Name: Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Lernen Sie die Echtzeitmessung der epithelialen Barrierepermeabilität in menschlichen Darmorganoiden mittels FITC-Dextran-Mikroinjektion und Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Permeabilitätsänderungen durch Pharmaka.

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Die Autoren möchten DRS. Stephanie Spohn und Basel Abuaita für viele nützliche Diskussionen über organoide Mikroinjektion danken. JRS wird vom Darm Stem Cell Consortium (U01DK103141), eine Kooperative Forschungsprojekt finanziert durch das National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Niere-Krankheiten (NIDDK) und National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) unterstützt. JRS und VBY werden durch den Roman NIAID, Alternative Modellsysteme für enterischen Erkrankungen (NAMSED) Consortium (U19AI116482) unterstützt. DRH unterstützt die Mechanismen der mikrobiellen Pathogenese Training Zuschuss von National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (NIAID, T32AI007528) und der klinischen und translationalen Science Award an der Michigan-Institut für klinische und Gesundheit Forschung (UL1TR000433).
Die komplette Datendateien und Daten-Analyse-Code verwendet in dieser Handschrift sind an https://github.com/hilldr/HIO_microinjection erhältlich.

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt finanzielle oder sonstige Interessenkonflikte offen zu legen.

Dieses Protokoll stellt eine allgemeine Methode für die Mikroinjektion von Chios hPSC abgeleitet und Darm Organellen Gewebe abgeleitet und die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit. Wir haben auch unser Ansatz zur Analyse und Interpretation der Daten generiert, mit Hilfe dieser Methoden gezeigt. Angesichts der wachsenden Annahme Darm Organellen Modellsysteme16,20,21,28 und das langjährige Interesse an Darmbarriere Durchlässigkeit als physiologisch relevanten funktionellen Ergebnis3,4,5,6, erwarten wir, dass andere auf diesem Gebiet tätig werden können anwenden und auf diese Methoden aufbauen.
Es gibt mehrere Schritte, die für die Anwendung dieser Technik entscheidend sind. Zugang zu qualitativ hochwertigen hPSC- oder Gewebe abgeleiteten HIO Gewebe vor umfangreiche Experimente mit Mikroinjektion geschaffen werden sollte. HIO Makrostruktur möglicherweise heterogen, mit Variationen in Größe und Form, obwohl Gewebe Identität und zellulären Morphologie ist sehr reproduzierbar, bei der Verwendung von etablierten Methodik um Chios24zu generieren. Sphärische Chios, bestehend aus einer einzigen halbtransparenten Lumen und messen ca. 1 mm im Durchmesser sind ideal für Mikroinjektion und Messung der luminalen Fluoreszenz in Echtzeit. In einigen Fällen fehl, Mikroinjektion zu einem Zusammenbruch der HIO oder offensichtliche Undichtigkeit des injizierten Materials. Gescheiterten Chios können die Kultur gut Ermessen des Benutzers mithilfe einer standard Mikropipette entnommen werden. Auswahl von Chios für Mikroinjektion und Bildgebung der Objektive auf einer imaging Plattform berücksichtigen. Im Allgemeinen 2-4 X Objektive sind ideal für die Erfassung der kompletten HIO Fluoreszenzsignal, obwohl ein 10 X-Objektiv verwendet werden kann, wenn low-Power-Objektive nicht verfügbar sind oder die verfügbaren Chios sind &#60; 1 mm im Durchmesser. Imaging-Software darf für die automatisierte Erfassung von fluoreszierenden Bilder an definierten Stellen im Laufe der Zeit.
Mehrere Änderungen dieses Protokolls sind möglich, um die experimentellen Anforderungen anzupassen. Zum Beispiel die Ergebnisse der Barriere Funktionstests der Molekülgröße der Verbindungen im Einsatz43 abhängig gemacht werden und es kann zweckmäßig sein, Dextran-Vorbereitungen von unterschiedlichem Molekulargewicht zu testen. Darüber hinaus kann Hellfeld Bildgebung zusätzlich Fluoreszenz-Bildgebung als Indikator für die strukturelle Integrität der Gewebe25durchgeführt werden. Bei der Mikroinjektion von lebender Bakterien25,28,31,32,33,44ggf. Penicillin hinzufügen und Streptomycin oder Gentamicin HIO Kultur Medien vor oder nach Mikroinjektion. Außen an der Microcapillary wird bei der Befüllung mit der Bakterienkultur Aussetzung kontaminiert werden und dies kann den HIO Medien übertragen werden. Alternativ kann Mikroinjektion erfolgen auf Chios im extrazellulären Matrix (z. B. Matrigel) ohne Medien ausgesetzt die Medien hinzufügen, nachdem die Mikroinjektion abgeschlossen ist. Dies kann Kontamination der extrazellulären Matrix und Außenseite der HIO einschränken. Bei der Planung von mikrobiellen Wachstums Assays es möglicherweise notwendig, Antibiotika in den Medien nach 1-2 h zu vermeiden, verlangsamt oder verhindert Wachstum von mikroinjiziert Organismen zu entfernen.
Schließlich ist in der Erkenntnis, dass nicht alle Forscher auf Mikroskopie Ausrüstung geeignet für in-vitro- Bildgebung zugreifen können, es wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Anweisungen in diesem Protokoll für die Fluoreszenz Datenerhebung auf Bilder angewendet werden können an festen Zeitpunkten mit standard Epifluorescent Mikroskopie ohne automatische Bildaufnahme oder Umweltkontrolle. Beispiele dafür finden Sie in den Berichten von Leslie und Huang Et al. 25, die C. Difficile Toxin Aktivität im Darm Organellen hPSC abgeleitet und Karve und Pradan Et Al. untersuchten 44, die epitheliale Barriere Permeabilität in ähnlichen hPSC abgeleitet Darm Organellen mikroinjiziert mit live E. Coliuntersucht. Manuelle Bedienung der bildgebenden Geräten führen größere Variation und Schwierigkeiten bei der Normalisierung der Fluoreszenzsignal. Bei der Durchführung manueller Bildgebung der FITC-Dextran Chios injiziert unbedingt feste Vergrößerung, fluoreszierende Anregung Intensität und Belichtungszeiten während das Experiment nicht zu verfälschen die Fluoreszenz Intensität Messungen zu gewährleisten.

Das Darmepithel bildet eine selektive Barriere, die den gerichteten Transport von Nährstoffen, H2O, Ionen und Abfallprodukte vermittelt bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Diffusion-vermittelten Austausch von andere Partikel zwischen Lumen und der mesenchymale Gewebe oder Blut Versorgung1,2. Die unspezifische Durchlässigkeit der intestinalen epithelialen Barriere galt lange Zeit einen wichtigen funktionelle Parameter in Gesundheit und Krankheit3,4,5,6, das spiegelt die Rate der Verbreitung von kleinen Molekülen über das Epithel über den parazellulär Platz. Messung der epitheliale Barriere Permeabilität kann durchgeführt werden, Tiermodelle7 und in menschlichen Patienten8 durch die Einnahme von Lactulose, hat keine spezifischen Transporter in den Magen-Darm-Trakt und die anschließende Sammlung und Messung von Lactulose Konzentrationen im peripheren Blut. Alternative eingenommen Marker der Barrierefunktion wie Eindringmittel beschrifteten Kohlenhydrate sind auch verfügbar9,10. Dieser Ansatz wurde angepasst für intestinale epitheliale Zellkulturen auf Transwell unterstützt11, einen vereinfachten Ansatz, ermöglicht eine bessere Kontrolle der experimentellen aber auch als schlechter Prädiktor für in Vivo kritisiert worden, angebaut Durchlässigkeit aufgrund des Fehlens von differenzierten epithelialen Subtypen und Gewebe Struktur12. Mit Kammern stellen einen weiteren Ansatz dar und ermöglichen die Messung der epitheliale Barriere-Funktion im ganzen Darmschleimhaut Ex Vivo13. Anwendung dieser Technik wird häufig durch Gewebe Verfügbarkeit und Zustand13,14begrenzt. Daher sind neue Methoden, die Reproduzierbarkeit und Durchsatz mit physiologische Relevanz Gleichgewicht notwendig.
Jüngste Entwicklungen in in-vitro- Organogenese führten zu die Annahme von 3D Gewebekultur Modellsysteme als eine anspruchsvolle Plattform für Rekapitulation der Dynamik von komplexen Gewebe15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. Vor allem menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) abgeleitet menschlichen Darm Organellen (Chios)19,24 entstanden als reproduzierbar und experimentell gefügig Modellsystem für die Untersuchung von Host-mikrobielle Wechselwirkungen und epitheliale Barriere Dynamik25,26,27,28. In ähnlicher Weise menschliche Gewebe-abgeleitete Organellen (auch bekannt als Enteroids) können aus einem einfachen Biopsie-Verfahren abgeleitet werden und können als gefügig System verwendet werden, um die menschliche Physiologie und Krankheit15,29,30studieren. Mikroinjektion der menschliche Darm Organellen ermöglicht die Lieferung von experimentellen Verbindungen25 oder Mikroben25,31,32,33 , die apikale epithelialen live Oberfläche des organoide Lumen. Leslie und Huang Et al. 25 angepasst vor kurzem diese Technik zur Messung der Barriere Permeabilität in Chios mit Fluorescein erfolgt (FITC) Dextran nach Exposition gegenüber bakteriellen Toxinen beschriftet mikroinjiziert.
Dieses Protokoll dient als Leitfaden für die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Chios hPSC abgeleitet und Gewebe abgeleitet Chios mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Mit geringfügigen Änderungen kann es auch als eine allgemeine Einführung in die Mikroinjektion von Chios mit experimentellen Verbindungen dienen. Benutzer können dieses Protokoll mit zusätzliche oder alternative downstream-Anwendungen nach Mikroinjektion ergänzen.

<table><tbody><tr><td>EGTA 0,5 M steril (pH 8,0)</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>Zellmatrixlösung (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision RT Lebendzell-Bildgebungssystem</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr> <tr><td>Kamera</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Im Lieferumfang des Deltavision-Systems</td></tr><tr><td>enthalten softWoRx Imaging-Software</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Im Lieferumfang des Deltavision-Systems</td></tr><tr><td>enthalten Biosicherheitswerkbank</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+</td><td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>Bestandteil von ENR-Medien; siehe McCraken et al. 24</sup</td></tr><tr><td>>B27 supplement (50X)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Bestandteil von ENR-Medien; siehe McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>L-Glutamin (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Bestandteil von ENR-Medien; siehe McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>HEPES-Puffer</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td>Bestandteil von ENR-Medien; siehe McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhalter</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>Alternative zum Xenoworks Pipettenhalter</td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer</td><td>Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Präparierfernrohr</td><td>Olympus</td><td>SX61</td><td>Empfohlenes Zielfernrohr, obwohl andere Modelle wahrscheinlich kompatibel sind</td></tr><tr><td>Olympus IX71 Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Im Lieferumfang des Deltavision-Systems</td></tr><tr><td>enthalten CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrie</td><td>29065728</td><td>Im Lieferumfang des Deltavision-Systems</td></tr><tr><td>enthalten Rekombinantes C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td><td>R& D Systems</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>F& T D Systems</td><td>236-EG</td><td>Komponente von ENR-Medien; siehe McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>4645-RS</td><td>Komponente von ENR-Medien; siehe McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td>Bestandteil von ENR-Medien; siehe McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dextran (4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Kammer-Objektträger</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>Glasfilamente</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenhalter</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>Bevorzugtes Gerät</td></tr><tr><td>Analog Schlauchsatz</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 in Klarsichthülse</td><td>Xenoworks</td><td>V001104</td><td></td></tr><tr><td>1-1,2 mm O-Ring</td><td>Xenoworks</td><td>V300450</td><td></td></tr></tbody></table>

echtzeitmessung der epitheliale barriere permeabilität im menschlichen darm organellen

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Fortschritte in der 3D Culture der intestinalen Gewebe durch Biopsie gewonnen oder aus pluripotenten Stammzellen über gezielte Differenzierung generiert haben dazu geführt, dass anspruchsvolle in-vitro- Modelle der Darmschleimhaut. Nutzt diese aufstrebenden Modellsysteme erfordert Anpassung der Werkzeuge und Techniken für 2D Kultur-Systeme und Tiere entwickelt. Hier beschreiben wir eine Technik zur Messung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen in Echtzeit. Dies geschieht durch Mikroinjektion von Eindringmittel beschriftet Dextran und Bildgebung auf einem inversen Mikroskop mit Epifluorescent Filter ausgestattet. Echtzeit-Messung der Durchlässigkeit Barriere im Darm Organellen erleichtert die Generation der hochauflösenden Zeitdaten im menschlichen Darm Epithelgewebe, obwohl diese Technik auch auf festen Timepoint imaging Ansätze angewendet werden kann. Dieses Protokoll ist leicht anpassbar für die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität nach Exposition gegenüber pharmakologische Agenten, Bakterienprodukte oder Giftstoffe oder lebenden Mikroorganismen. Mit geringfügigen Änderungen dieses Protokolls dient auch als eine allgemeine Einführung in die Mikroinjektion der intestinalen Organellen und Benutzer können beschließen, dieses Protokoll durch zusätzliche oder alternative downstream-Anwendungen nach Mikroinjektion zu ergänzen.

Chios wurden aus menschlicher pluripotenter Stammzellen differenziert und kultiviert in Zelle Matrixlösung wie zuvor beschrieben19,24. Nach 4 Wochen in Kultur hatte die Chios ausreichend erweitert, um für die Mikroinjektion zu ermöglichen. Chios wurden mit 4 kDa konjugiert FITC Dextran in PBS oder PBS mit Clostridium Difficile Toxin TDCA suspendiert mikroinjiziert. C. Difficile ist ein opportunistischer Magen-Darm-Erreger, das Toxin-vermittelte epitheliale Toxizität in Chios25aufweist. Als Positivkontrolle wurde die HIO Kulturmedien in einer Teilmenge von Chios injiziert mit PBS und FITC-Dextran EGTA hinzugefügt. EGTA ist ein Kalzium-Chelator, die schnelle de-Polymerisation der Aktin-Zytoskelett-42verursacht. FITC Fluoreszenz wurde auf dem live imaging Mikroskop innerhalb einer kontrollierten Klimakammer in Echtzeit überwacht und Aufnahmen wurden in 10-Minuten-Takt.
Post-hoc-Analyse der Bilddaten ergab erhebliche Unterschiede in der Beibehaltung der FITC Fluoreszenz (Abbildung 5). Chios mit PBS injiziert erhalten fast alle das Fluoreszenzsignal bei t = 0, aber Chios, die auch mit TDCA von mit EGTA behandelt injiziert wurden eine erhebliche Abnahme der Fluoreszenz Intensität von 8 Stunden nach Mikroinjektion (Abbildung ausgestellt 5a). Imaging-Daten wurden für alle Chios zu allen Zeitpunkten eine hochauflösende Dataset repräsentiert die relative Änderung in Fluoreszenz Intensität im Laufe der Zeit in jeder Versuchsbedingung (Abb. 5 b) generieren quantifiziert. Unterschiede in der epithelialen Durchlässigkeit ausgewertet durch Berechnung der mittleren Beseitigung Zeit (t1/2 ) der FITC für jede Behandlungsgruppe (Tabelle 1) und vergleichen Unterschiede in t t1/2 mit der Student t-test. Kontrolle-behandelten Chios behielt die Mehrheit der FITC Fluoreszenzsignal für mehr als 16 Stunden (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Behandlung mit EGTA deutlich reduziert FITC-Dextran Beseitigung Zeit relativ zum Steuerelement Chios (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). In Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Ergebnisse25, Mikroinjektion TDCA deutlich erhöht epitheliale Barriere Permeabilität gegenüber Kontrollbehandlung (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). So sind externe (EGTA) und mikroinjiziert (TDCA) Verbindungen in der Lage, wesentliche Veränderungen in epitheliale Barriere Permeabilität in Chios induzieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Auswirkungen einer breiten Palette von pharmakologische Agenten, Metaboliten, Bakterienprodukte, Zytokine, Wachstumsfaktoren und anderen Verbindungen auf epitheliale Barriere-Funktion mit diesem Ansatz bewertet werden können.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Behandlung</td>
			<td>Half-Life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Untere 95 % CI (h)</td>
			<td>Obermaterial 95 % CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrolle</td>
			<td>17.11.</td>
			<td>0,3</td>
			<td>16.45 Uhr</td>
			<td>17,78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2,58</td>
			<td>0,19</td>
			<td>1,78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDCA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5,93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: meine Beseitigung Zeit (t1/2) FITC-Dextran in Chios mit EGTA oder TDCA behandelt. Einheiten sind Stunden Post-Mikroinjektion.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Grundlayout einer Microinjector und Mikromanipulator für HIO Mikroinjektion. Dieses Bild zeigt die komplette Ergänzung der Ausrüstung für die Durchführung der Mikroinjektion von Chios verwendet. Schlüsselkomponenten sind beschriftet und Bestellinformationen finden Sie in der Materialtabelle. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Mikropipette Puller. Das Kupfer Heizung Spule Hc, Spannfinger c1, untere Klemme (c2), Abzieher Arm (Pa), Hitze Auswahl ein/aus (ht) sind durch die Pfeile gekennzeichnet. Die richtige Einstellung für HEAT 1 und ziehen sind in roter Schrift gekennzeichnet. Der Inset zeigt eine richtig montierte Glas-Filament für Heizung bereit. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Abbildung 3: repräsentative Bilder von einem Gewebe abgeleitet HIO injiziert mit FITC-Dextran. (A) Bild zeigt die Positionierung der Glas-Microcapillary kurz vor dem Einsetzen in die HIO und Mikroinjektion. (B) Hellfeld-Bild von einem Gewebe abgeleitet menschlichen Darm Organellen nach Mikroinjektion der FITC-Dextran. Beachten Sie, dass das Fluoreszenzsignal offensichtlich auch ohne die Verwendung eines bestimmten Filter-Sets ist. Diese Färbung hilft Mikroinjektion Präzision. 3 X Vergrößerung <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Live-imaging Workflow. (A) Screenshot zeigt die notwendigen Schritte zur Mikroskop parametrisieren, die Chios auf der Folie zu finden und speichern Sie die Position der Bühne für jede HIO, abgebildet werden. (B) Pre-Imaging-Einstellungen für die Erfassung des FITC-Kanals in regelmäßigen Abständen an die Positionen jeweils angegeben in A. (C) Post-Imaging-Export von Daten im DV-Format Dateien als TIFF-Bilder mit einem TIFF-Bild pro HIO pro Zeitpunkt.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Abbildung 5: repräsentative Ergebnisse. (A) Stammzellen abgeleitet menschlichen Darm Organellen (HIO) mit 2 mg/mL FITC-Dextran mikroinjiziert (4 kDa) für 20 Stunden abgebildet. Chios wurden auch mit PBS (Kontrolle) oder Clostridium Difficile Toxin TDCA mikroinjiziert (12,8 ng/µL) oder mit 2 mM EGTA, um die externe Kultur Medien hinzugefügt behandelt. 4 X Vergrößerung. (B) Grundstück mittlere normalisierte FITC-Intensität im Laufe der Zeit in Chios behandelt mit PBS (Kontrolle), TDCA oder EGTA. Fehlerbalken darzustellen S.E.M und n = 11 Chios (Control), 3 Chios (EGTA), 6 Chios (TDCA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Durchlässigkeit der Epithelbarriere in menschlichen Darmorganoiden im Laufe der Zeit zu messen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Gastroenterologie zu beantworten, z. B. wie bestimmte Toxine, bakterielle Produkte oder sogar pharmakologische Behandlungen die Durchlässigkeit der Epithelbarriere verändern können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sowohl die Visualisierung als auch die quantitative Messung der Durchlässigkeit der Epithelbarriere in Echtzeit und unter Verwendung von menschlichem Darmepithelgewebe ermöglicht.Vor der Mikroinjektion von menschlichen Darmorganoiden muss der Mikroinjektor eingerichtet und die Mikrokapillare vorbereitet, installiert und getestet werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Mikrokapillare mit dem Injektionsmaterial zu füllen, tauchen Sie die Spitze der Glasmikrokapillare in die FITC-Dextran-Injektionssuspension und achten Sie darauf, dass die Spitze der Mikrokapillare nicht an der Seite oder am Boden des Röhrchens bricht. Ziehen Sie die Mineralölspritze zurück, um ca. 10 Mikroliter der FITC-Dextran-Suspension in die Mikrokapillare zu ziehen.Wenn die Mikroinjektionssuspension 90 % der Länge der Glasmikrokapillare ausfüllt, hören Sie auf, die Mikrokapillare zu füllen. Drücken Sie die Spritze leicht zusammen, bevor Sie die Mikrokapillare aus der Mikroinjektionslösung herausziehen, um sicherzustellen, dass die Spitze der Mikrokapillare keine Lufteinschlüsse enthält. Nehmen Sie die humane Darm-Organoid-Kulturplatte aus dem Zellkultur-Inkubator und stellen Sie sie mit dem Mikroinjektor in die Biosicherheitswerkbank um.Nehmen Sie den Deckel von der Kulturplatte und zentrieren Sie die erste Vertiefung auf dem Mikroskoptisch, so dass sie bei der niedrigsten Vergrößerungseinstellung durch das Okular des Zielfernrohrs gut sichtbar ist. Drehen Sie den Mikromanipulatorarm so, dass die Mikrokapillare in einem Winkel von mehr als 45 Grad relativ zum Mikroskoptisch nach unten in die Kulturvertiefung zeigt. Positionieren Sie die Spitze der Mikrokapillare über der ersten Kulturvertiefung etwa einen Zentimeter über der Oberfläche des Mediums.Vergewissern Sie sich, dass sowohl die Spitze des Glasfilaments als auch das menschliche Darmorganoid durch das Okular sichtbar sind. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Mikroinjektion besteht darin, die Mikrokapillare sorgfältig mit dem Organoid auszurichten, bevor die Mikroinjektion versucht wird. Und ich empfehle neuen Anwendern immer, mit überschüssigem Taschentuch zu üben, bevor sie ein kritisches Experiment wagen.Durch Drehen des Drehknopfes für die Z-Achse im Uhrzeigersinn schieben Sie die Mikrokapillare langsam voran. Durchstechen Sie das menschliche Darmorganoid mit der Mikrokapillarspitze. Die äußere Oberfläche des menschlichen Darmorganoids drückt sich leicht ein, wenn die Mikrokapillare beginnt, Druck auszuüben, und springt wieder in ihre Form, wenn die Spitze in das Lumen eindringt.Wenn es schwierig ist, die Spitze der Mikrokapillare innerhalb des Lumens zu sehen, passen Sie die Beleuchtungs- oder Vergrößerungseinstellungen des Präpariermikroskops an. Wenn die Mikrokapillare korrekt positioniert ist, wobei sich die Spitze der Mikrokapillare in der Nähe der Mitte des menschlichen Darmorganoids befindet, entfernen Sie die Hände von den Bedienelementen des Mikromanipulators. Drücken Sie die mit Mineralöl gefüllte Spritze leicht ein, um die Mikroinjektionslösung aus der Mikrokapillare in das menschliche Darmorganoidlumen zu drücken.Das menschliche Darmorganoid kann sich leicht ausdehnen, um das Volumen der Injektion aufzunehmen. Wenn die Mikrokapillare über dem Medium positioniert ist, um eine versehentliche Beschädigung der menschlichen Darmorganoide während des Manövrierens zu vermeiden, begeben Sie sich zum nächsten menschlichen Darmorganoid-Ziel. Wechseln Sie zwischen den Behandlungen oder im Falle eines Bruchs die Mikrokapillare.Lösen Sie die Klemme am Ende des Mikromanipulatorarms und entfernen Sie die Mikrokapillare aus dem Mikropipettenhalter. Um Verbindungen zu testen, die an das apikale Epithel abgegeben werden, sollte diese Verbindung in sterilem PBS resuspendiert werden, das zwei Milligramm pro Milliliter FITC-Dextran enthält. In diesem repräsentativen Experiment re-suspendieren Sie Clostridium-difficile-Toxin TcdA und fügen Sie vor der Mikroinjektion 12,8 Nanogramm pro Mikroliter in PBS hinzu, das FITC-Dextran enthält.Mikroinjizieren Sie die Verbindung in das menschliche Darmorganoid-Lumen, wie im vorherigen Abschnitt gezeigt. Um Verbindungen zu testen, die nach der Mikroinjektion von FITC-Dextran in das basale laterale Kompartiment abgegeben werden, ersetzen Sie das externe Nährmedium durch neue Medien, die zwei millimolare EGTA als Positivkontrolle, PBS-Vehikel allein als Negativkontrolle oder eine andere experimentelle Verbindung enthalten. Beginnen Sie sofort nach der Mikroinjektion mit der Live-Bildgebung.Dieses repräsentative Hellfeldbild zeigt ein aus dem Gewebe gewonnenes humanes Darmorganoid nach Mikroinjektion von FITC-Dextran. Das Fluoreszenzsignal ist auch ohne die Verwendung eines speziellen Filtersets erkennbar. Aus Stammzellen gewonnenen humanen Darmorganoiden wurden mit vier Kilodalton FITC-konjugiertem Dextran mikroinjiziert, das in PBS suspendiert war, oder PBS, das Clostridium difficile-Toxin TcdA enthielt.Als Positivkontrolle wurde EGTA in einer Untergruppe von menschlichen Darmorganoiden, die mit PBS und FITC-Dextran injiziert wurden, zu den Kulturmedien der menschlichen Darmorganoide zugesetzt. Die menschlichen Darmorganoide wurden 20 Stunden lang abgebildet. Wie diese Bilder zeigen, behielten menschliche Darmorganoide, die mit PBS injiziert wurden, fast das gesamte Fluoreszenzsignal bei, das bei T Null vorhanden war.Menschliche Darmorganoide, die ebenfalls mit TcdA injiziert oder mit EGTA behandelt wurden, zeigten jedoch acht Stunden nach der Mikroinjektion eine erhebliche Abnahme der Fluoreszenzintensität. Die Bildgebungsdaten wurden für alle menschlichen Darmorganoide zu allen Zeitpunkten quantifiziert, um einen hochauflösenden Datensatz zu erhalten, der die relative Änderung der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit unter jeder experimentellen Bedingung darstellt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie je nach Anzahl der Versuchsbedingungen in etwa 30 Minuten bis zu einer Stunde durchgeführt werden.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, geduldig zu sein und sich Zeit zu nehmen, wenn Sie die menschlichen Darmorganoide vor der Mikroinjektion mit der Mikrokapillare ausrichten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie PCR, Western Blot und RNA-Suche durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Reaktion des menschlichen Darmorganoids auf das injizierte Material zu beantworten. Die Entwicklung dieser Technik ermöglichte es uns, die Auswirkungen von bakteriellen Toxinen, pharmakologischen Wirkstoffen, Zytokinen und sogar lebenden Mikroorganismen auf die Funktion der Epithelbarriere in menschlichen Darmorganoiden zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszenzmarkiertes Dextran und andere experimentelle Materialien in das Lumen eines menschlichen Darmorganoids mikroinjiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit bakteriellen Toxinen oder lebenden Organismen äußerst gefährlich sein kann, weshalb bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter PSA getroffen werden sollten. Und zu guter Letzt sollten Sie besonders darauf achten, Stichwunden zu vermeiden, da die Mikrokapillaren extrem scharf sind.

real-time-measurement-epithelial-barrier-permeability-human

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von exzidierten Darmgewebepräparaten oder "Darmsäcken" als ex vivo Modell der Darmbarrierefunktion. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Integrität sowohl der Epithelbarriere als auch der Schleimhautgelschicht an spezifischen Darmstellen in Tiermodellen für Verdauungserkrankungen zu beurteilen.

Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit

Zwei Methoden werden hier vorgestellt, um intestinale Barrierefunktion zu bestimmen. Eine epitheliale Meter (Volt/Ohm) dient zur Messung des elektrischen Widerstands berührt der kultivierten Epithelien direkt in Gewebekultur Brunnen. Bei Mäusen ist die FITC-Dextran-Magensonde-Methode zur Ermittlung der intestinalen Permeabilität in Vivo.

In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen

Hier beschreiben wir eine Technik zur Quantifizierung der Barriereintegrität kleiner Darmorganoide. Die Tatsache, dass die Methode auf lebenden Organoiden basiert, ermöglicht die sequenzielle Untersuchung verschiedener Barriereintegritätsmodulisierungssubstanzen oder Kombinationen davon in einer zeitaufgelösten Weise.

Untersuchung des Darmbarriereabbaus bei lebenden Organoiden

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung von Enteroiden, einem dreidimensionalen Darmmodell, aus fetalem Darmgewebe. Immunfluoreszierende Bildgebung von epithelialen Biomarkern wurde zur Modellcharakterisierung verwendet. Die apikale Exposition von Lipopolysacchariden, einem bakteriellen Endotoxin, induzierte die epitheliale Permeabilität in einer dosisabhängigen Weise, gemessen durch das Austreten von fluoreszierendem Dextran.

Testen der Epithelpermeabilität in fetalen Gewebe-abgeleiteten Enteroiden

Das vorliegende Protokoll skizziert eine Methode, die Luzifergelb in einem apikalen enteroiden Modell verwendet, um die Darmpermeabilität zu bestimmen. Diese Methode kann verwendet werden, um die parazelluläre Permeabilität in Enteroiden zu bestimmen, die entzündliche Darmerkrankungen wie nekrotisierende Enterokolitis modellieren.

Bestimmung der Darmpermeabilität mit Lucifer Yellow in einem apikalen enteroiden Modell

Diese Studie stellt ein Protokoll zur Generierung von 2D-Monoschichten des Rinderdarms aus Organoiden vor, das einen verbesserten Zugang zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen bietet. Es umfasst Methoden zur Bewertung der Membranintegrität und -funktionalität und entwickelt In-vitro-Modelle weiter, die die Magen-Darm-Physiologie von Rindern nachahmen. Dieser Ansatz verspricht erhebliche biomedizinische und landwirtschaftliche Vorteile, einschließlich verbesserter Behandlungsstrategien.

Fortschritte in der Rinder-Organoid-Technologie unter Verwendung von Dünn- und Dickdarm-Monolayer-Grenzflächen

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Das Protokoll in dieser Studie präsentierten beschreibt Verfahren zur Echtzeit-Überwachung der Reprogrammierung Progression über die kinetische Messung von positiven und negativen pluripotenten Stammzellmarker Durchflusszytometrie-Analyse. Das Protokoll enthält auch die Imaging-basierte Beurteilung der Morphologie und Marker oder Reporter-Expression während der iPS-Generation.

Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

Lernen Sie die Echtzeitmessung der epithelialen Barrierepermeabilität in menschlichen Darmorganoiden mittels FITC-Dextran-Mikroinjektion und Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Permeabilitätsänderungen durch Pharmaka.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

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