare in einem Winkel von mehr als 45 Grad relativ zum Mikroskoptisch nach unten in die Kulturvertiefung zeigt. Positionieren Sie die Spitze der Mikrokapillare über der ersten Kulturvertiefung etwa einen Zentimeter über der Oberfläche des Mediums.

Vergewissern Sie sich, dass sowohl die Spitze des Glasfilaments als auch das menschliche Darmorganoid durch das Okular sichtbar sind. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Mikroinjektion besteht darin, die Mikrokapillare sorgfältig mit dem Organoid auszurichten, bevor die Mikroinjektion versucht wird. Und ich empfehle neuen Anwendern immer, mit überschüssigem Taschentuch zu üben, bevor sie ein kritisches Experiment wagen.

Durch Drehen des Drehknopfes für die Z-Achse im Uhrzeigersinn schieben Sie die Mikrokapillare langsam voran. Durchstechen Sie das menschliche Darmorganoid mit der Mikrokapillarspitze. Die äußere Oberfläche des menschlichen Darmorganoids drückt sich leicht ein, wenn die Mikrokapillare beginnt, Druck auszuüben, und springt wieder in ihre Form, wenn die Spitze in das Lumen eindringt.

Wenn es schwierig ist, die Spitze der Mikrokapillare innerhalb des Lumens zu sehen, passen Sie die Beleuchtungs- oder Vergrößerungseinstellungen des Präpariermikroskops an. Wenn die Mikrokapillare korrekt positioniert ist, wobei sich die Spitze der Mikrokapillare in der Nähe der Mitte des menschlichen Darmorganoids befindet, entfernen Sie die Hände von den Bedienelementen des Mikromanipulators. Drücken Sie die mit Mineralöl gefüllte Spritze leicht ein, um die Mikroinjektionslösung aus der Mikrokapillare in das menschliche Darmorganoidlumen zu drücken.

Das menschliche Darmorganoid kann sich leicht ausdehnen, um das Volumen der Injektion aufzunehmen. Wenn die Mikrokapillare über dem Medium positioniert ist, um eine versehentliche Beschädigung der menschlichen Darmorganoide während des Manövrierens zu vermeiden, begeben Sie sich zum nächsten menschlichen Darmorganoid-Ziel. Wechseln Sie zwischen den Behandlungen oder im Falle eines Bruchs die Mikrokapillare.

Lösen Sie die Klemme am Ende des Mikromanipulatorarms und entfernen Sie die Mikrokapillare aus dem Mikropipettenhalter. Um Verbindungen zu testen, die an das apikale Epithel abgegeben werden, sollte diese Verbindung in sterilem PBS resuspendiert werden, das zwei Milligramm pro Milliliter FITC-Dextran enthält. In diesem repräsentativen Experiment re-suspendieren Sie Clostridium-difficile-Toxin TcdA und fügen Sie vor der Mikroinjektion 12,8 Nanogramm pro Mikroliter in PBS hinzu, das FITC-Dextran enthält.

Mikroinjizieren Sie die Verbindung in das menschliche Darmorganoid-Lumen, wie im vorherigen Abschnitt gezeigt. Um Verbindungen zu testen, die nach der Mikroinjektion von FITC-Dextran in das basale laterale Kompartiment abgegeben werden, ersetzen Sie das externe Nährmedium durch neue Medien, die zwei millimolare EGTA als Positivkontrolle, PBS-Vehikel allein als Negativkontrolle oder eine andere experimentelle Verbindung enthalten. Beginnen Sie sofort nach der Mikroinjektion mit der Live-Bildgebung.

Dieses repräsentative Hellfeldbild zeigt ein aus dem Gewebe gewonnenes humanes Darmorganoid nach Mikroinjektion von FITC-Dextran. Das Fluoreszenzsignal ist auch ohne die Verwendung eines speziellen Filtersets erkennbar. Aus Stammzellen gewonnenen humanen Darmorganoiden wurden mit vier Kilodalton FITC-konjugiertem Dextran mikroinjiziert, das in PBS suspendiert war, oder PBS, das Clostridium difficile-Toxin TcdA enthielt.

Als Positivkontrolle wurde EGTA in einer Untergruppe von menschlichen Darmorganoiden, die mit PBS und FITC-Dextran injiziert wurden, zu den Kulturmedien der menschlichen Darmorganoide zugesetzt. Die menschlichen Darmorganoide wurden 20 Stunden lang abgebildet. Wie diese Bilder zeigen, behielten menschliche Darmorganoide, die mit PBS injiziert wurden, fast das gesamte Fluoreszenzsignal bei, das bei T Null vorhanden war.

Menschliche Darmorganoide, die ebenfalls mit TcdA injiziert oder mit EGTA behandelt wurden, zeigten jedoch acht Stunden nach der Mikroinjektion eine erhebliche Abnahme der Fluoreszenzintensität. Die Bildgebungsdaten wurden für alle menschlichen Darmorganoide zu allen Zeitpunkten quantifiziert, um einen hochauflösenden Datensatz zu erhalten, der die relative Änderung der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit unter jeder experimentellen Bedingung darstellt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie je nach Anzahl der Versuchsbedingungen in etwa 30 Minuten bis zu einer Stunde durchgeführt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, geduldig zu sein und sich Zeit zu nehmen, wenn Sie die menschlichen Darmorganoide vor der Mikroinjektion mit der Mikrokapillare ausrichten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie PCR, Western Blot und RNA-Suche durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Reaktion des menschlichen Darmorganoids auf das injizierte Material zu beantworten. Die Entwicklung dieser Technik ermöglichte es uns, die Auswirkungen von bakteriellen Toxinen, pharmakologischen Wirkstoffen, Zytokinen und sogar lebenden Mikroorganismen auf die Funktion der Epithelbarriere in menschlichen Darmorganoiden zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszenzmarkiertes Dextran und andere experimentelle Materialien in das Lumen eines menschlichen Darmorganoids mikroinjiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit bakteriellen Toxinen oder lebenden Organismen äußerst gefährlich sein kann, weshalb bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter PSA getroffen werden sollten. Und zu guter Letzt sollten Sie besonders darauf achten, Stichwunden zu vermeiden, da die Mikrokapillaren extrem scharf sind.