Name: Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Erfahren Sie die klonale Analyse hämatopoietischer Stammzellvorläufer in der embryonalen Entwicklung mit Index-Sorting und Endothelzell-Co-Kultur. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Einzelzellen und deren Einpflanzungspotenzial.

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Wir möchten danken Andrew Berger, Stacey Dozono und Brian Raden im Fred Hutchinson Flow Cytometry Kern für Hilfe mit FACS. Diese Arbeit wurde von den nationalen Instituten der Gesundheit NHLBI UO1 Grant #HL100395, unterstützt zusätzliche kollaborative Grant #HL099997 und NIDDK gewähren #RC2DK114777. Brandon Hadland wird von Alex es Lemonade Stand Foundation und Hyundai Hope auf Rädern-Stiftung unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Studie der HSC Genesis während der embryonalen Entwicklung erfordert Mittel, HSC Potenzial in Hemogenic Vorläufer noch fehlt die Kompetenz zur langfristigen multilineage hämatopoetischen Rekonstitution bei transplantierten Erwachsenen Empfängern zur Verfügung stellen zu erkennen. In diesem Protokoll präsentieren wir einen klonalen Assay der embryonalen Hemogenic Vorläufer von Stromazellen kokultur auf vaskuläre Nische ECs aus der Jahreshauptversammlung, die die Reifung der Vorläufer des HSC unterstützt, mit anschließ...

Klonale Untersuchungen ergaben Heterogenität in den langfristigen Engraftment Eigenschaften des Erwachsenen HSCs, neue Einblicke in HSC-Subtypen und Änderungen im HSC Verhalten während der Alterung1. Jedoch ähnliche Studien der embryonalen HSCs und deren Vorstufen schwieriger gewesen. Während der frühen Embryonalentwicklung HSCs ergeben sich aus einer Bevölkerung von Vorläuferstoffen gemäß Hemogenic Endothel in einem vorübergehenden Prozess bekannt als die endotheliale hämatopoetischen Übergang2. Die ersten HSC, definiert durch ihre Fähigkeit, stabile, langfristige multilineage Engraftment nach Transplantation in konditionierten Erwachsenen Empfänger werden nicht erkannt, erst nach embryonalen Tag 10.5 (E10.5) in der murinen Embryo bei sehr niedrigen Frequenz3 . Während ihrer Entwicklung müssen Vorläufer des HSC (Pre-HSC) aus Hemogenic Endothel unterziehen Reifung vor dem Immobilienerwerb von Erwachsenen HSC die ermöglichen effiziente Engraftment Transplantation Assays4,5 , 6. verdeckt das Studium der seltenen HSC Herkunft, eine Vielzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit erythroiden, myeloischen und lymphatischen Potenzial werden schon vor der Entstehung des HSC von Pre-HSC7,8erkannt. Pre-HSC von anderen hämatopoetischen Vorläuferzellen zu unterscheiden erfordert daher Methoden klonal Zellen zu isolieren und Ihnen mit den Signalen ausreichend für ihre Reifung, HSC, um ihre Engraftment Eigenschaften in Transplantation Assays zu erkennen.
Eine Reihe von Ansätzen sind beschrieben worden, die für den Nachweis von Pre-HSC von ex-Vivo oder in Vivo Reifung, HSC ermöglichen. Ex-Vivo -Methoden sind angewiesen, auf die Kultur der embryonalen Gewebe, wie z. B. der AGM-Region, wo die ersten HSC in Entwicklung9erkannt werden. Aufbauend auf diese Methoden, Protokolle, die die Dissoziation zu integrieren haben sortieren und Re-Aggregation von AGM Geweben die Charakterisierung der sortierten Populationen mit HSC Vorläufer bei der Entwicklung von E9.5 zu E11.5 in der Para-aortalen zulässig Splanchnopleura (P-Sp) / AGM Regionen4,5,10; Allerdings sind diese Ansätze nicht zugänglich Hochdurchsatz-Analyse der Vorläufer der Ebene der Einzelzelle für klonale Analyse erforderlich. In ähnlicher Weise in Vivo Reifung durch Transplantation in Neugeborene Mäuse, wo der Mikroumgebung vermutlich besser geeignet für die Unterstützung der früheren Phasen des HSC Vorstufen, ermöglichten auch Studien der sortierten Bevölkerungen aus dem Dottersack und AGM / P-Sp (P-Sp ist die Vorläufer-Region zur Hauptversammlung) mit Merkmalen der Pre-HSC, aber diese Methoden auch scheitern, eine robuste Plattform für einzelne Zelle Analyse11,12.
Studien von Rafii Et Al. haben gezeigt, dass dieser Akt aktiviert Endothelzellen (EG) Stroma eine Nische Substrat für die Unterstützung von Erwachsenen HSC Selbsterneuerung in-vitro-13,14,15bieten kann. Wir entschlossen vor kurzem, dass Akt aktiviert EG abgeleitet aus der AGM-Region (AGM-EC) eine geeignete in-vitro- Nische für die Reifung der Hemogenic Vorläufer bietet, so früh wie E9 in Entwicklung, für die Erwachsenen Einpflanzen HSC sowie die anschließende isoliert Selbsterneuerung der generierten HSC16. Angesichts der Tatsache, dass dieses System eine einfache 2-dimensionale kokultur beschäftigt, ist es leicht anpassbar für klonale Potenzialanalyse der HSC einzeln isolierten Hemogenic Grundstoffe.
Vor kurzem haben wir ein Konzept für die HSC-Potenzial der klonalen Hemogenic Vorstufen assay durch die Kombination von Index Sortierung der einzelnen Hemogenic Vorstufen aus murinen Embryonen mit AGM-EG Kokulturen und anschließenden Funktionsanalyse in der Transplantation berichtet. 17Tests. Index zu sortieren ist eine Art der Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS), die Datensätze (Indizes) alle phänotypischen Parameter (d.h., forward Scatter (FSC-A), Side Scatter (SSC-A), Fluoreszenz Parameter) jeder einzeln sortierten Zelle so, dass diese Funktionen können rückwirkend mit anschließenden Funktionsanalyse nach Sortierung korreliert werden. FACS-Software zeichnet sowohl phänotypische Informationen für jede Zelle und die Position/gut von den 96-Well-Platte, in die sie gestellt wurde. Diese Technik wurde bisher elegant zur erkennen Heterogenität in Erwachsenen HSC, phänotypische Parameter, die weiter für die langfristige anwachsen Teilmenge der HSC zu bereichern, und phänotypischen Parameter des HSC mit transkriptionelle korrelieren Eigenschaften auf die einzelne Zelle Ebene18,19. Hier bieten wir detaillierte Methode dieses Ansatzes, die Identifikation der einzigartigen phänotypischen Parameter und Abstammung Beiträge von Pre-HSC in frühen Phasen der Embryonalentwicklung ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>AGM-EC Nährmedien </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materialien für die Kultivierung von Endothelzellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>Zur Dissoziation von AGM-EC-Monoschichten</td></tr><tr><td>Gelatine 0,1 % in Wasser</td><td>StemCell Technologies</td><td>7903</td><td>Zur Verklebung von AGM-EC-Monoschichten auf Kunststoff</td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Zur Co-Kultivierung von AGM-EC-Monolayern und indexsortierten Klonen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Zur Dissektion und FACS-Färbung</td></tr><tr><td>500 ml Filterflaschen</td><td>Fisher</td><td>Scientific 9741202</td><td>Zur Sterilfiltration von Endothelmedien</td></tr><tr><td><stark>AGM-EC Kulturmedien (500 mls)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td>400 mls</td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03</td><td>100 mls</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>50 mg gelöst in 10 mls Medium</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7100</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>Endothelmitogen (EKGS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64516 (BT-203)</td><td>10 mls Medium zum Auflösen hinzufügen und hinzufügen</td></tr><tr><td>Materialien für AGM-Index sort</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase (0,25%)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7902</td><td>Zur Dissoziation von embryonalem Gewebe</td></tr><tr><td>verwenden 3ml Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td><td>Zur Sterilfiltration von Antikörperlösungen für FACS</td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; M spritzengetriebener Filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>Zur sterilen Filterung von Antikörperlösungen für FACS</td></tr><tr><td>5 ml Polystyrol-Röhrchen mit Zellsiebkappe</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Zur Entfernung von Zellklumpen vor der FACS-DAPI</td></tr><tr><td>(hergestellt als 1 mg/ml Stamm in H2O)</td><td>Millipore</td><td>268298</td><td>Zur Verwendung zum Ausschluss toter Zellen aus</td>der</tr><tr><td>Sorte Anti-Maus-CD16/CD32 (FcR-Block)</td><td>BD</td><td>Biosciences 553141</td><td>Zur Blockierung der unspezifischen Färbung von Fc-Rezeptoren</td></tr><tr><td><stark>Antikörper für AGM-Index sort</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD144 PE-Cyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-1441-82</td><td>Färbung</td></tr><tr><td>von Ratten-IgG1 Kappa-Isotypkontrolle, PE-Cyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-4301-81</td><td>Isotypkontrolle für CD144 PE-Cyanin7</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td><td>eBioscience</td><td>46-2012-80</td><td>Färbung</td></tr><tr><td>von Ratten-IgG2b kappa Isotypkontrolle, PerCP-eFlour710</td><td>eBioscience</td><td>46-4031-80</td><td>Isotypkontrolle für CD201 PerCP-eFluor710</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD41 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>Färbung</td></tr><tr><td>von Ratte IgG1 kappa Isotypkontrolle, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553925</td><td>Isotypkontrolle für CD41 PE</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Färbung</td></tr> von <tr><td>Ratten-IgG2b kappa-Isotypkontrolle, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4031-81</td><td>Isotypkontrolle für CD45 FITC</td></tr><tr><td>AGM-serumfreie Medien (10mls)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>04-448Q</td><td>10 mls</td></tr><tr><td>rekombinanter muriner Stammzellfaktor (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>10 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinanter humaner FLT3-Ligand (FLT3L)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>10 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinantes humanes Thrombopoietin (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>2 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 20 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinantes murines Interleukin-3 (IL3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>2 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 20 ng/ml</td></tr><tr><td>Materialien für die Färbung von co-kultivierten Zellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte, V-Boden</td><td>Corning</td><td>3894</td><td>Verwendung für FACS-Analysen</td></tr><tr><td>Antikörper für die Analyse von Index-sortierten Klonen, die mit Endothelzellen co-kultiviert wurden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD45 PerCP-Cyanin5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b Kappa-Isotypkontrolle für Ratten, PE-Cyanin5.5</td><td>eBioscience</td><td>35-4031-80</td><td>Isotypkontrolle für CD45 PerCP-Cyanin5.5</td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD201 (EPCR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-2012-82</td><td></td>IgG2b-Kappa-Isotypkontrolle</tr><tr><td>für Ratte</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-81</td><td>Isotypkontrolle für CD201 PE</td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5981-83</td><td></td></tr><tr><td>Färbung von Ratten-IgG2a kappa Isotyp-Kontrolle, APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4321-81</td><td>Isotyp-Kontrolle für Ly-6A/E APC</td></tr><tr><td>Anti-Maus F4/80 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td>Färbe-IgG2a</td></tr><tr><td>kappa Isotyp-Kontrolle, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4321-41</td><td>Isotyp-Kontrolle für F4/80 FITC</td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly-6G/C (Gr1) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553127</td><td>Färbung</td></tr> von <tr><td>Ratten-IgG2b Kappa-Isotypkontrolle, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556923</td><td>Isotypkontrolle für Ly-6G/C und CD3 FITC</td></tr><tr><td>Materialien für die Schwanzveneninjektion für Transplantationen</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/2 ml Insulinspritzen mit 29G 1/2" Nadeln</td><td>BD Biosciences</td><td>309306</td><td>Verwendung für die Schwanzveneninjektion zur Transplantation</td></tr><tr><td>Antikörper für die Analyse des peripheren Blutes nach translant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend</td><td></td><td>108426</td><td>Färbung</td></tr><tr><td>Ratte IgG2b kappa Isotypkontrolle, PerCP</td><td>Biolegend</td><td>400629</td><td>Isotypkontrolle für Ly-6G/C PerCP</td></tr><tr><td>Anti-Maus F4/80 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td><td>Färbung</td></tr><tr><td>Ratte IgG2a kappa Isotypkontrolle, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4321-80</td><td>Isotypkontrolle für F4/80 PE</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555274</td><td>Färbung</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD19 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550992</td><td>Färbung</td></tr><tr><td>Ratte IgG2a kappa Isotypkontrolle, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td>Isotypkontrolle für CD19 APC</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45.1 (A20) PE-Cyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a kappa Isotypkontrolle für Ratten, PE-Cyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-81</td><td>Isotypkontrolle für CD45.1 PE-Cyanin7</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45.2 (104) APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-0454-82</td><td>IgG2a</td></tr><tr><td>kappa Isotypkontrolle für Ratte, APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-4321-80</td><td>Isotypkontrolle für CD45.2 APC-eFluor780</td></tr><tr><td>Equipment</td>BD FACSAria II mit DIVA-Software <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II mit Plattenleser</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17040</td><td>Zum Zählen von Zellen</td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-559-417</td><td>Für </td></tr><tr><td>FACS Analysesoftware</td> für Dispensierzellen <td>FlowJo/BD Biosciences</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr></tbody></table>

klonale analyse der embryonalen hämatopoetischen stammzellen vorstufen mit einzelligen index sortieren kombiniert mit endothelzellen nischenkultur co

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Die Fähigkeit, Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Genesis während der Embryonalentwicklung wurde begrenzt durch die Seltenheit der HSC-Vorstufen in der frühe Embryo und das Fehlen von Assays, die funktionell das langfristige multilineage Engraftment Potenzial identifizieren einzelne vermeintliche HSC-Vorläufer. Hier beschreiben wir die Methodik, die die Isolierung und Charakterisierung von funktionell validierten HSC-Vorläufer der Ebene der einzelnen Zelle ermöglicht. Erstens verwenden wir Index Sortierung den präzise phänotypischen Parameter jeder einzeln sortierten Zelle Katalog mit einer Kombination aus phänotypische Markierungen für HSC-Vorstufen mit zusätzlichen Markern für die experimentelle Analyse zu bereichern. Zweitens ist jeder Index sortiert Zelle Co kultiviert mit vaskulären Nische Stroma aus der Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Region, die die Reifung der nicht Einpflanzen HSC Vorläufer des funktionalen HSC mit multilineage, langfristige Engraftment Potenzial in unterstützt Transplantation-Assays. Diese Methodik ermöglicht die Korrelation der phänotypischen Eigenschaften von klonalen Hemogenic Vorstufen mit ihrem funktionalen Engraftment oder andere Eigenschaften wie transkriptionellen Profil, was ein Mittel für die detaillierte Analyse des HSC Vorläufer Entwicklung auf der Ebene der einzelnen Zelle.

Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der Versuchsanordnung. Wenn P-Sp/AGM Gewebe seziert, gebündelt und in Kollagenase getrennt, sind sie mit Antikörpern gegen VE-Cadherin und EPCR für die Sortierung von Index gefärbt. Pre-HSC sind angereichert, in den Zellen an der VE-Cadherin+EPCRhoch (Abbildung 1 b) sortiert. Anderen Fluorochrom-konjugierten Antikörpern lassen sich nachträglich analysieren phä...

Hier präsentieren wir Methodik zur klonalen Analyse von Hämatopoetischen Stammzellen Vorläufer während der murinen embryonalen Entwicklung. Wir kombinieren Index sortieren einzelner Zellen aus der embryonalen Aorta-Gonade-Wachstum-Region mit Endothelzellen Kokulturen und Transplantation der phänotypischen Eigenschaften und Engraftment Potenzial der einzelnen hämatopoetischen Vorläufer zu charakterisieren.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die phänotypischen Eigenschaften und das Transplantationspotenzial von klonalen hämatopoetischen Stammzell- oder HSC-Vorläufern während der Embryonalentwicklung von Mäusen zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der entwicklungsbedingten Hämatopoese über die einzigartigen Abstammungsbeiträge klonaler HSC-Vorläufer während der Embryonalentwicklung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass hämogene Vorläufer auf Einzelzellebene analysiert werden.Dies ermöglicht die Identifizierung der einzigartigen phänotypischen Eigenschaften, die seltene HSC-Vorläufer auszeichnen. Beginnen Sie mit der Zugabe von Aorta-Gonaden-Mesonephros, AGM, Geweben, die zwischen 9,5 und 11,5 Tagen nach dem Koitum von Embryonen präpariert wurden, in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter PBS enthält, ergänzt mit 10% FBS auf Eis. Wenn sich das Gewebe am Boden des Röhrchens abgesetzt hat, aspirieren Sie den Überstand und geben Sie sofort einen Milliliter 0,25 % Kollagenase zu den Proben.Nach 25 Minuten in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad stoppen Sie die Reaktion mit einem Milli

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Isolierung von HSPCs aus dem Knochenmark und deren Sortierung mit einer fluoreszenzaktivierten Zellsortiertechnik, die eine Methode zur Gewinnung von einzeln sortierten HSPCs ist. Wir kultivieren diese sortierten Zellen, um HSPC-Klone zu erhalten.

Kultivierung und Ernte von HSPC-Klonen: Eine Methode zur Gewinnung der einzeln sortierten HSPC-Klone

RNA-Sequenzierung und Bioinformatik-Analysen wurden verwendet, um deutlich und differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren in Lin-CD34 + und Lin-CD34- Subpopulationen von Maus EMLcells identifizieren. Diese Transkriptionsfaktoren könnten eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wechsel zwischen Selbsterneuerung Lin-CD34 + und teilweise differenziert Lin-CD34- Zellen spielen.

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Wir berichten über eine zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von primären tumorspezifischen Endothelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen.

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Bulk-gen Ausdruck Messungen Wolke Einzelzelle Unterschiede in heterogenen Zellpopulationen. Hier beschreiben wir ein Protokoll wie einzellige gen Expressionsanalyse und Index Sortierung durch die Blüte aktiviert Zelle sortieren (FACS) kann kombiniert werden, um die Heterogenität zu umreißen und immunophenotypisch charakterisieren molekular unterschiedliche Zellpopulationen.

Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen

Hier stellen wir ein Protokoll zur präzisen Bildung hämogenen Endothelaus aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien Zustand vor. Diese Methode wird breite Anwendungen bei der Modellierung von Krankheiten und beim Screening auf therapeutische Verbindungen haben.

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Hier wird ein einfaches Protokoll für die gezielte Differenzierung von hämogenen Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt.

Gerichtete Differenzierung hämogener Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Hier wird eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik vorgestellt, die es ermöglicht, gleichzeitig die Anzahl der Zellteilungen, den Phänotyp der Oberflächenzellen und die zelluläre Verwandtschaft zu messen. Diese Eigenschaften können statistisch mit einem auf Permutation basierenden Framework getestet werden.

Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von humanen mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung der Einzelzellsortierungsmethode. Insbesondere kann durch den Einsatz der Einzelzellsortierung eine Reinheit von 99 % der immunphänotypisierten Zellen aus einer heterogenen Population erreicht werden, wenn sie mit einem multiparametrischen Durchflusszytometrie-basierten Ansatz kombiniert wird.

Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten mesenchymalen Stammzellen aus humanen abgeblätterten Milchzähnen

Erfahren Sie die klonale Analyse hämatopoietischer Stammzellvorläufer in der embryonalen Entwicklung mit Index-Sorting und Endothelzell-Co-Kultur. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Einzelzellen und deren Einpflanzungspotenzial.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co (Video) | JoVE Journal

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

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