Name: Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Erfahren Sie die semi-automatisierte 16S-rRNA-Sequenzierung aus humaner Milch und anderen Low-Biomass-Proben. Diese Methode erleichtert die Mikrobiomforschung und liefert wertvolle Erkenntnisse für Gesundheit und Krankheit.

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Wir möchten Helty Adisetiyo, PhD und Shangxin Yang, PhD für die Entwicklung des Protokolls zu danken. Umfassende Unterstützung für die internationalen mütterlichen pädiatrische Jugendlichen AIDS klinische Studien Gruppe (IMPAACT) wurde vom National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) des National Institute of Health (NIH) unter Preis zahlen zur Verfügung gestellt. UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) und UM1AI106716 (IMPAACT-LC), mit Kofinanzierung von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) und das National Institute of Mental Health (NIMH). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIH.

Für alle Protokoll-Schritte geeigneter persönliche Schutzausrüstung (PSA) muss getragen werden, und strengen Verunreinigung Präventionsansätze unternommen werden müssen. Beobachten Sie Arbeitsabläufe von Vorverstärkung Arbeitsbereichen zu Post-Verstärkung Arbeitsbereiche, Kontamination der Proben zu minimieren. Alle Lieferungen verwendet sind steril, frei von RNase, DNase, DNA und pyrogenfreie. Alle Pipettenspitzen werden gefiltert. Ein Flussdiagramm der Protokoll-Schritte steht zur Verfügung (Abbildung 1).
1. Probe lyse
Hinweis: Probe-lyse und Nukleinsäure-Extraktion erfolgt über ein DNA/RNA-Extraktion-Kit in einem Reinraum wo gibt es technische und verfahrenstechnische Kontrollen, die Einführung von Umweltbakterien zu den Proben zu minimieren.
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Das Biosafety-Kabinett (BSC) Arbeitsbereich sauber mit entsprechenden Oberflächen Reiniger, Nukleinsäure-Verunreinigungen zu beseitigen.</li>
		<li>Schalten Sie die temperaturgeführte Vortexer, und setzen Sie ihn auf 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Guanidinium-Thiocyanat-Lyse-Puffer vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien)
	<ol>
<li>Überprüfen Sie die Lyse-Puffer für Ausscheidungen. Wieder lösen sich Ausscheidungen durch die Erwärmung bei 37 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie 600 µL Lyse Puffer mit 6 µL β-Mercaptoethanol (β-ME) für jede Probe. Betrachten Sie ein extra 20 % Volumen pro Probe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Probe
	<ol>
<li>Wenn Vollmilch eingefroren ist, lassen tauen Sie es auf Eis auf. Aliquoten 5 mL des ganzen Milch in einem 15 mL oder eine 5 mL steriles Röhrchen im BSC und halten sie auf dem Eis.</li>
		<li>Drehen Sie die 5 mL Milch aliquoten für 10 min bei 5.000 x g bei 4 ° C, pellet-Zellen.</li>
		<li>Die Fettschicht zu entfernen, jetzt die oberste Schicht in der Röhre, mit einem Kunststoffspachtel oder große Bohrung Pipettenspitze.</li>
		<li>Ohne zu stören das Pellet, entfernen des Überstands mit Ausnahme von 100 µL.</li>
		<li>Waschen Sie die Pellets von resuspending in 1 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Bereiten Sie 1 negative Kontrolle durch Zugabe von 1 mL sterile PBS, eine 5-mL-Tube.</li>
		<li>Die Aussetzung auf eine saubere 1,5 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und spin in einem Microcentrifuge für 1 min (5.000 x g bei Raumtemperatur (RT)).</li>
		<li>Verwenden Sie eine 1.000 µL steriler gefilterter Pipettenspitze um die gesamte Ebene überstand/Fettsäuren zu verwerfen.</li>
		<li>Wenn nicht extrahieren am selben Tag snap frieren die Zelle pellet-indem man es in einem Ethanol/trocken Eis Gülle und sofort auf die-80 ° C Gefrierschrank zu übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Probe-Störung und Homogenisierung (Wulst-schlagen)
	<ol>
<li>Fügen Sie 600 µL Lyse Puffer mit β-ME zum Pellet und übertragen Sie die Aussetzung zu einem Wulst-Schlauch.</li>
		<li>Jede Charge der Extraktion von 12 enthält 10 Proben, 1 Negativkontrolle (vorbereitet in Schritt 3.7 oben) und 1 positiv-Kontrolle (im nächsten Schritt vorbereitet).<ol>
<li>Bereiten Sie 1 Positivkontrolle mit Lyse-Puffer und 20 µL der bakteriellen mock Probe (mock Gemeinschaft verwendet hat eine Konzentration, die einmal extrahiert, von ca. 0,2 ng/µL DNA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortex alle bead Tubes energisch für 15 s.</li>
		<li>Erwärmen Sie Proben über temperaturgesteuerte Vortexer bei 37 ° C für 10 min, mit Schütteln bei 700-800 u/min.</li>
		<li>Laden Sie Rohre in das automatisierte Sample Disruptor Adapterset.</li>
		<li>Wulst schlagen für 1 min bei 30 Hz.</li>
		<li>Zerlegen Sie das Adapter-Set und manuell wechseln des Adapters set mit die Musterplatten aus der linken Roboterarm, der rechts Roboterarm des Instruments.</li>
		<li>Wulst schlagen für ein weiteres 1 min bei 30 Hz.</li>
		<li>Zentrifuge Röhren 17.200 x g, für 3 min bei 25 ° C.</li>
		<li>Entfernen Sie alle der Überstand mit einer 200 µL Pipette, wobei Sie darauf achten, nicht um eine der fetthaltigen Schicht an der Spitze der Probe oder die Perle Rückstände an der Unterseite der Probe, und gelten für eine Spalte Homogenisator.</li>
		<li>Zentrifuge Homogenisator Spalten mit maximaler Geschwindigkeit, 17.200 x g, für 3 min bei 25 ° C.</li>
		<li>Übertragen Sie 350 µL Eluat auf ein 2-mL-Hersteller Microcentrifuge Schlauch für den Einsatz mit dem automatisierten Instrument zur Reinigung von DNA und RNA (verwenden Sie nicht anderen Röhre). Achten Sie darauf, dass Sie keine verbleibende Fettschicht zu übertragen.</li>
		<li>Bei der Durchströmung Größe von weniger als 350 µL fügen Sie Lyse Puffer mit β-ME zu einem Endvolumen von 350 µL hinzu.</li>
		<li>Lassen Sie die Proben an RT für bis zu 2 Stunden bevor Sie fortfahren Nukleinsäure-Isolierung mit dem automatisierten DNA-Reinigung-Instrument oder Einfrieren bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reinigung Arbeitsbereich
	<ol>
<li>Sauber alle Oberflächen in mit einer nicht-enzymatische Dekontaminationslösung verwenden, lassen Sie für 10 min, dann sprühen Sie mit 70 % Ethanol und wischen Sie die Oberfläche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) isolieren Sie DNA/RNA
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Schalten Sie den Heizblock und stellen Sie die Temperatur auf 70 ° C.</li>
		<li>Schalten Sie die temperaturgeführte Vortexer und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.</li>
		<li>Wärmen Sie die Elution Puffer (EB) mit 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, in einem 50-mL-Röhrchen bis 70 ° C.</li>
		<li>Wärmen Sie 350 µL eingefrorene Samenprobe Lysates in 2 mL Röhrchen bei 37 ° C, bis Sie vollständig aufgetaut ohne jede Niederschlag (ca. 10 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA-Reinigung
	<ol>
<li>Wirbel und Zentrifuge der 2-mL-Röhrchen mit kurz Probe (3000 X g für 10 s).</li>
		<li>Legen Sie 2 mL Röhrchen in den Shaker nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gemäß den Herstellerangaben.</li>
		<li>Bekommen Sie die Rotor-Adapter und richten Sie diese auf dem Tablett, basierend auf der Anzahl der Proben.</li>
		<li>Beschriften Sie jeden Rotor Adapter anhand des Beispiels Identifikation (ID).</li>
		<li>Schneiden Sie den Deckel und glätten Sie die Kanten der einzelnen Spin Spalten für DNA und RNA.</li>
		<li>Fügen Sie die DNA Spin Spalte ohne das Sammelröhrchen in den Rotor-Adapter. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen.</li>
		<li>Label 1,5 mL Röhrchen und Rotor-Adapter stecken.</li>
		<li>Rotor-Adapter in die Zentrifuge nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gesetzt.</li>
		<li>Tipp-Racks stecken Sie des Herstellers 1.000 µL Filterspitzen.</li>
		<li>Ein 2-mL-Hersteller Microcentrifuge Schlauch basierend auf der Anzahl der Proben (je spezifischen Maschinenanweisungen Protokoll) fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu.</li>
		<li>Stecken Sie das Rohr in Rohr-Steckplatz "A" Microcentrifuge Schlauch Slots.</li>
		<li>Entsorgen Sie Reagenz, das in Flaschen Reagenz und füllen mit einem Mindestvolumen von 10 mL übrig bleibt.</li>
		<li>Das Reagenz Flaschenregal (außer EB Flasche) stecken Sie Reagenz Flaschen.</li>
		<li>Die Position der Reagenz Flasche 6 warme EB aus der 50-mL-Tube hinzufügen.</li>
		<li>Check-1,5 mL-Tuben sind eng in die Rotor-Adapter platziert.</li>
		<li>Schließen Sie das Instrument Deckel und wählen Sie: "RNA" → "Extraktion Kit" → "Tier, Geweben und Zellen" → "Kit Name 350 µL Teil A Custom DNA" → Elution Lautstärke 100 µL (Standard) oder 50 µL für niedrigen Biomasse Proben → bearbeiten "Start."</li>
		<li>Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie Rotor-Adapter aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf dem Tablett.</li>
		<li>Entsorgen Sie die DNA Spin Spalte von Rotorposition Adapter 3.</li>
		<li>Rotor-Adapter nicht wegwerfen, RNA ist in der Position 2.</li>
		<li>1,5 mL Röhrchen mit eluierten DNA an Position 3 zu entfernen und speichern in −20 ° C.</li>
		<li>Sammeln Sie Probe-haltige Rohre im Shaker und Store in −20 ° C, wenn jede Probe, sonst verwerfen übrig ist.</li>
		<li>Fahren Sie mit dem Protokoll "Kit Name 350 µL Teil B RNA" für die weitere Reinigung der RNA.</li>
		<li>RNA-Reinigung erfolgt von der rund 350 µL durchströmten, die in der mittleren Position des Rotors Adapter ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA-Reinigung
	<ol>
<li>Fügen Sie die RNA Spin Spalte ohne seine Sammelröhrchen und Deckel in den Rotor-Adapter.</li>
		<li>Beschriften Sie neue 1,5 mL Röhrchen und in Rotor-Adapter setzen Sie ein, wie im Handbuch angegeben.</li>
		<li>Die Rotor-Adapter in der Zentrifuge nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gesetzt.</li>
		<li>Schließen Sie das Instrument Deckel und wählen Sie: "RNA" → "Des Herstellers Kit" → "Tier, Geweben und Zellen" → "Standard Teil B RNA" → "Start."</li>
		<li>Nach Fertigstellung, entfernen Sie Rotor-Adapter aus der Zentrifuge zu und legen Sie sie auf dem Tablett.</li>
		<li>RNA-Spin-Spalte von Position 3 zu verwerfen.</li>
		<li>1,5 mL Röhrchen mit 30 µL eluiert RNA an Position 3 zu entfernen und Lagern bei −80 ° C.</li>
		<li>Reagenz-Flaschen zu entfernen.</li>
		<li>Rotor-Adapter Inhalt durch entsprechende Sondermüll Kanäle entsorgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sauberen Arbeitsplatz
	<ol>
<li>Spray alle automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments Zubehör wie Reagenz Racks, Tablett und einer anderen Oberfläche in mit einer nicht-enzymatische Dekontaminationslösung verwenden, lassen Sie für 10 Minuten und Spülen mit entionisiertem Wasser (DI), dann trocknen lassen.</li>
		<li>Spray die automatisierten Instrument mit nur Hersteller genehmigt nicht-enzymatische Dekontaminationslösung, wischen Sie die Innenseite der Zentrifuge zusammen mit allen Oberflächen lassen für 10 min und wischen Sie dann mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie andere Arten von Dekontamination Lösungen nicht, da diese das Gerät beschädigen können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. gezielte 16 s PCR Setup
Hinweis: Das Setup für die 16 s-PCR wird in einem dafür vorgesehenen Vorverstärkung Arbeitsbereich befindet sich innerhalb der Reinraum durchgeführt. Die Reagenzien und Proben sind vorbereitet und dann auf einen flüssigen Handler durchführen die PCR für jede Probe in dreifacher Ausfertigung (30 Proben, darunter wahre Proben und Extraktion positive und negative Kontrollen, plus 2 PCR Wasser steuert in dreifacher Ausführung, für eine Gesamtmenge von 96 verladen kombinierten Proben und Kontrollen). Sobald die PCR-Reaktionen montiert und abgedichtet sind, ist ein Thermocycler befindet sich in einer Post-Verstärkung-Gebiet zum Radfahren Probenteller übertragen.
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Reinigen Sie die PCR-Workstation. Spray, die alle Oberflächen mit einer RNase, DNase, DNA Dekontaminierungsmittel gefolgt von VE-Wasser zwei Mal, und schließlich 70 % Ethanol.</li>
		<li>Vorbereiten der 16 s-PCR-Arbeitsblatt (siehe gezielte 16 s PCR Arbeitsblatt) eine genaue Liste und weisen unterschiedliche Barcodes Primer an jede Probe-9. Drucken Sie das Arbeitsblatt und die Platte Karten (siehe Plate 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR-master-Mix-Vorbereitung Hinweis: 16 s Grundierung Auswahl basiert auf der Region von Interesse für die Studie und kann durch Studium oder Probe-Typ ändern. Daher vor der Bestellung Primer, ist es wichtig, welchem Bereich der 16 s rRNA beste verstärkt die Mikroben von Interesse für die Studie zu bestätigen. Dieses Protokoll wie geschrieben ist für die Verstärkung der 16 s V4 Region. Verschiedenes Grundierungen/Region ausgewählt sind, kann die Anlasstemperatur in die Temperaturzyklen Anpassung verlangen.<ol>
<li>Arbeiten Sie in der PCR-Arbeitsstation, um alles vorzubereiten.</li>
		<li>Nehmen Sie 50-100 µL DNA-Proben von-20 ° C und alle benötigten Reagenzien und tauen sie auf Eis. Wirbel und kurz spin-down.</li>
		<li>Die Primer werden vorab zur Arbeit Konzentration von 5 µM in ein Mindestvolumen von 20 µL verdünnt.</li>
		<li>Bereiten Sie die PCR-master-Mix in der spezifischen 5 mL Tube mit nur die forward Primer nach der Berechnung auf dem Arbeitsblatt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung des Roboter liquiden Handlers für automatisierte PCR setup
	<ol>
<li>Für Proben ein 32-gut Instrument Probe Adapter herausnehmen, und 50-100 µL DNA-Proben nach der 96-Well-Platte-Karte gemäß den Anweisungen des Herstellers zu laden.<ol>
<li>Für jede PCR-Platte 2 Negativkontrollen indem man 30 µL des PCR-Wasser in einem sauberen Probenröhrchen eingerichtet.</li>
			<li>Legen Sie alle Proben auf das 32-gut Instrument Probe Adapter mit Kappen verschlossen in Offenstellung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für reverse Primer9<ol>
<li>Entfernen Sie die Kappe von jedem rückwärts-Primer mit bestimmten Barcode # es eins zu einem Zeitpunkt (Handschuhe wechseln dazwischen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden).</li>
			<li>Legen Sie maximal 32 Primer auf das Instrument Reagenz Adapter.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nehmen Sie eine 96-Well-PCR-Platte und beschriften Sie sie mit Studiennamen, Probennummer, Datum und Initialen des Technikers.</li>
		<li>Laden den Roboter liquiden handler<ol>
<li>Setzen Sie den Reagenz-Adapter auf B1. Um einen Effekt zu vermeiden, legen Sie vorsichtig eine Kante des Adapters gegen die Griffseite und langsam die andere Kante herab. Achten Sie darauf, an allen Ecken von den Adapter schieben.</li>
			<li>Setzen Sie die Probe-Adapter in Position C1. Achten Sie darauf, an allen Ecken von den Adapter schieben.</li>
			<li>Wirbel der 5-mL-master-Mix, öffnen Sie die Kappe, und legen Sie sie in Position A auf das Instrument master Mix und Reagenz Block.</li>
			<li>Legen Sie die PCR-Platte auf der 96-Well-Instrument-Adapter, der halb skirted PCR-Platten halten soll.</li>
			<li>Den Durchlauf starten und als neue Datei speichern.</li>
			<li>Folgen Sie den Anweisungen und Häkchen jeder Eingabeaufforderung: einerseits Tipps gibt es, zwei, Abfallbehälter ist verfügbar, und drei, starten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nach der abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, es gab keine Fehler durch die Überprüfung der Maschine für Fehlermeldungen.</li>
		<li>Dichtplatte mit den 12 oder 8 Streifen Kappen, Strudel kräftig, spin-down für 1 min mit einem 96-Well-Platte-Spinner und legen Sie es auf Eis oder in den Kühlschrank stellen.</li>
		<li>Röhrchen mit reverse Primer und Proben zu entfernen.</li>
		<li>Nehmen Sie die 96-Well-Platte um den Post-Verstärkung-Raum und laden Sie die Platte auf den Thermocycler und Zyklus entsprechend der Tabelle des thermischen Radfahren Bedingungen (siehe Tabelle 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. gezielte 16 s Post-PCR-Qualitätskontrolle mit Band-basierte Plattform für Gelelektrophorese
Hinweis: Post-PCR-Qualitätskontrolle (QC) und alle weiteren Schritte werden in einem bestimmten Bereich der Post-Verstärkung des Labors durchgeführt. Die DNA wird in einen automatisierten DNA/RNA Fragment Analyzer analysiert.
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Reinigen Sie die Arbeitsstation durch Spritzen, die alle Oberflächen mit RNase, DNase, DNA-Dekontaminierungsmittel gefolgt von VE-Wasser zwei Mal, und schließlich 70 % Ethanol.</li>
		<li>Sammeln Sie alle Versorgungsgüter und Ausrüstungsgegenstände benötigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Reagenzien
	<ol>
<li>Der temperaturgesteuerten Vortexer bei 25 ° C für mindestens 30 min entgegenbringen Sie Probenpuffer und Leiter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Während die Reagenzien Aufwärmen, bereiten Sie PCR Proben vor, durch die Bündelung der 3 PCR-Wiederholungen für jede Probe in ein einzelnes Rohr</li>
	<li>Proben am Instrument zu laden.</li>
	<li>Kurz Wirbel und Spin-down Rohre mit gepoolten PCR-Produkt.</li>
	<li>Platzieren Sie das Instrument 96-Well-Platte auf eine Zahnstange bei RT und beschriften Sie sie.</li>
	<li>Kurz nach unten Wirbel und Spin Probenpuffer und Leiter.</li>
	<li>Geben Sie 3 µL Probenpuffer in jedes der 96-well-Platte (Notwendigkeit mindestens 53 µL/Bildschirm Klebeband).</li>
	<li>Führen Sie eine gerade Anzahl von Proben; besteht eine ungerade Anzahl von Proben, geben Sie 4 µL Probenpuffer in eine leere.</li>
	<li>Hinzu kommt 1 µL Leiter Anlegeleiter gut.</li>
	<li>Nach der Karte hinzufügen 1 µL der gepoolten PCR-Produkt seiner ausgewiesenen gut.</li>
	<li>Abdeckplatte mit Folienversiegelung</li>
	<li>Wirbel der Platte mit des Instruments Vortexer und Adapter bei 2.000 u/min für 1 min.</li>
	<li>Drehen Sie wieder nach unten in Position, die die Probe an der Unterseite des Rohres, wenn es gibt Spin down sprudelt.</li>
	<li>Starten Sie die Software.</li>
	<li>Laden Sie Bildschirmtipps Band und laden in das Gerät.</li>
	<li>Proben in den Fragment-Analysator mit einem 96-Well-Adapter zu laden.</li>
	<li>Richten Sie ein mit der Controller-Software laufen.</li>
	<li>Achten Sie darauf, wählen geradzahligen Brunnen.</li>
	<li>Beispiel-IDs zu schreiben.</li>
	<li>Überprüfen Sie, dass die Brunnen des Bandes Bildschirm grau hervorgehoben werden.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Analyzer erkennt die Pipettenspitzen.</li>
	<li>Wählen Sie Start, und geben Sie einen Dateinamen, um die Ergebnisse zu speichern (Studie Probennummern, Name und Datum).</li>
	<li>Beziehen sich auf die Anweisungen des Herstellers für weitere Details.</li>
	<li>Nachdem das abgeschlossen ist, entsorgen Sie Tipp, Bildschirm Klebeband und Röhren.</li>
	<li>Analysieren von Daten für 16 s Peak nM (zwischen 315-450 bp für V4). Dieser Gipfel variieren je nach dem Primer ausgewählt.</li>
</ol>5. Bibliothek Berechnung, Pooling, Clean-Up, und QC
<ol><li>Nach der Bestimmung der Größe der Amplifikate und Molarity aller Proben, bündeln die Bibliotheken zur Erreichung der gewünschten Endvolumen und nM für die gepoolten Bibliothek (siehe Beispielrechnung).</li>
	<li>Clean-Up und Konzentrat die gepoolte Bibliothek mit einer Silica-Membran-basierten Läuterung kit für PCR-Produkte nach Angaben des Herstellers Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Eluieren Sie die DNA mit einem Endvolumen von 50 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie die Konzentration der gereinigten Bibliothek sofort mit den doppelten gestrandeten DNA-hohe Empfindlichkeit Kit für ein Fluorometer laut Protokoll des Herstellers.<ol>
<li>Verdünnen Sie 2 µL der gebündelt und gereinigte Bibliothek mit 198 µL des Verdünnungspuffer plus Farbstoff (1: 100 Verdünnung).</li>
		<li>Nehmen Sie den gemessenen Wert vom fluorometrisch Gerät und nach den Verdünnungsfaktor zu konvertieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit der Konzentration (ng/µL) für die gepoolten Bibliothek lesen, berechnen Sie die Bibliothek Molarity in nM. Verwenden Sie 1 µL unverdünnte Bibliothek der OD260/280 auf einem Microvolume Spektralphotometer messen. Hinweis: Der Wert von 1,8-2,0 gibt ausreichende Reinheit der Bibliothek.</li>
	<li>Speichern Sie die endgültige Bibliothek bei-20 ° C bis bereit für die nächste Generation-Sequenzierung.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA ist eine weit verbreitete und schnelle Technik für Microbiome Charakterisierung18. Jedoch können viele Faktoren, einschließlich Batch Effekte, Umweltverschmutzung, Probe Cross-Kontamination, Sensitivität und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen Versuchsergebnisse und verwirren ihre Auslegung7,19 , 20. um robuste 16 s Analysen am besten zu erleicht...

Der mikrobiellen Lebensgemeinschaften, die Menschen besiedeln sind vermutlich entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesundheit und Krankheit beeinflussen Stoffwechsel, Immunsystem Entwicklung, Anfälligkeit für Krankheiten und Reaktionen auf Impfungen und Medikamenten Therapie1, 2. Bemühungen um den Einfluss der Mikrobiota auf die menschliche Gesundheit derzeit verstehen betonen die Identifizierung von Mikroben verbunden mit definierten anatomischen Kompartimente (d.h., Haut, Darm, Oral usw.),sowie lokalisierte Websites in Diese Fächer3,4. Diese investigativen Bemühungen ist die rasche Entstehung und erhöhte Zugänglichkeit der Next Generation Sequencing (NGS) Technologien, die eine massiv parallele Plattform zur Analyse der mikrobiellen genetischen Inhalte (Mikrobiom) einer Probe. Für viele physiologische Proben, die damit verbundenen Microbiome ist komplex und reichlich (d.h., Hocker), aber für einige Proben ist das Mikrobiom durch geringe mikrobielle Biomasse (d.h., Muttermilch und unteren Atemwege) vertreten, wo Empfindlichkeit, experimentellen Artefakte und mögliche Verunreinigungen werden wichtige Themen. Die gemeinsamen Herausforderungen der Microbiome Studien und geeignete Versuchsanordnung wurden mehrere Review Artikel5,6,7,8.
Enthaltenen basiert eine robuste NGS experimentelle Pipeline auf gezielte Sequenzierung der rRNA 16 s V4 Region9 Mikrobiom der Muttermilch zu charakterisieren. Microbiome Analyse der menschlichen Milch ist kompliziert, nicht nur durch eine von Natur aus geringe mikrobielle Biomasse-10, sondern zusätzlich durch hohe Niveaus der menschlichen DNA Hintergrund11,12,13,14 und mögliche Übertragung von PCR-Inhibitoren15,16 in extrahierten Nukleinsäuren. Dieses Protokoll setzt auf handelsübliche Extraktion Kits und semi-automatischen Plattformen, die helfen können Variabilität auf Probe Vorbereitung Chargen zu minimieren. Es enthält eine wohldefinierte mock Bakteriengemeinschaft, die neben Proben verarbeitet wird, als eine Qualitätskontrolle überprüfen jeden Schritt im Protokoll und bieten eine unabhängige Metrik der Pipeline Robustheit. Obwohl das Protokoll als beschrieben für die Muttermilch Proben handelt, es ist leicht anpassbar an andere Probentypen wie Hocker, rektale und vaginale, Haut, areolar und mündliche Tupfer10,17, und dient als Ausgangspunkt für Forscher, die Microbiome Analysen durchführen möchten.

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA-Extraktionskit</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, DNA-Dekontaminationsmittel</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperaturgesteuerter Vortexer-Puffer</td></tr><tr><td>RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>Guanidiniumthiocyanat-Lysepuffer/ Teil des Allprep-Kits</td></tr><tr><td>&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig;-ME ist ein Reduktionsmittel, das RNasen irreversibel denaturiert, indem es Disulfidbindungen reduziert</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>Bead</td></tr><tr><td>Tube QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>automatisiertes Probendisruptor-Adapterset</td></tr><tr><td>QIAshreddersäule</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>QIAgen RB Röhrchenhersteller</td><td></td><td></td><td>Mikrozentrifugenröhrchen im Kit</td></tr><tr><td>QIAcube und zugehörige Kunststoffe</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>automatisiertes DNA/RNA-Aufreinigungsinstrument</td></tr><tr><td>DNA-Exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>nicht-enzymatische Dekontaminationslösung</td></tr><tr><td>EB Puffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Elutionspuffer</td></tr><tr><td>QIAgility und verwandte Kunststoffartikel</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>Roboter-Liquid-Handler</td></tr><tr><td>PCR-Wasser</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Barcode-Reverse-Primer</td><td>Eurofin</td><td>Kein Katalog #'s</td><td>entworfen und bestellt</td></tr><tr><td>96 Well PCR-Platte</td><td>USA wissenschaftlich</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 und zugehörige Kunststoffartikel</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>automatisierter DNA/RNA-Fragmentanalysator</td></tr><tr><td>D1000 Reagenzien für die Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Probenpuffer und Leiter sind Teil dieses Kits</td></tr><tr><td>OneStep PCR Inhibitor Removal Kit</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>PCR-Inhibitorentfernung erfolgt gemäß den Anweisungen des Herstellers.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA-Aufreinigungskit: Aufreinigung von PCR-Produkten auf Kieselsäuremembranbasis</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>Dimethylsulfoxid-basierter Verdünnungspuffer und Farbstoff sind Teil dieses Kits.</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Mikrovolumen-Spektralphotometer</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 Kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #'s</td><td>Sequenzer der nächsten Generation</td></tr></tbody></table>

eine methode zur gezielten 16 s sequenzierung des menschlichen milchproben

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Studien von mikrobiellen Gemeinschaften haben sich mit der Entwicklung der relativ kostengünstig, schnell und hoher Durchsatz Sequenzierung verbreitet. Wie bei all diesen Technologien, hängen reproduzierbare Ergebnisse ein Labor-Workflow, der entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und Kontrollen enthält. Dies ist besonders wichtig mit niedrig-Biomasse-Proben, wo verunreinigen bakteriellen DNA irreführende Ergebnisse erzeugen. Dieser Artikel beschreibt einen semi-automatischen Workflow, Mikroben aus Muttermilch Milchproben mit gezielte Sequenzierung der 16 s ribosomale RNA (rRNA) V4 Region im Low - mid throughput Maßstab zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt Probenvorbereitung aus Vollmilch, einschließlich: lyse, Nukleinsäure-Extraktion, Verstärkung der V4 Region der 16 s rRNA-Gen und Bibliothek Vorbereitung mit Maßnahmen zur Qualitätskontrolle zu probieren. Wichtig ist, das Protokoll und die Diskussion beachten Sie Punkte, die hervorstechenden zur Vorbereitung und Analyse von Proben, niedrig-Biomasse einschließlich entsprechende positive und negative Kontrollen, PCR-Inhibitor Entfernung, Probe Kontamination durch Umwelt-, Reagenz sind oder experimentelle Quellen und experimentelle best Practices entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Während das Protokoll wie beschrieben spezifisch menschlichen Milchproben ist, ist es anpassungsfähig an zahlreichen Low - und High-Biomasse Probentypen, einschließlich Proben auf Tupfer, gefroren, pur oder in einem Erhaltung Puffer stabilisiert.

Die hier vorgestellten Protokoll beinhaltet wichtige Qualitätskontrolle (QC) Schritte um sicherzustellen, dass die generierten Daten treffen für Protokoll Sensitivität, Spezifität und Verunreinigung Kontrolle benchmarks. QC zunächst das Protokoll folgt PCR Verstärkung der 16 s V4 Region (Abbildung 2). 1 µL des PCR-Produktes von jeder Probe wurde analysiert, durch Elektrophorese zu bestätigen, dass es innerhalb der erwarteten Größenbereich von 315-450 bp (<str...

Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.

Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Amplifikation von 16 SRRNA aus Muttermilch und anderen Proben mit geringer Biomasse unter Verwendung eines halbautomatischen Protokolls. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Entwicklung und Störung des menschlichen Mikrobioms zu beantworten, da es sich sowohl auf Gesundheit als auch auf Krankheit bezieht. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie halbautomatisch ist, relativ einfach durchzuführen ist und an mehrere Probentypen wie Sekret, Tupfer und Stuhl angepasst werden kann.Nach dem Auftauen und der Zuteilung von Vollmilch gemäß dem Textprotokoll werden die Proben 10 Minuten lang bei 5000 g und vier Grad Celsius geschleudert, um die Zellen zu pelletieren. Verwenden Sie einen Plastikspatel oder eine Pipettenspitze mit großem Durchgang, um die obere Fettschicht zu entfernen. Entfernen Sie dann, ohne das Pellet zu stören, den gesamten Überstand mit Ausnahme von 100 Mikrolitern.Mit einem Milliliter PBS das Pellet wieder aufhängen und waschen. Bereiten Sie dann eine Negativkontrolle vor, indem Sie einen Milliliter steriles PBS in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen geben. Übertragen Sie die Suspension in ein sauberes Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und drehen Sie es eine Minute lang bei 5000-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur.Verwenden Sie dann eine sterile gefilterte Pipettenspitze von 1000 Mikrolitern, um die gesamte überstehende Fettschicht zu entsorgen. Um die Probe aufzubrechen und zu homogenisieren, geben Sie 600 Mikroliter Lysepuffer mit Beta-Mercaptoethanol zum Pellet und überführen Sie die Suspension in ein Bead-Röhrchen. Bereiten Sie eine Positivkontrolle mit Lysepuffer und 20 Mikrolitern der bakteriellen Scheinprobe vor.Wirbeln Sie alle Perlenröhrchen 15 Sekunden lang kräftig ein. Erhitzen Sie dann die Proben auf einem temperaturgesteuerten Vortexer bei 37 Grad Celsius und 700 bis 800 U/min für 10 Minuten. Laden Sie die Röhrchen in das Adapterset für den automatischen Probenaufstörer.Dann schlagen Sie die Proben eine Minute lang bei 30 Hertz. Zerlegen Sie das Adapterset und schalten Sie es manuell mit den Probenplatten vom linken Roboterarm auf den rechten Roboterarm des Instruments. Schlagen Sie die Röhrchen bei 30 Hertz für eine weitere Minute und zentrifugieren Sie die Röhrchen dann drei Minuten lang bei 17, 200 mal G und 25 Grad Celsius.Entfernen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette den gesamten Überstand und achten Sie darauf, dass sich weder die Fettschicht oben noch die Kügelchenreste am unteren Rand der Probe entfernen. Den Überstand auf die Homogenisatorsäulen auftragen. Dann zentrifugieren Sie die Säulen bei maximaler Drehzahl und 25 Grad Celsius für drei Minuten.Übertragen Sie 350 Mikroliter Eluid in ein Mikrozentrifugenröhrchen eines Zwei-Milliliter-Herstellers. Für die Isolierung von DNA gemäß dem Textprotokoll schneiden Sie die Deckel ab und glätten die Ränder der einzelnen Spin-Säulen für DNA und RNA. Setzen Sie die DNA-Spin-Säule ohne das Entnahmeröhrchen in den Rotoradapter ein.Entsorgen Sie dann das Auffangröhrchen. Führen Sie anschließend die verwirbelten zwei Milliliter-Röhrchen in einen Schüttler ein und befolgen Sie dabei das Beladungsdiagramm des automatisierten DNA/RNA-Aufreinigungsinstruments gemäß den Anweisungen des Herstellers. Beschriften Sie Eins-Punkt-Fünf-Milliliter-Entnahmeröhrchen und setzen Sie sie in Rotoradapter ein.Setzen Sie dann die Rotoradapter gemäß der Ladetabelle des automatisierten DNA/RNA-Aufreinigungsgeräts in die Zentrifuge ein. Nachdem Sie die Filterspitzen, RNase-freies Wasser und die Reagenzien in den Reagenzienblock des Instruments eingesetzt haben, schließen Sie den Deckel des Instruments und führen Sie das benutzerdefinierte DNA-Aufreinigungsprogramm auf dem Gerät aus. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, entnehmen Sie die Probe mit den Röhrchen aus dem Schüttler und lagern Sie sie, falls noch Proben übrig sind, bei minus 20 Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung oder bei minus 80 Grad Celsius für die langfristige Lagerung.Laden Sie nach der Vorbereitung des Arbeitsbereichs und des PCR-Mastermixes gemäß dem Textprotokoll 50 bis 100 Mikroliter DNA-Proben in einen 32-Well-Geräteprobenadapter, wobei Sie der 96-Well-Plattenkarte folgen. Richten Sie für jede PCR-Platte zwei Negativkontrollen ein, indem Sie 30 Mikroliter PCR-Wasser in ein sauberes Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Entnahmeröhrchen pipettieren. Legen Sie dann alle Proben auf den 32-Well-Geräteprobenadapter, wobei die Verschlüsse in der geöffneten Position verriegelt sind.Entfernen Sie auf dem Reagenzienadapter des Geräts nacheinander die Kappe jedes Reverse-Primers mit bestimmten Barcode-Nummern. Um den robotergestützten Liquid Handler zu beladen, platzieren Sie den Reagenzienadapter in B1.In Position, um einen Kanteneffekt zu vermeiden, legen Sie vorsichtig eine Kante des Adapters gegen die Griffseite und bringen Sie die andere Kante langsam nach unten. Stellen Sie sicher, dass Sie auf alle Ecken der Adapter drücken.Platzieren Sie den Probenadapter in Position C1 und achten Sie darauf, dass Sie auf alle Ecken der Adapter drücken. Dann den Fünf-Milliliter-Mastermix vortexen. Öffnen Sie die Kappe und platzieren Sie sie in Position A auf dem Master-Mix und dem Reagenzblock des Instruments.Setzen Sie die PCR-Platte auf den Adapter des 96-Well-Geräts, der für PCR-Platten mit halbem Rand vorgesehen ist. Starten Sie dann den Lauf und speichern Sie ihn als neue Datei. Wenn die Ausführung abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass keine Fehler aufgetreten sind.Verwenden Sie dann 12 oder acht Streifenkappen, um die Platte zu verschließen. Wirbeln Sie kräftig vor und verwenden Sie einen 96-Well-Plattenspinner, um die Platten eine Minute lang herunterzuschleudern. Legen Sie die Platte abschließend auf Eis, bis sie in den Nachverstärkungsraum gebracht und auf den Thermocycler geladen wird.Führen Sie nach der PCR-Amplifikation die Qualitätskontrolle und die Bibliotheksvorbereitung gemäß dem Textprotokoll durch. Der erste QC-Schritt des Protokolls folgt auf die PCR-Amplifikation der 16SV4-Region. Wie hier gezeigt, wurde ein Mikroliter PCR-Produkt aus jeder Probe mittels Elektrophorese analysiert, um zu bestätigen, dass es innerhalb des erwarteten Größenbereichs von 350 bis 450 Basenpaaren lag.Einige Muttermilchproben erzeugten geringere Mengen an spezifischem Produkt, was entweder auf einen geringen Gehalt an extrahierter mikrobieller DNA in diesen Proben oder auf eine Verschleppung von PCR-Inhibitoren während der Extraktion hindeutet. Die Quantifizierung des spezifischen Produkts für jede Probe war entscheidend für die Bestimmung des erforderlichen Volumens für das gleichmäßige molare Pooling der Proben für die Sequenzierung. Eine gepoolte Bibliothek für die gezielte Sequenzierung wird in der Regel von einem bestimmten PCR-Produkt dominiert.Wenn sich eine signifikante Menge an unspezifischem Produkt in der Bibliothek befindet, sollte dem Arbeitsablauf ein Gelaufreinigungsschritt hinzugefügt werden. Die Sequenzierungsergebnisse zeigen eine hohe Diversität in den Taxa, die mit dem Mikrobiom der Muttermilch assoziiert sind, und eine Variabilität in der Anzahl der Sequenzierungsrohre für jede Probe. Im Gegensatz dazu waren die Taxazusammensetzung und die Schilfzahlen für den Bakterienmock vergleichbar mit den Ergebnissen, die für den Mock in früheren Arbeitsablaufläufen erzielt wurden, was darauf hindeutet, dass die beobachtete Variabilität für die Muttermilchproben ein authentisches experimentelles Ergebnis und nicht eine Funktion der intrinsischen Variabilität des Arbeitsablaufs ist.Wenn ein Sequenzierer über Nacht läuft, kann diese Technik in zwei Tagen für 12 bis 24 Proben durchgeführt werden, wenn alle Proben in den ersten PCR-Lauf amplifiziert werden. Wenn nicht, ist ein weiterer Shell-Tag erforderlich. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, nur vom Prä-PCR-Bereich in den Post-PCR-Bereich zu reisen, um eine Kontamination zu vermeiden.Es ist auch wichtig, die Handschuhe häufig zu wechseln, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Proben gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie geeignete Schutzausrüstung und Biosicherheitswerkbänke immer getroffen werden sollten.

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft ist ein langjähriges Ziel in der Umweltmikrobiologie. Next-Generation-Sequencing-Methoden ermöglichen nun die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in einer noch nie dagewesenen Tiefe mit minimalem Kosten- und Arbeitsaufwand. Wir beschreiben hier unseren Ansatz zur Sequenzierung bakterieller ribosomaler 16S-RNA-Gene mit einem Tischsequenzierer.

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Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren.

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Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.

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In diesem Artikel wird beschrieben, wie Sie ein Gerät zusammenbauen, mit dem Milch von Labormäusen gesammelt werden kann. Dieses Gerät ist erschwinglich, tragbar und ermöglicht eine Entnahme von 0,1 bis 0,5 ml Milch durch eine geschulte Person. Ein detailliertes Melkprotokoll ist ebenfalls enthalten.

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Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Bewertung der mikrobiellen Zusammensetzung in Milchprodukten durch die Kombination von Kulturwissenschaften mit MALDI-TOF MS. Es liefert Taxonomieergebnisse, die mit der 16S-rRNA-Sequenzierung vergleichbar sind, mit einer kürzeren Durchlaufzeit als herkömmliche Kulturmethoden.

Bewertung der mikrobiellen Sicherheit von Molkereien mittels Bacterial Proteomic Profiling mittels MALDI-Ansatz

Erfahren Sie die semi-automatisierte 16S-rRNA-Sequenzierung aus humaner Milch und anderen Low-Biomass-Proben. Diese Methode erleichtert die Mikrobiomforschung und liefert wertvolle Erkenntnisse für Gesundheit und Krankheit.

Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben

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