Gleichzeitige Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH Produktion durch Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenases
24. Februar 2018
Mitochondrien enthalten mehrere Flavin-abhängige Enzyme, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produzieren kann. Überwachung von ROS ist Freigabe von einzelnen Standorten in den Mitochondrien schwierig wegen unerwünschten Nebenreaktionen. Wir präsentieren Ihnen eine einfache, kostengünstige Methode zur direkten Beurteilung der native Preise für ROS Release mit gereinigtem Flavoenzymes und Mikrotestplatte Fluorometry.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Produktionsrate von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH von gereinigten flavinhaltigen mitochondrialen Dehydrogenasen mittels Mikroplatten-Fluorometrie zu quantifizieren. Mitrochondrien können bis zu 12 verschiedene Superoxid/Wasserstoffperoxid-bildende Stellen enthalten, die unter Verwendung verschiedener Substrat- und Inhibitorkombinationen mit isolierten Mitochondrien identifiziert wurden. Es gibt jedoch noch einige Schwierigkeiten bei der genauen Quantifizierung der Freisetzungskapazität einzelner Produktionsstätten in isolierten Mitochondrien.
Und dies ist mit unerwünschten Nebenreaktionen verbunden, die ebenfalls reaktive Sauerstoffspezies produzieren, aber auch mit dem Vorhandensein von Antioxidantien und der Verwendung von Inhibitoren, denen es an Spezifität mangelt, zusätzlich zur Verwendung von Additiven, die die Messungen beeinträchtigen können. Hier stellen wir die Methode zur gleichzeitigen Messung der Superoxid/Wasserstoffperoxid- und NADH-Produktion durch gereinigte Flavin-abhängige mitochondriale Dehydrogenasen vor. Diese Methode ist vorteilhaft, da sie eine direkte und genaue Quantifizierung des ROS-produzierenden Potenzials einzelner Produktionsstandorte ermöglicht, indem unerwünschte Nebenreaktionen und reaktive Sauerstoffspezies-Quenching-Systeme eliminiert werden.
Die gleichzeitige Messung der ROS- und NADH-Produktion ermöglicht auch einen direkten Vergleich des Superoxid-/Wasserstoffperoxid-bildenden Potenzials und der Aktivität einzelner Enzyme, was für das Screening von Inhibitoren für die ROS-Produktion vor der Durchführung von Assays mit Mitochondrien wertvoll sein kann. Für unsere Zwecke werden wir hier den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex und den Alpha-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplex aus dem Schweineherzen als Beispiele verwenden. Beides sind flavinhaltige Enzyme und bekannte Quellen für reaktive Sauerstoffspezies.
Darüber hinaus können diese beiden Enzyme leicht aufgereinigt werden. Die gleichzeitige Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH wird durch die Verfolgung von Veränderungen der Fluoreszenz erreicht. NADH hat seine eigenen intrinsischen Blüteneigenschaften, die eine einfache Messung seiner Produktion ermöglichen.
Veränderungen in Superoxid/Wasserstoffperoxid erfordern inzwischen Superoxiddismutatase, Meerrettichperoxidase und Amplex Ultrared Reagenz. In Gegenwart von Meerrettichperoxidase und Wasserstoffperoxid wird das Amplex ultrared von einem nicht fluoreszierenden Molekül in fluoreszierendes Resorufin umgewandelt. Die Superoxiddismutase sorgt dafür, dass jedes Superoxid, das von der zu untersuchenden Dehydrogenase gebildet wird, in Wasserstoffperoxid umgewandelt wird.
Vor der Einrichtung des Assays werden Arbeitslösungen hergestellt. Um den Assay zu rationalisieren, werden alle Reagenzien in die Vertiefungen einer 96-Well-Schwarzplatte in 20-Mikroliter-Aliquoten gegeben. Das Volumen für jede Reaktion in der Vertiefung beträgt 200 Mikroliter, daher sind die Arbeitslösungen das 10-fache der Konzentration, die in der Reaktionsvertiefung gefunden wird.
Programmieren Sie als Nächstes den Mikroplatten-Reader so, dass er einen kinetischen Assay für die duale Messung der NADH-Autofloreszenz und der Resorufin-Fluoreszenz durchführt. Dazu wählen Sie zunächst Prozedur aus und stellen Sie sie auf 25 Grad Celsius ein. Klicken Sie anschließend auf Kinetic starten.
Stellen Sie die Laufzeit auf ca. fünf Minuten ein, gefolgt von der Auswahl eines Fluoreszenz-Leseintervalls von 30 Sekunden. Klicken Sie anschließend auf Lesen und legen Sie die Fluoreszenzmessparameter für Ihren Assay fest. Hier werden die Position der Sonde, die Wellenlängen, die zur Verfolgung von Änderungen der Fluoreszenz verwendet werden, und die Wells, die ausgelesen werden, in die Software eingegeben.
Die verschiedenen Kanäle für die Fluoreszenz-Reads werden ebenfalls ausgewählt, wobei einer für die Autofloreszenz von NADH bestimmt ist, der auf 376 Nanometer Anregung und 450 Nanometer Emissionswellenlängen eingestellt ist. Änderungen der Resorufin-Blüte werden bei 565 Nanometern und 600 Nanometern verfolgt. Sobald die Assay-Bedingungen festgelegt sind, werden die einzelnen Wells mit Puffer und verschiedenen Reagenzien beladen, die zur gleichzeitigen Messung der NADH- und Superoxid-/Wasserstoffperoxidproduktion erforderlich sind.
Die Reihenfolge für die Beladung der Vertiefungen mit verschiedenen Reagenzien lautet wie folgt. Zuerst wird die erforderliche Menge an Puffer in die Vertiefung gegeben, gefolgt von der Zugabe von 20 Mikrolitern gereinigter Enzymlösung. Das Enzym wird im Puffer für einige Minuten im Inneren des Instruments äquilibriert.
Anschließend werden die restlichen Reagenzien in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt. Nachdem das Substrat hinzugefügt wurde, drücken Sie Start. Der Plattenträger gelangt in das Lesegerät und das Protokoll wird gestartet.
Während des Assays können Echtzeitausgaben für rohe relative Fluoreszenzeinheiten (RFUs) mit der Software verfolgt werden. Der Benutzer kann zwischen den verschiedenen Fluoreszenz-Lesevorgängen wechseln, indem er die Registerkarte Daten über dem Well-Layout verwendet. Beachten Sie, dass Kurven für die verschiedenen Fluoreszenz-Messwerte ausgewählt werden können.
Darüber hinaus kann man durch Halten der Strg-Taste auf der Tastatur und Linksklick auf die Vertiefungen ein zusammengesetztes Diagramm erhalten, das den Echtzeitvergleich der verschiedenen Reaktionen ermöglicht. Nach Abschluss des Experiments verlässt der Mikroplattenträger das Instrument. An diesem Punkt werden die Ergebnisse im repräsentativen Diagramm für Änderungen in der RFU nach Excel exportiert.
Rohe RFU-Werte werden exportiert, indem Sie zuerst auf Daten in der repräsentativen RFU-Grafik klicken. Daraus ergibt sich eine Tabelle mit rohen RFU-Werten für NADH und Resorufin-Blütenpracht. Nicht, dass rohe RFU-Zahlen, die Änderungen der NADH- oder Resorufin-Blüte entsprechen, nicht gleichzeitig exportiert werden können.
Nach dem Exportieren werden die Ergebnisse für die Analyse organisiert. Unter Verwendung von Standardkurven für NADH und Resorufin-Blüten, die vor der Durchführung des Assays erzeugt wurden, kann die Menge an NADH in Mikromol und Superoxid/Wasserstoffperoxid in Picomol, die im Laufe der Zeit gebildet werden, berechnet werden. Daran schließt sich die Berechnung der Rate der NADH- und Superoxid-/Wasserstoffperoxidproduktion an.
Für dieses Verfahren ist es wichtig, die Reinheit Ihrer isolierten flavinhaltigen Dehydrogenase vor der Durchführung von Assays zu überprüfen. Dies kann erreicht werden, indem eine einfache Coomassie-Färbung für Proteine durchgeführt wird oder indem die Aktivität des Enzyms in Gegenwart verschiedener Substrate getestet wird. Es ist zu beachten, dass empfohlen wird, Reduktionsmittel wie DTT aus dem Assay wegzulassen, da sie als Substrat für die Superoxid-/Wasserstoffperoxidproduktion durch flavingebundene Dehydrogenasen dienen können.
Insgesamt ist diese Methode insofern hochflexibel, als sie zum Screening von Inhibitoren für die Superoxid-/Wasserstoffperoxidproduktion verwendet werden kann und auch einen direkten Vergleich der ROS-bildenden Kapazität verschiedener flavingebundener mitochondrialer Dehydrogenasen ermöglicht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein genaues Verständnis davon haben, wie man die ROS- und NADH-Produktion durch gereinigte Dehydrogenasen misst. Dieser Assay kann als Sprungbrett für anspruchsvollere Experimente mit isolierten Mitochondrien dienen.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Quantifizierung der Produktionsraten von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH durch gereinigte, flavinhaltige mitochondriale Dehydrogenasen mittels Mikroplatten-Fluorometrie vor. Die Methode behebt die Schwierigkeiten bei der Messung der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) aus einzelnen mitochondrialen Stellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biokemie
- Mitochondriale Biologie
Hintergrund
- Mitochondrien enthalten verschiedene flavinabhängige Enzyme, die ROS erzeugen.
- Eine genaue Quantifizierung der ROS-Freisetzung aus einzelnen Stellen ist schwierig.
- Unerwünschte Nebenreaktionen und das Vorhandensein von Antioxidantien erschweren die Messungen.
- Unterschiedliche Kombinationen von Substraten und Inhibitoren wurden verwendet, um ROS-Produktionsstellen zu identifizieren.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur gleichzeitigen Messung der Produktion von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH.
- Vermeidung unerwünschter Nebenreaktionen bei der Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).
- Direkte Beurteilung des ROS-produzierenden Potenzials mitochondrialer Stellen.
Verwendete Methoden
- Es wurden gereinigte, flavinabhängige mitochondriale Dehydrogenasen verwendet.
- Die Messungen erfolgten mittels Mikroplatten-Fluorometrie.
- Es wurde eine simultane Quantifizierung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH durchgeführt.
- Spezifische Inhibitoren und Substrate wurden genutzt, um individuelle Produktionsorte zu bewerten.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine genaue Quantifizierung der ROS-Produktionsraten.
- Unerwünschte Nebenreaktionen wurden effektiv minimiert.
- Einzelne Stellen der ROS-Produktion wurden erfolgreich bewertet.
- Der Ansatz liefert ein klareres Verständnis der mitochondrialen ROS-Dynamik.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode verbessert die Möglichkeit, die mitochondriale ROS-Produktion zu untersuchen.
- Sie bietet ein zuverlässiges Werkzeug für Forscher, die die mitochondriale Funktion erforschen.
- Die Ergebnisse könnten Auswirkungen auf das Verständnis von oxidativem Stress in Zellen haben.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) durch einzelne mitochondriale Enzyme ist entscheidend für die Zielvalidierung bei der entdeckungsorientierten Arzneimittelforschung im Bereich oxidativer Stress. Diese Methode ermöglicht einen direkten Vergleich von ROS-Bildung und Enzymaktivität und unterstützt so die mechanistische Entschärfung von Risiken bei Flavin-gebundenen Dehydrogenase-Zielen. Durch die Eliminierung störender antioxidativer Systeme und Nebenreaktionen liefert sie eine vorhersagbare Sicherheit für die Inhibitoren-Screening-Verfahren, bevor aufwändige mitochondriale oder zelluläre Assays durchgeführt werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung der nativen ROS-Freisetzungsrate aus gereinigten flavinabhängigen Dehydrogenasen.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH-Produktion an einzelnen Enzymsitzen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Portfolio-Priorisierung, indem die Selektivität und Wirksamkeit von Inhibitoren hinsichtlich der ROS-Produktion vor mitochondrialen Assays getestet werden können.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem standardisierte, quantitative ROS- und NADH-Signale bereitgestellt werden.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet die Mikroplatten-Fluorometrie mit definierten Anregungs- und Emissionswellenlängen (NADH: 376/450 nm; Resorufin: 565/600 nm) für eine konsistente Signalerfassung.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening von Inhibitoren im 96-Loch-Plattenformat mit Reaktionsvolumina von 200 µL.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Dient als Bindeglied für anspruchsvollere Experimente mit isolierten Mitochondrien oder permeabilisierten Muskelfasern, indem grundlegende Beziehungen zwischen ROS und Enzymen etabliert werden.
- Krankheitsrelevantes System: Verwendet den aus Schweineherz gewonnenen Pyruvatdehydrogenase-Komplex (PDHC) und den Alpha-Ketoglutaratdehydrogenase-Komplex (KGDHC) als Modelle für mitochondriale ROS-Quellen, die für Stoffwechsel- und kardiovaskuläre Erkrankungen relevant sind.
- Mechanistische Risikominimierung: Klärt, ob beobachtete Veränderungen der ROS-Konzentration auf die Aktivität des Zielenzyms oder auf Effekte an Nebenzielen beziehungsweise auf Störungen durch Antioxidantien zurückzuführen sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein und liefert quantitative Daten zu ROS und Aktivität, die über Go/No-Go-Entscheidungen informieren, bevor zu komplexen phänotypischen oder präklinischen Modellen übergegangen wird.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die ROS-Produktion spezifischer, an Flavine gekoppelter Dehydrogenasen isoliert wird, wodurch die mechanistische Uneindeutigkeit bei der Pfadanalyse verringert wird.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch standardisierte, gleichzeitige Detektion der NADH-Autofluoreszenz und der Resorufin-Fluoreszenz, was eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen ermöglicht.
- Analytik: Erzeugt quantitative Ergebnisse (NADH in Mikromol, Superoxid/Wasserstoffperoxid in Pikomol über die Zeit), die die Berechnung von Produktionsraten für den Vergleich verschiedener Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem native ROS-Freisetzungsraten einzelner Enzyme vor der Untersuchung in intakten mitochondrialen Systemen definiert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zum Screening flavinabhängiger Enzymziele über verschiedene Projekte hinweg und reduziert so redundante Assay-Entwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Zielvalidierung, indem die mechanistische Mehrdeutigkeit bei der Zuordnung von ROS-Quellen verringert wird.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher durch festgelegte Reihenfolge der Reagenzien, kinetische Einstellungen und Trennung der Fluoreszenzkanäle.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühe Inhibitor-Screening ermöglicht wird und späte Fehlschläge aufgrund unvorhergesehener, ROS-vermittelter Toxizität reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem das ROS-produzierende Potenzial einzelner Enzymsstellen quantifiziert wird, was Entscheidungen zur Zielwahl und Weiterentwicklung informiert.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Enzymreinigung und der Einrichtung fluorometrischer Assays, einschließlich der Überprüfung der Reinheit flavinhaltiger Dehydrogenasen mittels Coomassie-Färbung oder Aktivitätsassays.
- Benötigt einen Mikroplattenreader, der kinetische Messungen mit zwei Wellenlängen (376/450 nm für NADH, 565/600 nm für Resorufin) bei einer Temperaturkontrolle von 25 °C ermöglicht.
- Setzt die Ausschließung reduzierender Agentien wie DTT voraus, da diese als Substrate für die Produktion von Superoxid bzw. Wasserstoffperoxid wirken und die Ergebnisse verfälschen können.
- Erfordert die Herstellung von Arbeitslösungen in 10facher Konzentration, da das Endvolumen 200 µL aus 20-µL-Aliquoten in 96-Well-Platten beträgt.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit von Superoxiddismutase, um Superoxid in Wasserstoffperoxid umzuwandeln, das anschließend mittels Amplex-UltraRed/Horseradish-Peroxidase-System detektiert werden kann.
