Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Amplifikation von 16 SRRNA aus Muttermilch und anderen Proben mit geringer Biomasse unter Verwendung eines halbautomatischen Protokolls. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Entwicklung und Störung des menschlichen Mikrobioms zu beantworten, da es sich sowohl auf Gesundheit als auch auf Krankheit bezieht. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie halbautomatisch ist, relativ einfach durchzuführen ist und an mehrere Probentypen wie Sekret, Tupfer und Stuhl angepasst werden kann.

Nach dem Auftauen und der Zuteilung von Vollmilch gemäß dem Textprotokoll werden die Proben 10 Minuten lang bei 5000 g und vier Grad Celsius geschleudert, um die Zellen zu pelletieren. Verwenden Sie einen Plastikspatel oder eine Pipettenspitze mit großem Durchgang, um die obere Fettschicht zu entfernen. Entfernen Sie dann, ohne das Pellet zu stören, den gesamten Überstand mit Ausnahme von 100 Mikrolitern.

Mit einem Milliliter PBS das Pellet wieder aufhängen und waschen. Bereiten Sie dann eine Negativkontrolle vor, indem Sie einen Milliliter steriles PBS in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen geben. Übertragen Sie die Suspension in ein sauberes Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und drehen Sie es eine Minute lang bei 5000-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie dann eine sterile gefilterte Pipettenspitze von 1000 Mikrolitern, um die gesamte überstehende Fettschicht zu entsorgen. Um die Probe aufzubrechen und zu homogenisieren, geben Sie 600 Mikroliter Lysepuffer mit Beta-Mercaptoethanol zum Pellet und überführen Sie die Suspension in ein Bead-Röhrchen. Bereiten Sie eine Positivkontrolle mit Lysepuffer und 20 Mikrolitern der bakteriellen Scheinprobe vor.

Wirbeln Sie alle Perlenröhrchen 15 Sekunden lang kräftig ein. Erhitzen Sie dann die Proben auf einem temperaturgesteuerten Vortexer bei 37 Grad Celsius und 700 bis 800 U/min für 10 Minuten. Laden Sie die Röhrchen in das Adapterset für den automatischen Probenaufstörer.

Dann schlagen Sie die Proben eine Minute lang bei 30 Hertz. Zerlegen Sie das Adapterset und schalten Sie es manuell mit den Probenplatten vom linken Roboterarm auf den rechten Roboterarm des Instruments. Schlagen Sie die Röhrchen bei 30 Hertz für eine weitere Minute und zentrifugieren Sie die Röhrchen dann drei Minuten lang bei 17, 200 mal G und 25 Grad Celsius.

Entfernen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette den gesamten Überstand und achten Sie darauf, dass sich weder die Fettschicht oben noch die Kügelchenreste am unteren Rand der Probe entfernen. Den Überstand auf die Homogenisatorsäulen auftragen. Dann zentrifugieren Sie die Säulen bei maximaler Drehzahl und 25 Grad Celsius für drei Minuten.

Übertragen Sie 350 Mikroliter Eluid in ein Mikrozentrifugenröhrchen eines Zwei-Milliliter-Herstellers. Für die Isolierung von DNA gemäß dem Textprotokoll schneiden Sie die Deckel ab und glätten die Ränder der einzelnen Spin-Säulen für DNA und RNA. Setzen Sie die DNA-Spin-Säule ohne das Entnahmeröhrchen in den Rotoradapter ein.

Entsorgen Sie dann das Auffangröhrchen. Führen Sie anschließend die verwirbelten zwei Milliliter-Röhrchen in einen Schüttler ein und befolgen Sie dabei das Beladungsdiagramm des automatisierten DNA/RNA-Aufreinigungsinstruments gemäß den Anweisungen des Herstellers. Beschriften Sie Eins-Punkt-Fünf-Milliliter-Entnahmeröhrchen und setzen Sie sie in Rotoradapter ein.

Setzen Sie dann die Rotoradapter gemäß der Ladetabelle des automatisierten DNA/RNA-Aufreinigungsgeräts in die Zentrifuge ein. Nachdem Sie die Filterspitzen, RNase-freies Wasser und die Reagenzien in den Reagenzienblock des Instruments eingesetzt haben, schließen Sie den Deckel des Instruments und führen Sie das benutzerdefinierte DNA-Aufreinigungsprogramm auf dem Gerät aus. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, entnehmen Sie die Probe mit den Röhrchen aus dem Schüttler und lagern Sie sie, falls noch Proben übrig sind, bei minus 20 Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung oder bei minus 80 Grad Celsius für die langfristige Lagerung.

Laden Sie nach der Vorbereitung des Arbeitsbereichs und des PCR-Mastermixes gemäß dem Textprotokoll 50 bis 100 Mikroliter DNA-Proben in einen 32-Well-Geräteprobenadapter, wobei Sie der 96-Well-Plattenkarte folgen. Richten Sie für jede PCR-Platte zwei Negativkontrollen ein, indem Sie 30 Mikroliter PCR-Wasser in ein sauberes Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Entnahmeröhrchen pipettieren. Legen Sie dann alle Proben auf den 32-Well-Geräteprobenadapter, wobei die Verschlüsse in der geöffneten Position verriegelt sind.

Entfernen Sie auf dem Reagenzienadapter des Geräts nacheinander die Kappe jedes Reverse-Primers mit bestimmten Barcode-Nummern. Um den robotergestützten Liquid Handler zu beladen, platzieren Sie den Reagenzienadapter in B1.In Position, um einen Kanteneffekt zu vermeiden, legen Sie vorsichtig eine Kante des Adapters gegen die Griffseite und bringen Sie die andere Kante langsam nach unten. Stellen Sie sicher, dass Sie auf alle Ecken der Adapter drücken.

Platzieren Sie den Probenadapter in Position C1 und achten Sie darauf, dass Sie auf alle Ecken der Adapter drücken. Dann den Fünf-Milliliter-Mastermix vortexen. Öffnen Sie die Kappe und platzieren Sie sie in Position A auf dem Master-Mix und dem Reagenzblock des Instruments.

Setzen Sie die PCR-Platte auf den Adapter des 96-Well-Geräts, der für PCR-Platten mit halbem Rand vorgesehen ist. Starten Sie dann den Lauf und speichern Sie ihn als neue Datei. Wenn die Ausführung abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass keine Fehler aufgetreten sind.

Verwenden Sie dann 12 oder acht Streifenkappen, um die Platte zu verschließen. Wirbeln Sie kräftig vor und verwenden Sie einen 96-Well-Plattenspinner, um die Platten eine Minute lang herunterzuschleudern. Legen Sie die Platte abschließend auf Eis, bis sie in den Nachverstärkungsraum gebracht und auf den Thermocycler geladen wird.

Führen Sie nach der PCR-Amplifikation die Qualitätskontrolle und die Bibliotheksvorbereitung gemäß dem Textprotokoll durch. Der erste QC-Schritt des Protokolls folgt auf die PCR-Amplifikation der 16SV4-Region. Wie hier gezeigt, wurde ein Mikroliter PCR-Produkt aus jeder Probe mittels Elektrophorese analysiert, um zu bestätigen, dass es innerhalb des erwarteten Größenbereichs von 350 bis 450 Basenpaaren lag.

Einige Muttermilchproben erzeugten geringere Mengen an spezifischem Produkt, was entweder auf einen geringen Gehalt an extrahierter mikrobieller DNA in diesen Proben oder auf eine Verschleppung von PCR-Inhibitoren während der Extraktion hindeutet. Die Quantifizierung des spezifischen Produkts für jede Probe war entscheidend für die Bestimmung des erforderlichen Volumens für das gleichmäßige molare Pooling der Proben für die Sequenzierung. Eine gepoolte Bibliothek für die gezielte Sequenzierung wird in der Regel von einem bestimmten PCR-Produkt dominiert.

Wenn sich eine signifikante Menge an unspezifischem Produkt in der Bibliothek befindet, sollte dem Arbeitsablauf ein Gelaufreinigungsschritt hinzugefügt werden. Die Sequenzierungsergebnisse zeigen eine hohe Diversität in den Taxa, die mit dem Mikrobiom der Muttermilch assoziiert sind, und eine Variabilität in der Anzahl der Sequenzierungsrohre für jede Probe. Im Gegensatz dazu waren die Taxazusammensetzung und die Schilfzahlen für den Bakterienmock vergleichbar mit den Ergebnissen, die für den Mock in früheren Arbeitsablaufläufen erzielt wurden, was darauf hindeutet, dass die beobachtete Variabilität für die Muttermilchproben ein authentisches experimentelles Ergebnis und nicht eine Funktion der intrinsischen Variabilität des Arbeitsablaufs ist.

Wenn ein Sequenzierer über Nacht läuft, kann diese Technik in zwei Tagen für 12 bis 24 Proben durchgeführt werden, wenn alle Proben in den ersten PCR-Lauf amplifiziert werden. Wenn nicht, ist ein weiterer Shell-Tag erforderlich. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, nur vom Prä-PCR-Bereich in den Post-PCR-Bereich zu reisen, um eine Kontamination zu vermeiden.

Es ist auch wichtig, die Handschuhe häufig zu wechseln, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Proben gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie geeignete Schutzausrüstung und Biosicherheitswerkbänke immer getroffen werden sollten.