Name: Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus Mäuseaugen. Diese einfache Methode ermöglicht die Erhaltung der ursprünglichen Zelleigenschaften für die Netzhautforschung.

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Diese Studie wurde teilweise durch die BrightFocus Foundation (für DS) finanziert.

Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an Universität von Pittsburgh genehmigt
1. bereiten Sie Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie Wachstumsmedium von ergänzenden Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM), hoher Blutzucker mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin, 2,5 mM L-Glutamin und 1 X MEM nichtessentiellen Aminosäuren. Vorwärmen der Medien in 37 ° C Inkubator vor Gebrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 % (wt/Vol) Dispase II funktionierende Lösung:<ol>
<li>Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 mg/mL Dispase II durch Auflösen von 30 mg von Dispase II in 300 µL HEPES gepufferten Kochsalzlösung (50 mM HEPES/KOH pH 7.4, 150 mM NaCl). Dieser Band ist für 3 bis 4 Mäuse, skaliert oder unten basierend auf der Anzahl von Mäusen für das Experiment werden kann). Dieser Bestand kann für mindestens 1 Woche bei 4 ° c gelagert werden</li>
		<li>Bereiten Sie die Arbeitslösung des 2 % Dispase durch Zugabe von 300 µL von 100 mg/mL Dispase II bestand bis 1,2 mL sterile DMEM, hoher Blutzucker und die Lösung durch einen 0,22 µm-Filter filtern. Dieser Schritt sollte in die laminare Strömung Kabinett unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Vorwärmen der vorbereiteten Dispase II in 37 ° C Inkubator vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. erhalten die Maus-Augen
<ol><li>Einschläfern Sie die Maus mit einer anerkannten Methode und legen Sie es auf einer saugfähigen Unterlage.</li>
	<li>Tragen von Handschuhen, legen Sie Daumen und Zeigefinger um das Auge herum und schieben Sie die Haut, Proptose des Augapfels.</li>
	<li>Legen Sie die Spitze des abgewinkelten Schere zwischen der Haut und den Augapfel und schneiden Sie vorsichtig aus dem Auge. Um Kontaminationen zu vermeiden, kurz Tauchen Sie das Auge in 70 % igem Ethanol.</li>
	<li>Sofort setzen Sie das Auge in der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Petrischale.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.4, das zweite Auge zu entfernen.</li>
</ol>3. Auge Dissektion
<ol><li>Entfernen Sie vorsichtig Bindegewebe aus dem Auge unter dem sezierenden Mikroskop. Dies kann entweder mit PBS-Puffer oder auf dem trockenen Petrischale erfolgen.<ol>
<li>Verwenden Sie näht Zange zu heben das Bindegewebe aus dem Augapfel und schneiden sie Sie mit einer Schere Vannas. Geschnitten Sie die Lederhaut nicht, weil es praktisch unmöglich, die intakten hinteren Augenmuscheln zu erhalten, wenn der Sklera geschnitten wird.</li>
		<li>Nach der Reinigung des Bindegewebes, halten die resultierende Augäpfel mit PBS-Puffer für den nächsten Schritt waschen. Hinweis: Die folgenden Schritte sollten in die laminare Strömung Kabinett unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Augen zweimal in vorgewärmten 37 ° C DMEM (hoher Blutzucker). Die Augäpfel in die vorgewärmte 37 ° C DMEM (hohe Glukose) mit Pinzette sorgfältig zu übertragen. Aspirieren Sie das Medium und Transfer Augäpfel, frisches Medium in ein neues Gericht.</li>
	<li>Aspirieren Sie DMEM (hohe Glukose) Medium und inkubieren Sie die Augen in die vorgewärmte 2 % (wt/Vol) Dispase II funktionierende Lösung für 45 min im Inkubator 37 ° C. Hinweis: In den folgenden Schritten legen und Augen oder Augenmuscheln in das Wachstumsmedium, die schützt des Gewebes und bieten ein gutes Medium für die Dissektion zu manipulieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Dispase II Lösung und waschen Sie die Augen zweimal in Wachstumsmedium, indem das alte Medium Absaugen und das neue vorgewärmte 37 ° C Wachstumsmedium (Abbildung 1a). Hinweis: Nach der Dissoziation von Dispase II, die Augäpfel weich werden.</li>
	<li>Halten Sie das Auge mit Zange und einen Einschnitt in die Ora Serrata jedes Auges mit Vannas Schere unter dem sezierenden Mikroskop in die laminare Strömung Schrank gelegt.<ol>
<li>Halten den Augapfel in der Lösung, vorsichtig entfernen der vorderen Hornhaut durch den Schnitt um die Ora Serrata Umfang erweitert und die vordere Hornhaut wegziehen, nachdem der Schnitt abgeschlossen wurde.</li>
		<li>Entfernen Sie die Linsenkapsel und damit verbundenen Iris pigmentiert Epithel durch leichtes Ziehen sie aus der Augenmuschel mit umgezahnten Zangen (Abbildung 1 b, 1 c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die daraus resultierenden posterioren Augenmuscheln in das Wachstumsmedium für 20 min bei 37 ° C, Trennung der neuronale Netzhaut von RPE zu erleichtern.</li>
	<li>Schneiden Sie die hinteren Augenmuscheln in 4 Blütenblätter unter dem sezierenden Mikroskop platziert in die laminare Strömung Kabinett. Die Kürzungen sollten lang genug zu glätten die Augenmuschel, aber kurz genug, um die Blütenblätter verbunden (Abbildung 1-d) zu halten sein.<ol>
<li>Die Augenmuschel glätten und entfernen die neuronale Netzhaut sehr vorsichtig mit der Pinzette herausziehen halten die restlichen RPE-Aderhaut-Lederhaut-Komplex mit einem anderen Zangen (Abbildung 1e). Starten Sie ziehen an den Kanten und nicht von der Mitte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die geviertelten Gewebe in eine neue sterile Kulturschale mit vorgewärmten 37 ° C Wachstumsmedium gefüllt.</li>
</ol>4. Isolierung der primären RPE-Zellen
<ol><li>Holding ein Blütenblatt der geviertelten RPE-Aderhaut-Sklera Anlage mit super feine Pinzette, vorsichtig abziehen die intakte Blätter des RPE aus der zugrunde liegenden Basalmembran (Bruch Membran) mit einem mikrochirurgischen sichelförmigen Messer unter dem sezierenden Mikroskop in der Laminar-Flow Kabinett (Abb. 1f) gelegt.<ol>
<li>Übertragen Sie die RPE-Blätter in der neuen sterilen Kulturschale mit Wachstumsmedium mithilfe einer Mikropipette P200. Bei der Übertragung von RPE Blätter nass Pipettenspitzen mit Wachstumsmedium durch Pipettieren mehrmals zu verhindern, dass Gewebe innerhalb der Spitze festhalten. RPE werden deutlich unterscheidbar von der Aderhaut: RPE sieht mehr bräunlich, während Aderhaut dunkler ist und klebrig und flauschig sieht.</li>
		<li>Alternativ verwenden Sie, enzymatischen Verdauung und sanfte Dissoziation ohne Zange um die RPE aus der Aderhaut14lösen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die RPE Blätter 2-3 Mal mit vorgewärmten 37 ° C zu waschen Wachstumsmedium in der sterilen Kulturschale. Nach jedem Waschen sammeln Sie sorgfältig die RPE-Blätter unter Vermeidung andere Gewebe wie Schutt der Netzhaut oder Aderhaut. Am Ende der letzten Wäsche sammeln Sie die RPE-Blätter mit einer Mikropipette P200 und legen Sie sie in einen neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit, die RPE Blätter Zentrifuge: sie werden Sediment durch die Schwerkraft innerhalb von 1 min.</li>
	<li>Entfernen Sie das zusätzliche Wachstum-Medium mit einer Mikropipette P200. Zellen im frischen vorgewärmten Wachstumsmedium Aufschwemmen und sanft genannte mit einer Mikropipette P200. Vermeidung von Blasenbildung. Eine einzelne Zelle Suspension ist ideal, aber auch vermeiden, zuviel Verreibung, ansonsten RPE-Zellen sind nicht in der Lage zu überleben. Wir empfehlen sehr sanft Verreibung für 40 - 50 Mal.</li>
</ol>5. Kultivierung RPE-Zellen
<ol><li>Die Zellen in einer Kultur-Platte-Platte.<ol>
<li>Downstream-Anwendungen der RPE Zellen benötigen Beibehaltung ihrer Polarität, Zellen Platte RPE von 2 Mäuse in einem 12 mm Polyester Membran einfügen vorinstalliert in Kultur 12-Well-Platten. Die Zellen in hoher Dichte Beschichtung ist erwünscht, denn in diesem Fall RPE-Zellen in der Lage, die ursprünglichen Eigenschaften, wie z. B. sechseckige Form und Pigmentierung zu halten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nicht verschieben Sie die Platte zu oder ändern Sie das Wachstumsmedium für die ersten 72 h der Kultivierung. Ersetzen Sie nach 3 Tagen das alte Medium durch das frisch vorgewärmte Wachstumsmedium. Danach ändern Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag. Sobald RPE-Zellen confluency erhalten, reduzieren Sie die FBS im Wachstumsmedium um 2 %. Hinweis: Die Zellen können mit 0,25 % Trypsin gespalten werden. Jedoch nach der Trennung können die Zellen verlieren ihre sechseckige Form und Pigmentierung in den folgenden Passagen. Wir empfehlen nicht, die Zellen teilen, aber wenn es, durch die downstream-Anwendungen der Kultur erforderlich ist, beachte bitte, dass auf unbestimmte Zeit die primäre Zellen passagiert werden kann nicht: sie sind dafür bekannt, de-nach ca. 5-7 Passagen zu unterscheiden.</li>
</ol>

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</ol>

DS hat Forschungsförderung von F. Hoffmann-La Roche, Bayer HealthCare, Deutschland und der Schweiz erhalten. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Diese Arbeit stützt sich auf Forschung, um zu verhindern, dass Blindheit (uneingeschränkte Zuschüsse an die Wilmer Eye Institute und der University of Pittsburgh).  Diese Arbeit wird auch von Startkapital für DS von Augenheilkunde, University of Pittsburgh unterstützt.

Die vorgestellte ausführliche Protokoll ermöglicht zuverlässige Einrichtung des Maus RPE Primärkulturen, die Konfluenz nach 1 Woche zu erreichen und die Hauptmerkmale der RPE wie sechseckige Form und Pigmentierung nach 2 Wochen. Die gewonnenen RPE-Zellen für eine Anzahl von downstream-Anwendungen wie z. B. Vitamin A Stoffwechsel9, Phagozytose der Photorezeptor Außensegmenten10 und Ionen-Transport11, Epithelzelle Polarität2, ly...

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine einlagige polarisierten epithelialen Zellen, die sich zwischen der neuronale Netzhaut und der Aderhaut des Auges befindet. Die Funktionalität der RPE-Zellen und die Integrität des RPE Monolayer sind entscheidend für Vision, weil die RPE spielt eine wichtige Rolle in mehreren Prozessen wie Erhaltung der äußeren Blut-Retina-Schranke, Transport von Wasser und Ionen zwischen der Netzhaut und die Aderhaut, Licht-Absorption, Schutz vor oxidativem Stress, Kontrolle der Retinoid Stoffwechsel und Phagozytose der äußeren Segmente der Photorezeptoren1,2. Die Lage des RPE auf der Rückseite des Auges, sowie seine Barrierefunktion aus vorbei aus dem Blut zu den Glaskörper systemisch verabreichten Medikamente zu verhindern erschweren es, die Komplexität des RPE Funktion in Vivozu untersuchen. So gibt es ein großes Bedürfnis für die Einrichtung von RPE Zellkulturen, die RPE-Zellen in einem flexiblen, kontrollierten Umgebung3,4zu studieren.
Es gibt eine Reihe von etablierten Zelllinien RPE, bietet eine einfache und bequeme Möglichkeit der Gewinnung und Lagerung der Zellen; passagiert Zellen haben jedoch einige Nachteile im Vergleich zu Primärzellen2,3,4. Erstens sind sie oft durch Veränderungen der Zellmorphologie gekennzeichnet. Keiner der existierenden Zelllinien fanden sich beispielsweise für eine zuverlässige Studie über die RPE-Barriere-Eigenschaften durch den Verlust der Zelle Polarität Phänotyp und teilweise verschwinden der tight Junctions4geeignet. Neben dem Verlust der Polarität und korrekte Zell-Zell-Verbindungen verlieren die RPE-Zell-Linien schnell ihre Pigmentierung aufgrund des Fehlens der wichtigsten Melanogenese Enzyme in den Erwachsenen RPE-5. Die Pigmentierung kann wiederhergestellt werden, aber die umfassende Analyse des Mechanismus der Re-Pigmentierung, also auch für eine Kombination von Transmissions-Elektronenmikroskopie, gen Ausdruck Analyse und chemische Tests bestätigen das Vorhandensein von Melanin hat nie Sie waren bereits im durchgeführten6. Eine weitere Einschränkung ist, dass die RPE-Zelllinien verlängerte Zelllebensdauer (manchmal - Unsterblichkeit) und unter bestimmten Bedingungen können selbst erneuernde multipotente Stammzellen, die aus dem Substrat und schwimmende Kolonien7, Form lösen verwandeln 8. diese Einschränkung macht es unmöglich, die Zelllinien für Transplantation3Experimente zu verwenden.
In Anbetracht der Nachteile der etablierten Zelllinien RPE vielleicht RPE Zellen Primärkulturen aus frischem Gewebe gewonnen mehr biologisch relevante RPE studieren Modellcharakter. Primäre RPE-Zellen werden nicht nur RPE-spezifische Funktionen zu studieren, wie z. B. Vitamin A-Stoffwechsel-9, Phagozytose der Photorezeptor Außensegmenten10 und Ionen-transport11, sondern auch grundlegende Zelle Biologie zu studieren, wie epithelialen Zelle Polarität2 , lysosomale Homöostase und Autophagie12,13.
In den letzten Jahren gab es eine Reihe von Publikationen über die Einrichtung von Primärkulturen RPE, zeigt ein wachsendes Interesse an diesem Bereich der Forschung3,14,15. Zahlreiche Protokolle für RPE-Zellen menschlichen und nichtmenschlichen RPE-Zellen wie Rinder und Schweine RPE-Zellen wurden veröffentlicht16,17,18,19. Es ist jedoch schwieriger zu handhaben Maus RPE-Zellen aufgrund ihrer viel kleineren Größe. Obwohl eine ganze Reihe von Publikationen Protokolle zu isolieren, RPE-Zellen von der Maus14,20,21beschrieben haben, gibt es noch viele Forscher, die kämpfen, um zu isolieren, RPE-Zellen ohne Kontamination der Aderhaut Zellen oder Zellen aus neuronale Netzhaut Schutt. Hier stellen wir das Protokoll für die Gründung der primäre Maustaste RPE Zellkultur, einschließlich des Erhalts der Augen von der Maus, Dissektion der Augen und der Isolation der RPE Blätter um die Zellen für die Kultivierung zu erzielen. Dieses video Protokoll wäre besonders nützlich für Forscher, die anfangen zu arbeiten mit Maus Primärkulturen RPE und brauchen Führung über die Präparation Techniken.

<table><tbody><tr><td>animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3 Wochen alte Wildtyp-Mäuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM),</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung nicht-essentielle Aminosäuren (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1X, pH 7,4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 Antikörper</td><td>Ein Geschenk von Dr. Michael Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Phalloidin&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L), Alexa Mehl 568&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Polyklonaler Antikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Anzahl<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Instrumente und Ausrüstungen</td>Laminar-Flow-Schrank <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop (Zoom-Stereomikroskop)</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500 CO2-Inkubator</td><td></td></tr><tr><td>mit Heißluftsterilisation</td><td>Binder</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Polyester-Membraneinsätze vorgeladen in 12-Well-Kulturplatten, Porengröße: 0,4 & Mikro; m, Sterile</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott Tenotomieschere, std-Klingen, scharfe</td><td>STEPHENS Instrumente</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Nahtzange 0,12 mm</td><td>Stroz Ophthalmic Instruments</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>Crescent gerades</td><td>Messer Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette #5, 11 cm, gerade, 0,1x0,06 mm Spitzen, Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schere, 8 cm, 45°; Winkel, Standard</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS Spritzenfiltereinheit, 0,22 & Mikro; m</td><td>Millipore</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Labormikroskop&nbsp; Leica DM IL LED</td><td>&nbsp; Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrier und ungefilterte Pipettenspitzen</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primären zellkulturen aus das retinale pigmentepithel maus

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine stark polarisierten multifunktionale Epithel, das liegt zwischen der neuronale Netzhaut und der Aderhaut des Auges. Es ist ein einzelnes Blatt der pigmentierten Zellen, die hexagonal verpackt und durch tight Junctions verbunden sind. Die Hauptfunktionen des RPE beinhalten Absorption von Licht, Phagozytose der Schuppen Photorezeptor äußeren Segmente, räumliche Pufferung von Ionen, Transport von Nährstoffen, Ionen und Wasser sowie aktive Beteiligung in der visuellen Zyklus. Mit solchen wichtigen und vielfältigen Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung für die Biologie des RPE-Zellen zu studieren. Eine Reihe von RPE Zelllinien gegründet wurden; Allerdings sind Zellen passagiert und verewigt, einige der morphologischen und physiologischen Eigenschaften der natürlichen RPE-Zellen verlieren schnell bekannt. Primärzellen eignen sich daher eher für das Studium der verschiedenen Aspekte der RPE-Zellen-Biologie und Funktion. Maus RPE Zellen Primärkultur ist sehr nützlich, um Forscher da Mausmodellen in biologische Studien weit verbreitet sind, jedoch sammeln RPE Zellen von Maus auch aufgrund ihrer geringen Größe sehr anspruchsvoll. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die primäre Maustaste RPE Zellkulturen Einrichtung umfasst Enukleation und Dissektion der Augen und der Isolation der RPE Blätter um die Zellen für die Kultivierung zu erzielen. Diese Methode ermöglicht effiziente Zelle. Die RPE Zellen aus zwei Mäuse erreichen Konfluenz auf einer 12 mm Polyester Membran einfügen vorinstalliert in Kultur Platte nach einer Woche der Kultur und der Anzeige einige der ursprünglichen Eigenschaften von bona-fide RPE Zellen wie sechseckige Form und Pigmentierung nach zwei Wochen der Kultur.

Die Maus RPE Primärkultur 12 mm Polyester Membran einfügen erreicht 90-95 % Konfluenz nach 1 Woche in der Kultur von 2 Mäusen gegründet. Nach 2 Wochen der Kultur die Zellen erreicht 100 % Konfluenz und fing an, ein Mosaik aus sechseckigen, pigmentierte und Bi-kernhaltige Zellen bilden. Nach 3 Wochen der Kultur, die Zellen weiterhin die Form und Pigmentierung, bilden aber kam nach 4 Wochen ein Teil der Zellen hyperpigmentiert (Abbildung 2).
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Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine multifunktionale Epithel des Auges. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären Zellkulturen, abgeleitet von der murinen RPE zu etablieren.

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen praktikablen Weg zu demonstrieren, um retinale Pigmentepithelzellen aus Mausaugen zu gewinnen und sie in vitro unter Beibehaltung ihrer ursprünglichen Eigenschaften zu kultivieren. Diese Methode wird RPE-Forschern helfen, Präparierfähigkeiten zu erwerben, die für die Etablierung von Maus-RPE-Zellkulturen erforderlich sind, und zu demonstrieren, wie dies auf einfache Weise geschehen kann. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es einfach und durchführbar ist.Das Einzige, was erforderlich ist, ist Übung, und die visuelle Demonstration der RPE-Isolierung und der Mikroskopie demonstriert buchstäblich, wie man die erforderlichen Fähigkeiten erlangt. Um die Augäpfel der Maus zu isolieren, euthanasieren Sie zuerst zwei Mäuse mit einer zugelassenen Methode und legen Sie sie mit Handschuhen auf ein saugfähiges Pad. Positionieren Sie Daumen und Zeigefinger um das Auge und drücken Sie sanft auf die Haut, um den Augapfel auszubeulen.Sobald der Augapfel hervorsteht, stecken Sie die Spitze einer abgewinkelten Schere zwischen die Haut und den Augapfel und schneiden Sie vorsichtig das Gewebe um das Auge herum, bis es sich löst. Tauchen Sie dann das isolierte Auge kurz in das 70%ige Ethanol und tauchen Sie es in PBS in eine Petrischale. Nachdem Sie beide Augen von jeder der Mäuse gesammelt haben, fahren Sie mit der Dissektion fort.Entfernen Sie unter dem Präpariermikroskop vorsichtig den größten Teil des Bindegewebes um das Auge herum. Es ist nicht notwendig, das Auge während dieses Schritts unter Wasser zu halten. Heben Sie dazu das Bindegewebe mit einer Nahzange vom Augapfel ab und schneiden Sie es mit einer Vannas-Schere heraus.Schneiden Sie die Sklera nicht, da es praktisch unmöglich ist, die intakten hinteren Augenmuscheln zu erhalten, wenn die Sklera durchtrennt wird. Tauchen Sie nach der Reinigung des Bindegewebes die Augäpfel in PBS und wechseln Sie zum Arbeiten in einem Laminar-Flow-Schrank unter sterilen Bedingungen. Übertragen Sie nun die Augen mit einer Pinzette in eine Schale mit warmem DMEM, die eine hohe Konzentration an Glukose enthält.Ersetzen Sie die Waschlösung nach 20 bis 30 Sekunden durch Aspiration für eine zweite Wäsche. Übertragen Sie die Augäpfel in eine erwärmte 2%ige Dispase II-Arbeitslösung in 15-ml-Röhrchen und lassen Sie die Augen 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, um zu dissoziieren. Nach der Inkubation sollten die Augäpfel weich sein.Waschen Sie anschließend die Augen zweimal im selben Gefäß mit erwärmtem Wachstumsmedium. Ersetzen Sie nach der zweiten Wäsche das Wachstumsmedium durch frisches Medium und geben Sie die Augäpfel und das Medium in eine neue Schale, um die Dissektion fortzusetzen. Arbeiten Sie in einer sauberen Bank mit Hilfe eines Dissektionsmikroskops weiter.Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie das Auge mit einer Pinzette fixieren und mit einer Vannas-Schere einen Schnitt um die Ora serrata machen. Halten Sie den Augapfel in der Lösung und entfernen Sie vorsichtig die vordere Hornhaut, indem Sie den Schnitt um den Umfang der Ora serrata verlängern. Ziehen Sie nach Abschluss des Schnitts die vordere Hornhaut ab.Entfernen Sie anschließend die Linsenkapsel und das zugehörige pigmentierte Irisepithel, indem Sie es vorsichtig mit einer Zahnzange aus der Augenmuschel ziehen. Wiederholen Sie dann die Dissektion an den verbleibenden Augen und inkubieren Sie die hinteren Augenmuscheln 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in Wachstumsmedium, um die Trennung der neuralen Netzhaut vom RPE zu erleichtern. Schneiden Sie nach 20 Minuten die hinteren Augenmuscheln in vier Blütenblätter.Machen Sie die Schnitte lang genug, um die Augenmuschel abzuflachen, aber kurz genug, um die Blütenblätter verbunden zu halten. Als nächstes glätten Sie die Augenmuschel, um die neuronale Netzhaut zu entfernen. Befestigen Sie den verbleibenden RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex mit der nicht-dominanten Hand und ziehen Sie die Netzhaut ganz sanft von den Rändern weg.Sobald die neuronale Netzhaut entfernt ist, übertragen Sie den geviertelten RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex in eine neue sterile Kulturschale, die mit warmem Wachstumsmedium gefüllt ist. Befestigen Sie in der Petrischale ein Blütenblatt des geviertelten RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexes mit einer superfeinen Pinzette und ziehen Sie mit einem mikrochirurgischen Halbmondmesser vorsichtig die intakten RPE-Blätter von der darunter liegenden Basalmembran ab. Das bräunliche RPE sollte deutlich von der dunklen, klebrigen, flauschigen Aderhaut zu unterscheiden sein.Befeuchten Sie dann eine p200-Mikropipettenspitze mit Wachstumsmedium und übertragen Sie die RPE-Blätter mit der Spitze in die neue Schale mit erwärmtem Wachstumsmedium. Waschen Sie nun die RPE-Blätter dreimal in erwärmtem Wachstumsmedium. Sammeln Sie die RPE-Blätter nach jedem Waschschritt vorsichtig und vermeiden Sie dabei anderes Gewebe wie Ablagerungen von der Netzhaut oder der Aderhaut.Übertragen Sie die RPE-Blätter nach dem letzten Waschen in ein 1,5-ml-Röhrchen und lassen Sie sie durch die Schwerkraft sedimentieren. Entfernen Sie dann im Laminar-Flow-Schrank das überschüssige Wachstumsmedium und suspendieren Sie die Zellen wieder in frisch hergestelltem warmem Wachstumsmedium. Zerreiben Sie nun das Gewebe vorsichtig mit einer p200-Mikropipette, ohne Blasen zu bilden.Trituieren Sie zwischen 40 und 50 Mal, gerade genug, um eine einzellige Suspension herzustellen. Seien Sie vorsichtig, da zu viel Verreibung tödlich sein kann. Plattieren Sie nun die von beiden Mäusen gesammelten RPE-Zellen in einem 12-ml-Polyestermembraneinsatz in der Vertiefung einer 12-Well-Kulturplatte.Eine hohe Zelldichte ist erwünscht, damit die RPE-Zellen ihre hexagonale Form und Pigmentierung behalten. Eine primäre RPE-Kultur der Maus, die von zwei Mäusen in einem 12-mm-Polyestermembraneinsatz etabliert wurde, erreichte nach einer Woche in Kultur eine Konfluenz von 90 bis 95 %. Nach zwei Wochen in Kultur waren die Zellen zu 100 % konfluent und begannen, ein Mosaik aus hexagonalen pigmentierten und zweikernigen Zellen zu bilden.In der dritten Woche veränderten sich die Zellen weiter in Form und Pigmentierung. Nach vier Wochen wurde jedoch ein Teil der Zellen hyperpigmentiert. Die Reinheit der primären RPE-Zellkultur wurde mit dem RPE65-Antikörper bewertet, der die Retinoid-Isomerohydrolase markiert, ein Enzym, das für den visuellen Zyklus von Wirbeltieren entscheidend ist.Die Integrität der Zell-zu-Zell-Verbindungen und der hexagonalen Zellform wurde durch Färbung mit Phalloidin nachgewiesen. Tight Junctions wurden durch Analyse der ZO-1-Proteinexpression visualisiert, die mit Hilfe einer Aminofärbung sichtbar gemacht und durch Western Blotting validiert werden konnten. Insgesamt sind die Kulturen in der Lage, sich zu vermehren, die Pigmentierung und ihre hexagonale Form beizubehalten, während sie Tight Junctions bilden und funktionelle Marker wie RPE65 exprimieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RPE-Zellen aus den Augen der Maus isoliert und sie in vitro richtig kultiviert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Augen immer feucht zu halten und zu versuchen, so schnell wie möglich zu arbeiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir bieten eine reproduzierbare Methode zur Kultivierung konfluente Monolayer von menschlichen fetalen retinalen Pigmentepithelzellen (hfRPE) Zellen, die Morphologie, Physiologie, Polarität und Protein-und Genexpression von adulten nativen Gewebe aufweisen. Diese Arbeit hat zu einem Tiermodell verschiedener Augenerkrankungen erweitert worden.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie retinalen Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in Kultur zu klonalen Netzhaut Kugeln zu bilden. Die Kugeln, die isoliert besitzen den Kardinal Eigenschaften von Stammzellen: Selbsterneuerung und multipotentiality.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

Neuronale Netzhaut einer Maus im Alter von 8 Tagen auf einem 4% igen Gelatineblock. Nach Isolierung der Photorezeptorschicht (200 um) durch Vibratom werden die Photorezeptoren nach der mechanischen und enzymatischen Spaltung der Kultur beimpft. Die Photorezeptorschicht kann für die molekulare, biochemische Analysen oder Transplantation verwendet werden.

Vibratom Schnitte Maus-Retina zu Photorezeptor Kulturen vorbereiten

Das Protokoll beschreibt organotypische Explanten der Maus NeuroRetina, kultiviert zusammen mit seinem retinalen Pigment epithel (RPE), in R16 definierten Medium, frei von Serum und Antibiotika. Diese Methode ist relativ einfach durchzuführen, im Vergleich zu In-vivo-Experimenten kostengünstiger und zeitaufwändigund und kann an zahlreiche experimentelle Anwendungen angepasst werden.

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

Hier wird eine einfach zu befolgende Methode zur Kultivierung primärer retinaler Netzhaut-Pigmentepithelzellen in vitro vorgestellt.

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

Wir beschreiben eine einfache und effiziente Methode zur Isolierung von Zellen der retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen. Dieses Verfahren ermöglicht molekularbiologische Folgeuntersuchungen am isolierten RPE, einschließlich Genexpressionsanalysen.

Isolierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus Meerschweinchenaugen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus lokal gewonnenen Schweineaugen. Diese Zellen dienen als hochwertige Alternative zu Stammzellen und eignen sich für die In-vitro-Netzhautforschung .

Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen von Schweinen für die In-vitro-Modellierung

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung retinaler glialer Müller-Zellen aus Mausaugen. Das Protokoll beginnt mit der Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von Müller-Zellen.

Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Erfahren Sie die Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus Mäuseaugen. Diese einfache Methode ermöglicht die Erhaltung der ursprünglichen Zelleigenschaften für die Netzhautforschung.

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

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