Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine multifunktionale Epithel des Auges. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären Zellkulturen, abgeleitet von der murinen RPE zu etablieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen praktikablen Weg zu demonstrieren, um retinale Pigmentepithelzellen aus Mausaugen zu gewinnen und sie in vitro unter Beibehaltung ihrer ursprünglichen Eigenschaften zu kultivieren. Diese Methode wird RPE-Forschern helfen, Präparierfähigkeiten zu erwerben, die für die Etablierung von Maus-RPE-Zellkulturen erforderlich sind, und zu demonstrieren, wie dies auf einfache Weise geschehen kann. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es einfach und durchführbar ist.

Das Einzige, was erforderlich ist, ist Übung, und die visuelle Demonstration der RPE-Isolierung und der Mikroskopie demonstriert buchstäblich, wie man die erforderlichen Fähigkeiten erlangt. Um die Augäpfel der Maus zu isolieren, euthanasieren Sie zuerst zwei Mäuse mit einer zugelassenen Methode und legen Sie sie mit Handschuhen auf ein saugfähiges Pad. Positionieren Sie Daumen und Zeigefinger um das Auge und drücken Sie sanft auf die Haut, um den Augapfel auszubeulen.

Sobald der Augapfel hervorsteht, stecken Sie die Spitze einer abgewinkelten Schere zwischen die Haut und den Augapfel und schneiden Sie vorsichtig das Gewebe um das Auge herum, bis es sich löst. Tauchen Sie dann das isolierte Auge kurz in das 70%ige Ethanol und tauchen Sie es in PBS in eine Petrischale. Nachdem Sie beide Augen von jeder der Mäuse gesammelt haben, fahren Sie mit der Dissektion fort.

Entfernen Sie unter dem Präpariermikroskop vorsichtig den größten Teil des Bindegewebes um das Auge herum. Es ist nicht notwendig, das Auge während dieses Schritts unter Wasser zu halten. Heben Sie dazu das Bindegewebe mit einer Nahzange vom Augapfel ab und schneiden Sie es mit einer Vannas-Schere heraus.

Schneiden Sie die Sklera nicht, da es praktisch unmöglich ist, die intakten hinteren Augenmuscheln zu erhalten, wenn die Sklera durchtrennt wird. Tauchen Sie nach der Reinigung des Bindegewebes die Augäpfel in PBS und wechseln Sie zum Arbeiten in einem Laminar-Flow-Schrank unter sterilen Bedingungen. Übertragen Sie nun die Augen mit einer Pinzette in eine Schale mit warmem DMEM, die eine hohe Konzentration an Glukose enthält.

Ersetzen Sie die Waschlösung nach 20 bis 30 Sekunden durch Aspiration für eine zweite Wäsche. Übertragen Sie die Augäpfel in eine erwärmte 2%ige Dispase II-Arbeitslösung in 15-ml-Röhrchen und lassen Sie die Augen 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, um zu dissoziieren. Nach der Inkubation sollten die Augäpfel weich sein.

Waschen Sie anschließend die Augen zweimal im selben Gefäß mit erwärmtem Wachstumsmedium. Ersetzen Sie nach der zweiten Wäsche das Wachstumsmedium durch frisches Medium und geben Sie die Augäpfel und das Medium in eine neue Schale, um die Dissektion fortzusetzen. Arbeiten Sie in einer sauberen Bank mit Hilfe eines Dissektionsmikroskops weiter.

Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie das Auge mit einer Pinzette fixieren und mit einer Vannas-Schere einen Schnitt um die Ora serrata machen. Halten Sie den Augapfel in der Lösung und entfernen Sie vorsichtig die vordere Hornhaut, indem Sie den Schnitt um den Umfang der Ora serrata verlängern. Ziehen Sie nach Abschluss des Schnitts die vordere Hornhaut ab.

Entfernen Sie anschließend die Linsenkapsel und das zugehörige pigmentierte Irisepithel, indem Sie es vorsichtig mit einer Zahnzange aus der Augenmuschel ziehen. Wiederholen Sie dann die Dissektion an den verbleibenden Augen und inkubieren Sie die hinteren Augenmuscheln 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in Wachstumsmedium, um die Trennung der neuralen Netzhaut vom RPE zu erleichtern. Schneiden Sie nach 20 Minuten die hinteren Augenmuscheln in vier Blütenblätter.

Machen Sie die Schnitte lang genug, um die Augenmuschel abzuflachen, aber kurz genug, um die Blütenblätter verbunden zu halten. Als nächstes glätten Sie die Augenmuschel, um die neuronale Netzhaut zu entfernen. Befestigen Sie den verbleibenden RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex mit der nicht-dominanten Hand und ziehen Sie die Netzhaut ganz sanft von den Rändern weg.

Sobald die neuronale Netzhaut entfernt ist, übertragen Sie den geviertelten RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex in eine neue sterile Kulturschale, die mit warmem Wachstumsmedium gefüllt ist. Befestigen Sie in der Petrischale ein Blütenblatt des geviertelten RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexes mit einer superfeinen Pinzette und ziehen Sie mit einem mikrochirurgischen Halbmondmesser vorsichtig die intakten RPE-Blätter von der darunter liegenden Basalmembran ab. Das bräunliche RPE sollte deutlich von der dunklen, klebrigen, flauschigen Aderhaut zu unterscheiden sein.

Befeuchten Sie dann eine p200-Mikropipettenspitze mit Wachstumsmedium und übertragen Sie die RPE-Blätter mit der Spitze in die neue Schale mit erwärmtem Wachstumsmedium. Waschen Sie nun die RPE-Blätter dreimal in erwärmtem Wachstumsmedium. Sammeln Sie die RPE-Blätter nach jedem Waschschritt vorsichtig und vermeiden Sie dabei anderes Gewebe wie Ablagerungen von der Netzhaut oder der Aderhaut.

Übertragen Sie die RPE-Blätter nach dem letzten Waschen in ein 1,5-ml-Röhrchen und lassen Sie sie durch die Schwerkraft sedimentieren. Entfernen Sie dann im Laminar-Flow-Schrank das überschüssige Wachstumsmedium und suspendieren Sie die Zellen wieder in frisch hergestelltem warmem Wachstumsmedium. Zerreiben Sie nun das Gewebe vorsichtig mit einer p200-Mikropipette, ohne Blasen zu bilden.

Trituieren Sie zwischen 40 und 50 Mal, gerade genug, um eine einzellige Suspension herzustellen. Seien Sie vorsichtig, da zu viel Verreibung tödlich sein kann. Plattieren Sie nun die von beiden Mäusen gesammelten RPE-Zellen in einem 12-ml-Polyestermembraneinsatz in der Vertiefung einer 12-Well-Kulturplatte.

Eine hohe Zelldichte ist erwünscht, damit die RPE-Zellen ihre hexagonale Form und Pigmentierung behalten. Eine primäre RPE-Kultur der Maus, die von zwei Mäusen in einem 12-mm-Polyestermembraneinsatz etabliert wurde, erreichte nach einer Woche in Kultur eine Konfluenz von 90 bis 95 %. Nach zwei Wochen in Kultur waren die Zellen zu 100 % konfluent und begannen, ein Mosaik aus hexagonalen pigmentierten und zweikernigen Zellen zu bilden.

In der dritten Woche veränderten sich die Zellen weiter in Form und Pigmentierung. Nach vier Wochen wurde jedoch ein Teil der Zellen hyperpigmentiert. Die Reinheit der primären RPE-Zellkultur wurde mit dem RPE65-Antikörper bewertet, der die Retinoid-Isomerohydrolase markiert, ein Enzym, das für den visuellen Zyklus von Wirbeltieren entscheidend ist.

Die Integrität der Zell-zu-Zell-Verbindungen und der hexagonalen Zellform wurde durch Färbung mit Phalloidin nachgewiesen. Tight Junctions wurden durch Analyse der ZO-1-Proteinexpression visualisiert, die mit Hilfe einer Aminofärbung sichtbar gemacht und durch Western Blotting validiert werden konnten. Insgesamt sind die Kulturen in der Lage, sich zu vermehren, die Pigmentierung und ihre hexagonale Form beizubehalten, während sie Tight Junctions bilden und funktionelle Marker wie RPE65 exprimieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RPE-Zellen aus den Augen der Maus isoliert und sie in vitro richtig kultiviert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Augen immer feucht zu halten und zu versuchen, so schnell wie möglich zu arbeiten.