Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, erfolgreich eine Mikroinjektion in Nasonia vitripennis-Embryonen durchzuführen, um die genomische Manipulation zu erleichtern. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Zusammenhang mit der Biologie von Nasonia vitripennis zu beantworten, z. B. bei der Giftproduktion und der Geschlechtsbestimmung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Manipulation in das Wespengenom ermöglicht und eine Vielzahl fortschrittlicher genomischer Modifikationen bietet.

Das Verfahren wird von Ming Li, einem Postdoc aus unserem Labor, demonstriert. Zu Beginn richten Sie mehrere N.vitripennis-Kolonien ein, indem Sie 200 bis 500 erwachsene Tiere mit einem Verhältnis von drei zu eins von Weibchen zu Männchen in Käferheimkäfige setzen. Halten Sie die Wespen bei 25 plus oder minus einem Grad Celsius mit 30 % relativer Luftfeuchtigkeit und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 bis 12 Grad.

Lassen Sie die verpaarten Weibchen zwei Tage lang frische S.bullata-Puppen sowie kleine Tröpfchen einer Saccharose-Wasserlösung von ein bis zehn Volumen bis Volumen fressen. In den folgenden zwei Tagen entfernen Sie die Schmeißfliegenpuppen, um den weiblichen Wespen einen Eiablageplatz zu entziehen und sie sehr trächtig zu machen. Um die Wirte der S.bullota Puppen frisch zu halten, lagern Sie sie sofort nach dem Erhalt bei 4 Grad Celsius und entfernen Sie sie nur bei Bedarf.

Unterscheiden Sie zwischen jungen Wirten, die ein rotes Puppenbild haben, und älteren Wirten, die ein dunkleres Puppentier haben. Lassen Sie weibliche Wespen in den jungen Wirt parasitieren, indem Sie einzelne frische S.bullata-Puppen in einen Schaumstoffstopfen legen, in dessen Mitte ein puppengroßes Loch geschnitten ist. Für eine maximale Konzentration der Parasitierung und eine einfachere Embryonenentnahme legen Sie nur etwa 0,2 Zentimeter des vorderen Endes des Wirts frei, das abgerundet ist, im Vergleich zum hinteren Ende, das dicker ist und eine kraterartige Öffnung enthält.

Setzen Sie die Wirtspuppen in dieser Anordnung in den Käfig und warten Sie etwa 45 Minuten, bis die Wespen sie parasitieren können. Entfernen Sie parasitierte Wirte, indem Sie sie mit der Hand zurückholen und vorsichtig auf die Wespenreste klopfen oder abblasen. Ersetzen Sie sie etwa alle 15 Minuten durch frische Wirte, um während der Injektionen weiterhin Eizellen im Frühstadium zu sammeln.

Unter einem Präpariermikroskop wird mit einer Pinzette vorsichtig das hintere Ende des äußeren Blattes eines frisch parasitierten Wirts abgezogen, um die N.vitripennis-Eier freizulegen. Bereiten Sie dann einen Objektträger für die Embryoausrichtung vor, indem Sie mit flüssigem Klebstoff ein Deckglas auf einen sauberen Objektträger kleben. Bürsten Sie mit einem feuchten Pinsel mit feiner Spitze vorsichtig die Embryonen vom Wirt ab und achten Sie darauf, die weiche, puppenhafte Haut des Wirts nicht zu beschädigen.

Übertragen Sie dann mit dem nassen Pinsel etwa 20 Embryonen nacheinander auf den Objektträger, der unmittelbar an der Seite des Deckglases liegt. Richten Sie das vordere Ende des Embryos gegen die Kante des Deckschiebers aus, so dass die hinteren Enden des Embryos in die gleiche Richtung zeigen. Dies ermöglicht eine höhere Präzision bei der Injektion in die gleiche Position bei allen Embryonen.

Nachdem Sie die Injektionsnadeln gemäß dem Textprotokoll gezogen haben, fasen Sie die Nadelspitze ab, indem Sie die Spitze etwa 10 Sekunden lang leicht mit einer Diamantschleifplatte bei 25 Grad Celsius berühren. Bereiten Sie die Injektionsmischung vor, die aus Reagenzien zur Genommodifikation besteht, und legen Sie sie auf Eis. Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um die Injektionsnadel mit zwei Mikrolitern Injektionsmischung zu befüllen.

Legen Sie dann den Objektträger mit den ausgekleideten Embryonen auf den Tisch eines Verbundmikroskops. Führen Sie die Nadel vorsichtig in einem vertikalen Winkel von 25 bis 35 Grad in das hintere Ende des Embryos ein. Injizieren Sie dann ein bis fünf Pikoliter Injektionsmischung und achten Sie darauf, dass der Embyro mit der Injektion leicht aufquillt.

Wenn Verstopfungen auftreten, versuchen Sie, die Nadeln wieder abzuschrägen. Das Zytoplasma von N.vitripennis-Embryonen ist ungewöhnlich viskos und klebrig, was zu häufigen Verstopfungen der Nadeln führt. Injizieren Sie etwa 20 bis 40 Eier auf einmal und hören Sie dann auf.

Übertragen Sie die injizierten Eier mit einem feuchten Pinsel, indem Sie die injizierten Eier leicht berühren, und legen Sie sie in einen Wirt. Setzen Sie dann die Injektion mit einer frischen, neu gelegten Charge Eier fort. Im Idealfall ist dieser Schritt am effektivsten, wenn eine Person Eizellen sammelt und aneinanderreiht, während eine andere Person Komponenten zur Genommodifikation injiziert und injizierte Embryonen in Wirtspuppen transplantiert.

Nach der Mikroinjektion verwenden Sie einen feuchten Pinsel, um bis zu 40 injizierte G zero-Embryonen nacheinander vorsichtig auf eine zuvor gestochene S.bullata-Puppe zu legen. Legen Sie die Wirtspuppen in eine Petrischale mit feuchtem Filterpapier und Wattebällchen und inkubieren Sie sie bei 25 Grad Celsius und etwa 70 % Luftfeuchtigkeit, bis die injizierten Embryonen in etwa ein bis zwei Tagen schlüpfen. Wichtig ist, dass die Wirte mit einem geschälten Puparium belassen werden können und sich die N.vitripennis-Eier normal entwickeln, solange sie in einer befeuchteten Kammer inkubiert werden, um ein Austrocknen zu verhindern.

Nachdem die G zero-Embryonen geschlüpft sind, werden die Puppen des Wirts in eine neue Petrischale umgefüllt und bei 25 Grad Celsius und 70 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Überwachen Sie die Wirtspuppen und injizierten G null Larven täglich. Wenn die Wirtspuppen einen üblen Geruch haben, übertragen Sie die injizierten Larven auf neue, gesunde Wirtspuppen.

Für eine effektive Nadelpenetration und Mikroinjektion in N.vitripennis-Embryonen wurden verschiedene Mikropipettenzieher mit verschiedenen Arten von Kapillarglasnadeln mit Filamenten, einschließlich Quarz, Aluminiumsilikat und Borosilikat, getestet, um eine gewünschte hypodermiähnliche lange Spitze zu haben, die für die Mikroinjektion von N.vitripennis-Embryonen wirksam ist. Die hier verwendeten Komponenten zur Genommodifikation waren gemischte Guide-RNAs und Cas9-Proteine für eine knackigere Genom-Editierung. In diesem Experiment wurde eine sgRNA, die auf das Zinnober-Gen abzielt, zusammen mit dem cas9-Protein in unterschiedlichen Mengen in N. vitripennis injiziert.

Diese Tabelle zeigt, dass die Überlebensraten dosisabhängig waren, da eine erhöhte Konzentration von sgRNA und cas9-Protein zu verringerten Überlebensraten führte. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Wespenembryonen während der Manipulation oder des Transfers nicht durchstochen oder ausgetrocknet werden, indem Sie vorsichtig einen angefeuchteten Pinsel oder Embryopickel verwenden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Wespenembryonen effizient gewinnen, mikroinjizieren und transplantieren können, um fortschrittliche Genommodifikationen erfolgreich durchzuführen.