Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen in der proteinbasierten Forschung zu beantworten, wie die Annotation neuer Proteine oder Proteindomänen, die Charakterisierung struktureller und funktioneller Eigenschaften bekannter Proteine, die Definition von Protein-Interaktionsnetzwerken oder Antigen-Antikörpersignaturen unter verschiedenen Bedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie völlig unvoreingenommen, hoher Durchsatz und modular für jede Art von Studie ist, die von einem einzelnen Gen bis zu einem ganzen Genom reicht. Der Aufbau einer Domainone-Bibliothek ist sehr nützlich für Funktionsstudien.

Es kann in einen Phagenanzeigekontext übertragen und für die Auswahl gegen verschiedene Targets wie Bindungsproteine oder gereinigte Antikörper verwendet werden. Die Kopplung mit NGS ermöglicht eine äußerst sensible und leistungsstarke Analyse. Gleichzeitig geben die speziell entwickelten Web-Tools eine präzise Charakterisierung der gesamten Domainome und Interactome.

Um die ORF-Bibliothek zuerst zu konstruieren, beschallen Sie die DNA mit 30 Sekunden Impulsen bei 100%Output. Laden Sie nach der Beschallung die Leiter und die beschallte DNA auf ein 1,5%agarose Gel. Dann starten Sie die Elektrophoreseeinheit bei fünf Volt pro Zentimeter für 15 Minuten.

Die Agarose-Gel-Elektrophorese zeigt das Vorhandensein von DNA-Abstrichen, die die Beschallung bestätigen. Dies ist im Vergleich zu dem festen Band, das aus einer DNA gewonnen wird, die keiner Beschallung unterzogen wird. Schneiden Sie dann den Gelanteil mit dem fragmentierten DNA-Abstrich und reinigen Sie ihn mit dem säulenbasierten Gelextraktionskit.

Messen Sie die Konzentration der gereinigten DNA im UV-Spektralphotometer. Dann folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und behandeln Sie fünf Mikrogramm des Einsatzes mit einem Mikroliter schnell stumpfen Enzymmischung. Dann inaktivieren Sie die Enzymmischung bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten.

Um den Filtervektor vorzubereiten, verdauen Sie zunächst fünf Mikrogramm des gereinigten Klonvektors mit dem EcoRV-Restriktionsenzym. Dann laden Sie die verdauten und unverdaute Vektoren und den molekularen Marker auf ein 1%Agarose-Gel. Dann inaktivieren Sie das Restriktionsenzym bei 80 Grad Celsius für 20 Minuten.

Als nächstes phosphoryliert der verdaute Vektor mit fünf Einheiten Phosphatase-Enzym und einem Volumen von 1/10 des 10-fachen Phosphatase-Puffers. Dann inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Dann inaktivieren Sie das Phosphatase-Enzym bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten.

Als nächstes extrahieren Sie das Plasmid aus dem Gel und reinigen Sie die DNA. Messen Sie dann die Konzentration der DNA im UV-Spektralphotometer. Um die Ligationsreaktion durchzuführen, fügen Sie 400 Nanogramm der phosphorylierten Inserts zu einem Mikrogramm verdauten Vektors, 10X T4 DNA-Ligasepuffer und T4-DNA-Ligase zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern hinzu.

Dann inkubieren Sie die Ligationsreaktion bei 16 Grad Celsius für die Nacht. Am nächsten Tag, Hitze inaktivieren die Ligase bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Als nächstes fügen Sie 1/10 Volumen von drei Mol-Natriumacetat bei pH 5.2 und 2,5 Volumen von 100%Ethanol, um das Ligationsprodukt zu fällen.

Um die DNA zu fällen, mischen Sie die Reagenzien und frieren sie bei minus 80 Grad Celsius für 20 Minuten ein. Nach 20 Minuten Zentrifuge bei höchster Geschwindigkeit für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand vertreiben.

Zum Pellet 500 Mikroliter kaltes 70%Ethanol und wieder Zentrifuge hinzufügen. Entsorgen Sie den Überstand am Ende der Zentrifugation. Sobald das Pellet luftgetrocknet ist, lösen Sie die gefällte DNA in 10 Mikroliter Wasser auf.

Vor der Durchführung der Elektroporation die entsprechende Anzahl von Mikrozentrifugenröhren und 0,1 Zentimeter Elektroporationsküvetten auf Eis anordnen. Dann einen Mikroliter des gereinigten Ligationsprodukts zu 25 Mikrolitern der Zellen hinzufügen. Dann Pipette die DNA, Zellmischung auf die kalte Elektroporation Küvette und flickt die Röhre.

Wischen Sie dann das Wasser von der Außenseite der Küvette ab und legen Sie es in die Elektroporationseinheit und treffen Sie den Puls. Nachdem die Elektroporation vorbei ist, fügen Sie schnell einen Milliliter flüssiges 2X YT Medium ohne Antibiotikum in die Zellen in der Küvette. Dann übertragen Sie die Zellmischung in eine 10 Milliliter Tube.

Lassen Sie die Röhre auf einem Shaker bei 220 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Die Verdünnungen der Bibliothek auf 10 Zentimeter n2X YT Agarplatten mit Chloramphenicol, Ampicillin und nur Chloramphenicol ergänzt. Dies ist, um einzelne Kolonien zu erhalten, die durch PCR getestet werden und Titration durchführen.

Als nächstes die transformierten kompetenten Zellen auf 15 Zentimeter 2X YT Agarplatten mit Chloramphenicol und Ampicillin ergänzt. Dann die Platten bei 30 Grad Celsius für die Nacht inkubieren. Am nächsten Tag zählen die Kolonien, die die Verdünnung wählen, wo sie zählbar sind.

Berechnen Sie dann die Bibliotheksgröße. Die Bibliotheksgröße wird wie folgt berechnet, die mittlere Koloniezahl mal Verdünnungsfaktor mal das gesamte Bibliotheksvolumen. Die Bibliotheksgröße sollte in der Größenordnung von 10 bis zur Leistung von sechs Klonen sein.

Wenn die Ampicillinkonzentration optimal ist, um mehr Filterung durchzuführen, verringert sich die Klonzahl auf ein bis 20 der, die ohne dieses Antibiotikum erhalten wird. Um die positiven Kolonien zu testen, verwenden Sie einen Tipp, um etwa 15 bis 20 einzelne Kolonien aufzunehmen. Dann verdünnen Sie die Kolonien mit 100 Mikroliter 2X YT Medium ohne Antibiotika.

Als nächstes verstärkt PCR 0,5 Mikroliter der Kultur als DNA-Vorlage mit Taq-DNA-Polymerase. Während der PCR laufen 25 Zyklen von Verstärkungen mit Glühtemperatur von 55 Grad Celsius und einer Verlängerungszeit von 40 Sekunden bei 72 Grad Celsius. Stellen Sie fest, dass die Länge des Einsatzes im erwarteten Bereich von 150 bis 750 Basispaar liegt.

Und dass verschiedene Kolonien verschiedene Einsätze mit unterschiedlicher Größe präsentieren. Dies deutet auf eine gute Bibliotheksvorbereitung in Bezug auf die Variabilität hin. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter frisches 2X YT Medium auf die 150-Millimeter-Platten, um die Bakterien zu sammeln.

Dann ernten Sie die Bakterien mit einem sterilen Schaber. Nach dem Mischen gründlich, fügen Sie 20% Glycerin und lassen Sie in minus 80 Grad Celsius in Aliquots für die zukünftige Verwendung. Für die sofortige Anwendung, führen Sie spaltenbasierte Plasmid Extraktion Kit, um die Plasmid-DNA aus einem der Aliquots der Bibliothek zu reinigen, bevor Sie Glycerin hinzufügen.

Messen Sie die Konzentration der DNA im UV-Spektralphotometer und speichern Sie die Proben dann bei minus 20 Grad Celsius bis zur Verwendung. Verwenden Sie 2,5 Mikroliter der Bibliothek als DNA-Vorlage für die PCR-Verstärkung. Stellen Sie die Thermocycler-Bedingungen ein und starten Sie den Lauf.

Verwenden Sie als Nächstes ein Index-PCR-Kit, um Index-PCR auszuführen. Dadurch werden die doppelten indizierten Bibliotheken innerhalb multiplexierter Illumina-Läufe sequenziert. Stellen Sie dann die Thermocycler-Bedingungen ein und starten Sie den Lauf.

Nach der Reinigung mit AMPure XP Perlen, um die Größe zu überprüfen, führen Sie einen Mikroliter der ein bis 10 Verdünnung der endgültigen Bibliothek auf dem Bioanalyzer. Anschließend quantifizieren Sie, indem Sie den Bereich der endgültigen Bibliotheksablaufverfolgung auswählen. Diese schematischen Darstellungen zeigen, dass nach dem Klonen in P-Filtervektor nur Kolonien, die ORFs entsprechen, funktionelle Beta-Lactamase in Gegenwart von Antibiotika produzieren.

Nach dem Filtern wird eine Abnahme der Klonzahl um das 20-fache erwartet. Mit Good-Folder-ORFs, die in höheren Antibiotikakonzentrationen wachsen. Darüber hinaus können die ORF-Fragmente einfach aus der gefilterten Bibliothek wiederhergestellt werden.

Eine Phagenmid-ORF-Bibliothek ist so konstruiert, dass eine Phagenanzeige-Auswahl gegen Zielproteine oder Antikörper durchgeführt wird. Alle Bibliotheken und die erhaltenen Ergebnisse werden dann vom NGS eingehend analysiert. Das NGS bietet eine vollständige Information über Bibliotheksvielfalt, Fülle und präzise Kartierung jedes der ausgewählten Fragmente.

Schließlich erzeugt das interactome seek webtool developed rohe Sequenzierungslesevorgänge, die bis zur Liste der vermeintlichen Domänen mit genomischen Anmerkungen reichen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Domainome-Bibliothek aus einer gewünschten DNA-Quelle erstellen und validieren. Und um eine Überprüfung der Bibliothek mit hohem Durchsatz durch Sequenzierung der nächsten Generation durchzuführen.

Wir haben die Sequenzierung der ORF-Filterbibliotheken mit den Illumina-Plattformen optimiert und ein Webtool entwickelt, das die Analyse dieser Art von Daten ohne Programmierkenntnisse ermöglicht.