Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Abschätzung von Leukämiestammzellen bei akuter myeloischer Leukämie und in patientenabgeleiteten Xenotransplantaten mittels Durchflusszytometrie bei der Diagnose und bei der Nachbehandlung der Behandlung. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Hämatologie/Onkologie beantworten, wie z.B. die klinische Relevanz der quantitativen Beurteilung von Leukämiestammzellen mittels Durchflusszytometrie bei akuter myeloischer Leukämie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in den meisten Hämatologie-/Onkologielabors mit häufig verwendeten Antikörpern anwendbar ist.

Dieses Verfahren wird von Thomas, einem Postdoktoranden, Fanny, einer Doktorandin, und Adeline, einer Ingenieurin aus meinem Labor, demonstriert. Zu Beginn sammeln Sie zwei Milliliter Knochenmark aus de novo AML in Röhrchen, die 1,8 Milligramm pro Milliliter des Antikoagulans EDTA enthalten. Isolieren Sie mononukleäre Zellen aus roten Blutkörperchen und Granulozyten, indem Sie zuerst das Knochenmark in drei Volumina PBS verdünnen.

Überlagern Sie dann vorsichtig ein Volumen Ficol mit einem Volumen verdünntem Knochenmark. Den Dichtegradienten bei 300 g 30 Minuten lang ohne Pause drehen. Übertragen Sie dann die weiße Buffy-Coat-Schicht aus einkernigen Zellen in ein neues steriles Röhrchen.

Um die Überstände zu entfernen, die die Serumbestandteile kontaminieren, fügen Sie 10 Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g, bevor Sie die Wäsche wiederholen. Lysieren Sie die roten Blutkörperchen, indem Sie dem Zellpellet zwei Milliliter Lysepuffer hinzufügen und sanft vortexen. Inkubieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g fünf Minuten lang und entfernen Sie den Überstand. Verwenden Sie dann PBS, um die Zellen zu waschen. Nach der Isolierung von Blastenzellen aus dem Knochenmark gemäß dem Textprotokoll wird unter einer Laminar-Flow-Haube eine unkonditionierte NSG-Maus in eine Rückhaltevorrichtung eingeführt und fünfmal 10 bis die sechste AML-Blastenzelle in die Schwanzvene injiziert.

Bringen Sie die Maus unter konventionellen und spezifisch erregerfreien Bedingungen in einen individuell beatmeten Käfig zurück. Verwenden Sie alle zwei Wochen eine submandibuläre Entnahmemethode mit einer Hämatokritkapillare, um 60 Mikroliter Blut zu entnehmen. Übertragen Sie die Kapillare in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen und üben Sie dann mit einem sterilen Mullkissen sanften Druck aus, um die Blutung zu stoppen.

Geben Sie einen Milliliter Lysepuffer in das Röhrchen und wirbeln Sie es vorsichtig ein. Inkubieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für fünf Minuten.

Dann, nach Entfernen des Überstands, 100 Mikroliter PBS mit 10 % BSA, drei Mikroliter Anti-Human-CD45 FITC hinzufügen und 30 Minuten inkubieren. Waschen Sie dann das Zellpellet zweimal in PBS, zwei Milliliter, mit 10 % BSA und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 300 g. Verwenden Sie alle zwei Wochen die Durchflusszytometrie, um die Transplantation durch Chimärismusanalyse der menschlichen und murinen CD45-Expression zu analysieren.

Wenn die Blastenzahl mehr als 70 % beträgt oder schwere klinische Krankheitssymptome beobachtet werden, töten Sie das Tier und entnehmen Sie mononukleäre Blastenzellen aus einer zerquetschten Milz und aus dem Knochenmark, indem Sie PBS verwenden, um Tibias und Femure wie zuvor beschrieben zu spülen. Um eine Panelfärbung durchzuführen, kombinieren Sie konjugierte Antikörper mit humanen Primär- oder Patienten-Xenotransplantat- oder PDX-Proben und wirbeln Sie die Röhrchen auf. Inkubieren Sie die Zellen dann im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 bis 30 Minuten.

Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper, indem Sie zwei Milliliter PBS verwenden, um die Zellen zu waschen. Resuspendieren Sie die Zellen in 450 Mikrolitern PBS und fahren Sie dann mit der Durchflusszytometrie-Analyse und MRD-Überwachung fort. Um die Membran von zytoplasmatischen Markern durch Durchflusszytometrie genau und reproduzierbar zu beurteilen, überprüfen Sie die optische Ausrichtung.

Die richtige Abstimmung des 3D-Systems und der optischen Empfindlichkeit und Stomatisierung mit Hilfe der Stomazin-Kalibrierung schlägt jeden Tag. Verwenden Sie normales Knochenmark, um die Gates für CD38 zu setzen. Es sind mindestens 500.000 Ereignisse erforderlich, und es wird überprüft, ob jeder Flow-Lauf regelmäßig und homogen ist.

Außerdem werden Dubletten, sowie abgestorbene Zellen und Zelltrümmer ausgeschieden. Unreife hämatopoetische Zellen werden dadurch definiert, dass sie CD45-intermediär und SSC-niedrig sind. Und die CD38-Positivkontrolle oder Hämatogonen sind CD19/CD38 doppelt positiv.

Dann werden P8 oder CD38 positiv, P7 oder CD38 intermediär und P6 oder CD38 negativ definiert. Die P6-Zellen können weiter in HSC, MPP und LSC unterteilt werden. Da es sich um ein normales Knochenmark handelt, ist es LSC-negativ.

Mit Hilfe der multiparametrischen Durchflusszytometrie wurde festgestellt, dass die CD34-positive, CD38-negative Blastenfraktion bei PDX im Vergleich zur diagnostischen Patientenprobe höher war. Interessanterweise wurde in der PDX ein höherer Prozentsatz an putativem LSC im Vergleich zur primären Patientenprobe gefunden, was auf eine mögliche Anreicherung von malignen Vorläuferzellen in den hämatologischen Geweben in diesem Mausmodell hindeutet. Beim Vergleich der Blastenvorläuferpopulationen in zwei verschiedenen Patientenproben stieg die CD34-positive, CD38-negative Fraktion von 0,06 % bei der Diagnose auf 3,33 % bei der ersten Nachbeobachtung der Behandlung beim ersten Patienten.

Im Gegensatz dazu sank der CD34-positive, CD38-negative Anteil beim zweiten Patienten von 7,8 % bei der Diagnose auf 2,27 % bei der ersten Nachbeobachtung der Behandlung. Dementsprechend stieg die putative LSC-Fraktion beim ersten Patienten von 0 % bei der Diagnose auf 0,65 % und sank beim zweiten Patienten von 6,57 % bei der Diagnose auf 1,44 % bei der Nachbeobachtung der Behandlung. Ein Minimal-Resterkrankungs- oder MRD-Monitoring, bei dem die NPM1-Mutation bei Patient eins und die CBF-beta MYH11-Genfusion bei Patient zwei als molekulare Marker verwendet wurden, zeigte, dass die molekulare MRD beim ersten Patienten im Vergleich zum zweiten Patienten zum ersten Behandlungsnachsorgezeitpunkt weniger abnahm.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Während Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, die durchflusszytometrischen Einstellungen und die CD38-Messung zu überprüfen. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden durchgeführt werden, wie z.B. die durchflusszytometrische Zellsortierung, um zusätzliche Fragen wie die Beurteilung funktioneller Leukämiestammzellen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Leukämiestammzellen in Patientenproben in patientenabgeleiteten Xenotransplantaten nachweisen und quantifizieren kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Patientenproben gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie GOP-Richtlinien und institutionelle Sicherheitsverfahren getroffen werden sollten.