Name: Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Leukämie-Stammzellen in akuter myeloischer Leukämie mittels Durchflusszytometrie quantifizieren. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Patientenproben und patientenabgeleiteten Xenotransplantaten zur Verlaufskontrolle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Französisch Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (North Center), Fondation de France (Leukämie Committee), SIRIC Oncolille und französische National Cancer Institute unterstützt.

Wir folgen Europäische Normen für die Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke. Diese Studie wurde von der lokalen Ethikkommission (#3097-2015120414583482v3) genehmigt.
1. die Probenvorbereitung
<ol><li>Knochenmark (2 mL) von de Novo AML in Röhrchen mit Antikoagulanzien Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in einer Konzentration von 1,8 mg / mL Knochenmark zu sammeln.</li>
	<li>Durchzuführen Sie Ficoll Trennung, eine Steigung Dichtetrennung Mononukleäre Zellen von Erythrozyten und Granulozyten, zu isolieren, wie folgt. Verdünnen Sie Knochenmark in 3 Bänden von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS: NaCl 137 mM, KCl-2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). 1 Volumen von Ficoll mit 1 Volumen von verdünnten Knochenmark sorgfältig zu überlagern. 30 Minuten bei 300 X g ohne Bremse zu spinnen. Übertragen Sie die weißen buffy Coat Schicht Mononucleated Zellen in ein neues steriles Röhrchen.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen zweimal in 10 mL PBS) und Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min um kontaminierende Serumkomponenten zu entfernen.</li>
</ol>2. lyse der Erythrozyten (RBC)
<ol><li>Hinzufügen von 2 mL Lyse-Puffer (Ammoniumchlorid 0,8 %) für die Zelle Pellets, Wirbel sanft und in 5 min. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Falls erforderlich, wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Wie zuvor beschriebenen Wash Zellen mit PBS-Puffer (1.3.).</li>
</ol>3. Patienten abgeleitet Xenotransplantate.
<ol><li>Blast-Zellen aus dem Knochenmark nach Ficoll Trennung erhalten und nach Erschöpfung der Lymphozyten mit Immunomagnetic negative Auswahl (CD3 für t- und CD20 für B-Lymphozyten). Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>5 x 106 AML Blasten in die Rute Vene unbedingte NSG Mäuse zu injizieren. Verwenden Sie eine Haltevorrichtung Schweif Vene Injektion zu erleichtern. Halten Sie Mäuse unter herkömmlichen Bedingungen und vor allem unter spezifischen-Pathogen-freies Bedingungen überhaupt, Zeiten, indem einzelne belüftete Käfige und Manipulation unter Laminar-Flow-Haube. Nehmen Sie alle zwei Wochen 60 µL Blut durch die submandibulären Sammlung-Methode mit einem Hämatokrit Kapillaren. Ort der Kapillare in 5 mL Runde Unterrohr. Stoppen Sie die Blutung durch sanften Druck mit einem kleinen sterilen Tupfer. Ausspülung Blut mit einer sauberen Spritze.</li>
	<li>Fügen Sie 1ml Lyse-Puffer und 5min inkubieren. Dann für 5 Minuten bei 300 X g für 5min. Waschen mit PBS und Centrifugre bei 300 X g zentrifugieren. Entfernen Sie überstand, Add 100 µL PBS mit 10 % Rinderserumalbumin (BSA) Fleck mit 3 µL Anti-Human CD45-FITC und 1 µL Anti-Murine CD45-APC und 30 Minuten bei 4 ° C inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie Zelle Pellet zweimal mit PBS-Puffer (2 mL) mit 10 % BSA und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Aliquoten bis zu 1 x 106 Zellen pro 100 µL PBS in Flow Cytometry Röhren.</li>
	<li>Umfrage Engraftment alle zwei Wochen durch Chimerism Analyse von CD45 Ausdruck (menschliche gegen murine) mittels Durchflusszytometrie (Abb. 2A und B).</li>
	<li>Unter Opfern (periphere Explosion Count größer als 70 % oder schweren klinischen Anzeichen der Krankheit), sammeln Sie mononukleären Blasten aus zerkleinerten Milz und Knochenmark durch Spülung Tibien und Oberschenkelknochen mit PBS wie oben beschrieben13. Einschläfern Sie Mäuse durch zervikale Dislokation nach internationalen Richtlinien.</li>
	<li>Wenn Zelle Pellet RBC enthält, führen Sie lyse der roten Blutkörperchen mit Lyse Puffer (Schritt 2.1).</li>
	<li>Waschen Sie Zellen Pellet zweimal mit PBS-Puffer (2 mL) mit 10 % BSA und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen und aliquoten bis zu 1 x 106 Zellen pro 100 µL PBS in Flow Cytometry Röhren.</li>
</ol>(4) Färbung
<ol><li>Fügen Sie konjugierten Antikörpern (siehe Schritt 4.2) und Wirbel. Inkubieren Sie Zellen für 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verwenden Sie das folgende Panel für menschliche Grund- oder PDX Proben bestehend aus 10 µL Anti-CD36-FITC, 5 µL des Anti-CD19-ECD, 5 µL Anti-CD33-PC5.5, 5 µL Anti-CD90-APC, 5 µL Anti-CD34-AA700, 5 µL Anti-CD45RA-APC-H7, 5 µL Anti-CD38-Pacific Blue, 5 µL Anti-CD123-PC7 und 2,5 µL Anti-CD45-KO.</li>
	<li>Ungebundenen Antikörper durch die Zellen in 2 mL PBS durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min waschen zu entfernen.</li>
	<li>Wieder aussetzen Sie Zellen in 450 µL PBS für endgültige durchflusszytometrischen Analyse.</li>
</ol>5. gating Strategie für Flow-Zytometrie-Analyse
<ol><li>Durchführen Sie Datenerfassung (mindestens 500.000 Zellen) auf einem Durchflusszytometer ausgestattet mit roten, blauen und violetten Lasern. Überprüfen Sie die Einstellungen der Cytometer täglich für 1) optische Ausrichtung, 2) fluidische System und (3) optische Empfindlichkeit 4) Standardisierung mit fluorospheres</li>
	<li>Folgen Sie der sequentiellen gating Strategie definieren CD38 Ausdruck (Abbildung 1).<ol>
<li>Verwenden Sie Zellen von normalen Knochenmarkproben zur Definition Hematogones oder Plasma-Zellen dienen als Positivkontrolle für CD38 Ausdruck. Hinweis: dieses Tor ist vor allem wichtig zu beurteilen, da seine Definition anschließenden vermeintlichen LSC Bevölkerung abhängen.</li>
		<li>CD45dim/SSC (Side Scatter) geringe Bevölkerungsdichte Kriterien (Abbildung 1A) physiologische Vorläufer Zellen (normale Blasten) eingrenzen. Innerhalb dieser Population Explosion definieren Hematogones, die eine CD38 anzeigen ++ CD19 + Phänotyp (Abbildung 1 b) und schließlich CD36 und CD33 Ausdruck verwenden, um Myeloblasts, Monoblasts und Erythroblasts (Abbildung 1) zu definieren. CD34 Ausdruck auf Hematogones zu bestimmen, wie in (Abbildung 1E) dargestellt. Bewerten Sie mehrere Subpopulationen von Vorstufen innerhalb der Blasten definiert als P6-P10 (Abbildung 1). Trennen Sie das CD34-Fach von Blasten in P6, P7, P8 Stammvater Subpopulationen basierend auf vordefinierten CD38 Tore. Sicherstellen Sie, dass die P8-Fach die Blasten, die die gleiche CD38 Intensität wie die Hematogones enthält, dass P6 Zellen enthält die CD38-basierend auf die CD38 Fluoreszenz minus 1 (FMO) Kontrolle und P7 Zellen zwischen den beiden extremen hinsichtlich CD38 sind Ausdruck (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die CD34 + 38-(P6) trennen geschlossene Zellen HSC aus vermeintlichen LSC mit CD90 und CD45RA Ausdruck (Abb. 1F). Hinweis: der HSC-Phänotyp ist CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- und die multipotent Vorfahre (MPP) sind definiert als CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Der vermeintliche LSC-Phänotyp ist CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + und mehr unreife nachgelagerten Bevölkerung sind die lymphatischen grundiert Vorfahre (LMPP) definiert als CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.</li>
</ol>(6) MRD Überwachung durch RT-PCR
<ol><li>Überwachen Sie durch RT-PCR, wie zuvor beschrieben14MRD.</li>
</ol>

<ol><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origins+of+relapse+in+acute+myeloid+leukaemia+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Jordan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin-3+receptor+alpha+chain+is+a+unique+marker+for+human+acute+myelogenous+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells.</a> Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).</li>
<li>van Rhenen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+AML+stem+cell+associated+antigen+CLL-1+aids+in+discrimination+between+normal+and+leukemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.</a> Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).</li>
<li>Bonardi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+and+transcriptomics+approach+to+identify+leukemic+stem+cell+%28LSC%29+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).</li>
<li>Kikushige, Y., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TIM-3+as+a+Leukemic+Stem+Cell+Surface+Molecule+in+Primary+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia.</a> Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Kersten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45RA%2C+a+specific+marker+for+leukaemia+stem+cell+sub-populations+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.</a> Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+17-gene+stemness+score+for+rapid+determination+of+risk+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia.</a> Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advances+in+the+Measurement+of+Residual+Disease+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Med. 6 (9), (2017).</li>
<li>Swamydas, S., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Gabert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+control+studies+of+%27real-time%27+quantitative+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+of+fusion+gene+transcripts+for+residual+disease+detection+in+leukemia+-+a+Europe+Against+Cancer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program.</a> Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Eine genaue und reproduzierbare Beurteilung der Membran oder zytoplasmatischen Marker durch Durchflusszytometrie erfordert, dass Geräteeinstellungen für optische Ausrichtung, das ordnungsgemäße Funktionieren der fluidische System, optische Empfindlichkeit und Standardisierung täglich überprüft werden unter Verwendung der Kalibrierung Korne.
Nachweis von Blast Zell-Populationen in AML mit CD90 und CD45RA durch multiparametrischen Flow-Zytometrie-Analyse ist eine relativ einfache und zuverlässig...

Akuter myeloischer Leukämie (AML) ist die häufigste Ursache der Leukämie-assoziierten Sterblichkeit. AML ist zunächst eine klonale Erkrankung der blutbildenden Stammzellen (HSC) zeichnet sich durch die Verhaftung der Differenzierung, nachfolgende Anhäufung von Blasten, und reduziert die Produktion von hämatopoetischen Funktionselemente. Vor kurzem wurde klonale Heterogenität der Explosion Zellpopulation im Wesentlichen durch die Verwendung der nächsten Generation Sequencing (NGS) Strategien und zeigen die Existenz der Intra klonale Evolution von Tumor-Zellen1gegründet.
Heterogenität erstreckt sich auf das Vorhandensein von leukämischen Stammzellen (LSC). Es wird vermutet, die diese dynamische Zellkompartiment entwickelt, um verschiedene Auswahl Druck auferlegt bei Leukämie Progression und Behandlung zu überwinden. Daher LSC sollen resistent gegenüber aktuellen chemotherapeutischen Therapien und Krankheit Rückfall mit profunden klinischen Implikationen2zu vermitteln. Verschiedene Marker wurden zur Charakterisierung von LSC wie CD1233, CLL-14, CD975 oder TIM-36beschrieben. CD34 + CD38-Abteil des Blastenzellen gilt für LSC7 angereichert werden aber auch normale HSC. CD90 und CD45RA Ausdruck angewendet, die CD34 + CD38-Fach (P6) (Abbildung 1) ermöglicht es, um mehrere Stufen von normalen und malignen hämatopoetischen Vorläufer8zu trennen. Speziell, normale CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent Vorfahre (MPP) wie CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-Zellen und CD34 + CD38-CD90-CD45RA + lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP) Zellen, in der Mehrzahl der AML ermittelt werden Fälle8 ,9. Der mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von CD38 ist besonders wichtig, innerhalb der CD34 + Zellkompartiment berücksichtigt werden. Da CD38 Intensität drei neue Zelle Fächer davon definiert: CD38 negativ (P6), CD38 Dim (P7) und CD38 hell (P8) (Abbildung 1). Die MFI CD38 kann entweder Hematogones und/oder Plasmazellen als interne positive Kontrolle mit, wie diese Zellen stark CD38 ausdrücken bestimmt werden.
Die immungeschwächte NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) Maus-Modell ist weit verbreitet für Engraftment des normalen und bösartigen Menschen hämatopoetischen Zellen10,11. Serielle Xenotransplantation Assays werden verwendet, um experimentell LSC oder HSC-Funktion überprüfen. Diese Studien wurden weitgehend durch groß angelegte Sequenzierung Ansätze analysiert. Dennoch ist weniger über die LSC und HSC Immunophenotype AML Explosion Bevölkerung pfropfte in NSG-Mäuse im Vergleich zu seiner primären AML (Abbildung 2) bekannt.
Die Zahl der LSC sind somit von Natur aus niedrigen, Identifizierung und Quantifizierung der LSC sind anspruchsvoll und die hier beschriebene Methode verwendet werden als ein Fluss durchflusszytometrischen Assay zum Zeitpunkt der Diagnose und bei klinischen Folgen bis Chemotherapie Antwort bewerten (wie passives LSC kann verursachen Sie AML Rückfall). Das Vorhandensein von LSC möglicherweise positiven minimalen Resterkrankung (MRD). Bis dato MRD Überwachung in AML meist verlassen Sie sich auf molekulare Methoden (d.h., RT-PCR, NGS)10,12. Jedoch in diesem Protokoll erkennen wir gleichzeitige Protein-Expression von mehreren HSC/LSC-Markern (CD34, CD38, CD45RA, CD90) auf primäre Blastenzellen des menschlichen AML durch multiparametric Flow Cytometry2,8,9. Diese Kombination von Antikörpern kann in jedem standard Flow Cytometry Labor angewendet werden und dieser Fluss-MRD-Assay ist besonders interessant, wenn MRD durch Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) nicht möglich ist, d. h., wenn Leukämie spezifische molekulare Marker sind nicht in die Diagnose AML Probe nachweisbar. Darüber hinaus ist dieses Protokolls komplementär zu empfindlicheren molekularen MRD-Verfahren, da es darum geht zu erkennen und zu quantifizieren, die abnorme hämatopoetischen Vorläuferzellen die repräsentiert einer funktionelle Zelle-Eigenschaft (Abbildung 3).
Wir zeigen, wie Sie drei hämatopoetischen Vorläuferzellen Populationen und die vermeintliche LSC-Fach mit unterschiedlichen Grad der Reifung durch Durchflusszytometrie mit Antikörpern zur Verfügung, in der Mehrzahl der klinischen Labors zu quantifizieren. Darüber hinaus wir bestätigte das Vorhandensein dieser Zelle Abteilungen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate (PDX) und bei der Behandlung verfolgen.

<table><tbody><tr><td>Pancoll</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer (10x)</td><td>Ozyme</td><td>BLE420301</td><td>Erythrozyten-Lyselösung A: 8,29 g NH4Cl + 0,037 g Na2EDTA in 100 ml steriler H2O und Erythrozyten-Lyselösung B: 1 g KHCO3 in 100 ml sterilem H2</td></tr><tr><td>O NOD/SCID/IL2R&gamma; cnull&nbsp; (NSG)&nbsp; Mäuse</td><td>JACKSON LABORATORY</td><td>Lager-Nr.: 005557</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco von life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer &ndash; MACS Separation Buffer</td><td>MACS Buffer Miltenybiotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD36-FITC (Klon FA6-152, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN IM0766U</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD33-PC5.5 (Klon D3HL60.251, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-APC (Klon 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-ECD (Klon J3-119, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-AA700 (Klon 581, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45RA-APC-H7 (Klon HI100)&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-Pacific Blue (Klon LSI98-4-3, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92396</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-KO (Klon J.33, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07747</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD123-PC7</td><td>Beckman Schar</td><td>B13647</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Set</td><td>Beckman Schar</td><td>A63492</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check</td><td>Beckman Schar</td><td>A63493</td><td></td></tr><tr><td>Navios</td><td>Beckman Schar</td><td>DS-14644A</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CST BD</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>FacsFlow&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>336911</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>BLE304006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>BLE103112</td><td></td></tr><tr><td>EasySep PE-Auswahlkit für den Menschen</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&nbsp; magnet&nbsp;</td><td>Stammzellen-Technologien</td><td>18551</td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry um leukämie-stammzellen in primäre akute myeloische leukämie und patienten-abgeleitet-xenotransplantate bei diagnose und folgen bis zu schätzen

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Akuter myeloischer Leukämie (AML) ist eine heterogene, und wenn Sie nicht behandelt, tödliche Krankheit. Es ist die häufigste Ursache der Leukämie-assoziierten Sterblichkeit bei Erwachsenen. AML ist zunächst eine Erkrankung des blutbildenden Stammzellen (HSC) zeichnet sich durch die Verhaftung der Differenzierung, nachfolgende Ansammlung der Leukämiezellen Blast, und reduziert die Produktion von hämatopoetischen Funktionselemente. Heterogenität erstreckt sich auf das Vorhandensein von Leukämie-Stammzellen (LSC), mit dieser dynamischen Zelle Fach weiterentwickelt wird, um verschiedene Auswahl-Druck zu überwinden während Leukämie Progression und Behandlung auferlegt. Um die LSC-Bevölkerung weiter zu definieren, ermöglicht das Hinzufügen von CD90 und CD45RA die Diskriminierung von normalen HSCs und multipotenten Vorläuferzellen innerhalb der CD34 + CD38 Zellkompartiment. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck mehrere vermeintliche LSC-Marker (CD34, CD38, CD45RA, CD90) zu erkennen am primären Blastenzellen des menschlichen AML durch multiparametric Durchflusszytometrie. Darüber hinaus zeigen wir, wie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate. Diese Methode zur Erkennung und Quantifizierung von vermeintlichen LSC für die klinische Weiterbehandlung der Chemotherapie Antwort verwendet werden (zB., minimaler Resterkrankung), als passives LSC AML Rückfall verursachen.

Hier präsentieren wir eine Methode zum Stammvater Populationen in normalen und bösartigen menschlichen Knochenmarkproben zu bestimmen. Wir sammelten Knochenmark und Milz von einer erfolgreichen PDX und multiparametric Durchflusszytometrie durchgeführt, wie oben beschrieben. Wir verglichen mehrere Subpopulationen von Blasten zwischen der diagnostischen Patientenprobe und die entsprechenden PDX und insbesondere das CD34 + CD38-Vorläuferzellen Fach, vor allem in vermeintlichen LSC bereichert. Wir haben festgestellt, dass di...

Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Abschätzung von Leukämiestammzellen bei akuter myeloischer Leukämie und in patientenabgeleiteten Xenotransplantaten mittels Durchflusszytometrie bei der Diagnose und bei der Nachbehandlung der Behandlung. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Hämatologie/Onkologie beantworten, wie z.B. die klinische Relevanz der quantitativen Beurteilung von Leukämiestammzellen mittels Durchflusszytometrie bei akuter myeloischer Leukämie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in den meisten Hämatologie-/Onkologielabors mit häufig verwendeten Antikörpern anwendbar ist.Dieses Verfahren wird von Thomas, einem Postdoktoranden, Fanny, einer Doktorandin, und Adeline, einer Ingenieurin aus meinem Labor, demonstriert. Zu Beginn sammeln Sie zwei Milliliter Knochenmark aus de novo AML in Röhrchen, die 1,8 Milligramm pro Milliliter des Antikoagulans EDTA enthalten. Isolieren Sie mononukleäre Zellen aus roten Blutkörperchen und Granulozyten, indem Sie zuerst das Knochenmark in drei Volumina PBS verdünnen.Überlagern Sie dann vorsichtig ein Volumen Ficol mit einem Volumen verdünntem Knochenmark. Den Dichtegradienten bei 300 g 30 Minuten lang ohne Pause drehen. Übertragen Sie dann die weiße Buffy-Coat-Schicht aus einkernigen Zellen in ein neues steriles Röhrchen.Um die Überstände zu entfernen, die die Serumbestandteile kontaminieren, fügen Sie 10 Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g, bevor Sie die Wäsche wiederholen. Lysieren Sie die roten Blutkörperchen, indem Sie dem Zellpellet zwei Milliliter Lysepuffer hinzufügen und sanft vortexen. Inkubieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g fünf Minuten lang und entfernen Sie den Überstand. Verwenden Sie dann PBS, um die Zellen zu waschen. Nach der Isolierung von Blastenzellen aus dem Knochenmark gemäß dem Textprotokoll wird unter einer Laminar-Flow-Haube eine unkonditionierte NSG-Maus in eine Rückhaltevorrichtung eingeführt und fünfmal 10 bis die sechste AML-Blastenzelle in die Schwanzvene injiziert.Bringen Sie die Maus unter konventionellen und spezifisch erregerfreien Bedingungen in einen individuell beatmeten Käfig zurück. Verwenden Sie alle zwei Wochen eine submandibuläre Entnahmemethode mit einer Hämatokritkapillare, um 60 Mikroliter Blut zu entnehmen. Übertragen Sie die Kapillare in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen und üben Sie dann mit einem sterilen Mullkissen sanften Druck aus, um die Blutung zu stoppen.Geben Sie einen Milliliter Lysepuffer in das Röhrchen und wirbeln Sie es vorsichtig ein. Inkubieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für fünf Minuten.Dann, nach Entfernen des Überstands, 100 Mikroliter PBS mit 10 % BSA, drei Mikroliter Anti-Human-CD45 FITC hinzufügen und 30 Minuten inkubieren. Waschen Sie dann das Zellpellet zweimal in PBS, zwei Milliliter, mit 10 % BSA und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 300 g. Verwenden Sie alle zwei Wochen die Durchflusszytometrie, um die Transplantation durch Chimärismusanalyse der menschlichen und murinen CD45-Expression zu analysieren.Wenn die Blastenzahl mehr als 70 % beträgt oder schwere klinische Krankheitssymptome beobachtet werden, töten Sie das Tier und entnehmen Sie mononukleäre Blastenzellen aus einer zerquetschten Milz und aus dem Knochenmark, indem Sie PBS verwenden, um Tibias und Femure wie zuvor beschrieben zu spülen. Um eine Panelfärbung durchzuführen, kombinieren Sie konjugierte Antikörper mit humanen Primär- oder Patienten-Xenotransplantat- oder PDX-Proben und wirbeln Sie die Röhrchen auf. Inkubieren Sie die Zellen dann im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 bis 30 Minuten.Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper, indem Sie zwei Milliliter PBS verwenden, um die Zellen zu waschen. Resuspendieren Sie die Zellen in 450 Mikrolitern PBS und fahren Sie dann mit der Durchflusszytometrie-Analyse und MRD-Überwachung fort. Um die Membran von zytoplasmatischen Markern durch Durchflusszytometrie genau und reproduzierbar zu beurteilen, überprüfen Sie die optische Ausrichtung.Die richtige Abstimmung des 3D-Systems und der optischen Empfindlichkeit und Stomatisierung mit Hilfe der Stomazin-Kalibrierung schlägt jeden Tag. Verwenden Sie normales Knochenmark, um die Gates für CD38 zu setzen. Es sind mindestens 500.000 Ereignisse erforderlich, und es wird überprüft, ob jeder Flow-Lauf regelmäßig und homogen ist.Außerdem werden Dubletten, sowie abgestorbene Zellen und Zelltrümmer ausgeschieden. Unreife hämatopoetische Zellen werden dadurch definiert, dass sie CD45-intermediär und SSC-niedrig sind. Und die CD38-Positivkontrolle oder Hämatogonen sind CD19/CD38 doppelt positiv.Dann werden P8 oder CD38 positiv, P7 oder CD38 intermediär und P6 oder CD38 negativ definiert. Die P6-Zellen können weiter in HSC, MPP und LSC unterteilt werden. Da es sich um ein normales Knochenmark handelt, ist es LSC-negativ.Mit Hilfe der multiparametrischen Durchflusszytometrie wurde festgestellt, dass die CD34-positive, CD38-negative Blastenfraktion bei PDX im Vergleich zur diagnostischen Patientenprobe höher war. Interessanterweise wurde in der PDX ein höherer Prozentsatz an putativem LSC im Vergleich zur primären Patientenprobe gefunden, was auf eine mögliche Anreicherung von malignen Vorläuferzellen in den hämatologischen Geweben in diesem Mausmodell hindeutet. Beim Vergleich der Blastenvorläuferpopulationen in zwei verschiedenen Patientenproben stieg die CD34-positive, CD38-negative Fraktion von 0,06 % bei der Diagnose auf 3,33 % bei der ersten Nachbeobachtung der Behandlung beim ersten Patienten.Im Gegensatz dazu sank der CD34-positive, CD38-negative Anteil beim zweiten Patienten von 7,8 % bei der Diagnose auf 2,27 % bei der ersten Nachbeobachtung der Behandlung. Dementsprechend stieg die putative LSC-Fraktion beim ersten Patienten von 0 % bei der Diagnose auf 0,65 % und sank beim zweiten Patienten von 6,57 % bei der Diagnose auf 1,44 % bei der Nachbeobachtung der Behandlung. Ein Minimal-Resterkrankungs- oder MRD-Monitoring, bei dem die NPM1-Mutation bei Patient eins und die CBF-beta MYH11-Genfusion bei Patient zwei als molekulare Marker verwendet wurden, zeigte, dass die molekulare MRD beim ersten Patienten im Vergleich zum zweiten Patienten zum ersten Behandlungsnachsorgezeitpunkt weniger abnahm.Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Während Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, die durchflusszytometrischen Einstellungen und die CD38-Messung zu überprüfen. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden durchgeführt werden, wie z.B. die durchflusszytometrische Zellsortierung, um zusätzliche Fragen wie die Beurteilung funktioneller Leukämiestammzellen zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Leukämiestammzellen in Patientenproben in patientenabgeleiteten Xenotransplantaten nachweisen und quantifizieren kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Patientenproben gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie GOP-Richtlinien und institutionelle Sicherheitsverfahren getroffen werden sollten.

flow-cytometry-to-estimate-leukemia-stem-cells-primary-acute-myeloid

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Nachweis von minimal oder messbare Resterkrankung (MRD) ist eine wichtige prognostische Biomarker für die Verfeinerung der Risikobewertung und Vorhersage von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML). Diese umfassende Leitlinien und Empfehlungen mit best Practices für konsistente und genaue Identifizierung und Nachweis von MRD, können helfen, effektive Entscheidungen für AML-Behandlung.

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Die MDS-Diagnose ist schwierig bei fehlender morphologischer Kriterien oder nicht-informativen Zytogenetik. MFC könnte dazu beitragen, den MDS diagnostischen Prozess zu verfeinern. Nützlich für die klinische Praxis zu werden, die MFC-Analyse muss auf Parametern beruhen mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und Daten sollten zwischen verschiedenen Betreibern reproduzierbar sein.

Datenbank-geführte Durchflusszytometrie zur Auswertung von Knochenmark myeloische Zellen Reifung

Wir beschreiben die Verwendung von hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Das maligne Potential der gentechnisch veränderten blutbildenden Zellen zu beurteilen. HSCT ist nützlich für die Bewertung der verschiedenen malignen hämatopoetischen Zellen in Vivo sowie die Generierung einer großen Kohorte von Mäusen mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder Leukämie um neue Therapien zu bewerten.

Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms

Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Wir präsentieren zwei verschiedene Färbeprotokolle für den Nachweis von NKG2D-Liganden (NKG2DL) in Humanproben mit primärer akuter myeloischer Leukämie (AML). Der erste Ansatz basiert auf einem Fusionsprotein, das in der Lage ist, alle bekannten und möglicherweise noch unbekannten Liganden zu erkennen, während das zweite Protokoll auf der Zugabe mehrerer Anti-NKG2DL-Antikörper beruht.

Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Hier wird eine auf Phosphoflow-Zytometrie basierende Methode zur Analyse der Signalwege stromabwärts der mTORC1-, JAK/STAT5- und MAPK-Signalwege in akuten humanen myeloischen Leukämiezellen beschrieben, die in Mäuse xenotransplantiert und aus Knochenmarkaspiraten gewonnen wurden. Die Werte von p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 und p-ERK1/2 werden gleichzeitig mit einem spektralen Durchflusszytometer der nächsten Generation mit hoher Empfindlichkeit gemessen.

Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie

Dieses Protokoll beschreibt die In-Ovo-Xenotransplantation von patienteneigenen B- und T-Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL), die 4 Tage nach der Injektion erfolgt.

In Ovo Xenotransplantation von patienteneigenen Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) (PDX-ALL)

Das Protokoll zielt darauf ab, ein Mausmodell zur Erzeugung von Schüben akuter lymphatischer Leukämie zu beschreiben, basierend auf der Dynamik des Ansprechens auf eine Induktionschemotherapie.

Mausmodell des Leukämie-Rezidivs zur Induktionschemotherapie bei akuter lymphatischer Leukämie

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von zentrifugalen Sammelnetzwerk primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen.

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

Erfahren Sie, wie Sie Leukämie-Stammzellen in akuter myeloischer Leukämie mittels Durchflusszytometrie quantifizieren. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Patientenproben und patientenabgeleiteten Xenotransplantaten zur Verlaufskontrolle.

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen (Video) | JoVE Journal

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Weitere Videos entdecken