Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Reparierbarkeit der Plasmamembran in Zellen von Muskeldystrophie-Patienten zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei Muskeldystrophie zu beantworten, z. B. welche Beziehung zwischen einer bestimmten Mutation und der Kinetik der Membranwiederversiegelung besteht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Echtzeit-Quantifizierung der Kinetik der Membranwiederversiegelung in lebenden Zellen ermöglicht.

Beginnen Sie mit der Kultivierung von Fibroblastenzellen in einem T225-Kolben mit 40 Millilitern Wachstumsmedium in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Wenn die Kultur eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht, spülen Sie die Zellen zweimal mit 40 Millilitern PBS pro Waschgang und fügen Sie anschließend fünf Milliliter 0,05 % Trypsin für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius hinzu. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit 40 Millilitern frischem Wachstumsmedium und säen Sie zwei Milliliter Zellen in einer Konzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter in 35-Millimeter-Kollagen-beschichtete Glasbodenplatten für eine Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Geben Sie 150 Mikroliter frisches Medium ohne Serum in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Transfektionskultur. Geben Sie dann drei Mikroliter Transfektionsreagenz in jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen mindestens fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Während die Röhrchen inkubiert werden, geben Sie 175 Mikroliter aus Serum gewonnenes Medium und 3,5 Mikrogramm Dysferlin-Plasmid-DNA in ein zusätzliches 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Platte.

Kombinieren Sie dann 150 Mikroliter der Plasmid-DNA-Lösung mit 150 Mikrolitern des Transfektionsreagenzes in einem neuen Röhrchen pro Platte für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das Wachstumsmedium durch zwei Milliliter aus Serum gewonnenes Medium. Verteilen Sie am Ende der Inkubation die gesamten 300 Mikroliter Plasmidlösung gleichmäßig auf jede Platte und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang im Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Ersetzen Sie am nächsten Tag den Plasmidüberstand durch frisches Wachstumsmedium und stellen Sie die Platten für weitere 24 Stunden in den Inkubator. Um die Zellen für einen Zwei-Photonen-Wundassay vorzubereiten, spülen Sie die transfizierten Kulturen einmal mit einem Milliliter Tyrode-Lösung. Geben Sie dann einen Milliliter frische Tyrode-Lösung, ergänzt mit einem Mikroliter 2,5-Millimolar FM4-64-Farbstoff, zu den Zellen.

Erstellen Sie anschließend mit einem inversen konfokalen Mikroskop ein 0,2 x zwei Mikrometer großes Ziel in der Software des Mikroskops und platzieren Sie das Ziel am Rand der Zellmembran, so dass die Ziellinie überlappt und senkrecht zur Zellmembran liegt. Wählen Sie einen 543-Nanometer-Helium-Neon-Laser aus, um das FM-Farbstoffsignal anzuregen, und einen 488-Nanometer-Argon-Laser, um das GFP-Signal anzuregen, und stellen Sie den Nachweisbereich auf 600 bis 760 Nanometer bzw. 500 bis 550 Nanometer ein. Erstellen Sie dann eine fünfminütige Zeitreihe sequenzieller Bildscans.

Um eine Membranläsion zu erzeugen, verwenden Sie einen Zwei-Photonen-Laser auf 820 Nanometer bei 15 % Laserleistung mit 10 Iterationen, um die Zellen 25 Sekunden nach Beginn der Zeitreihe zu bleichen. Um die FM4-64-Farbstofffluoreszenz zu quantifizieren, verwenden Sie die Software, um einen sechs x sechs Mikrometer großen Bereich von Interesse zu zeichnen, und platzieren Sie den interessierenden Bereich neben der Verwundungsstelle innerhalb der Zelle. Subtrahieren Sie dann den Hintergrundwert und dividieren Sie den Nettoanstieg durch den Fluoreszenzwert zum Zeitpunkt Null, um die relativen Fluoreszenzwerte für jeden Zeitpunkt zu berechnen.

Gesunde humane Fibroblastenzellen weisen nach einer Laserverletzung ein geringes Maß an FM4-64-Fluoreszenzaktivierung auf, während unbehandelte Patientenfibroblasten nach einer Verletzung ein hohes Maß an relativer Fluoreszenzintensität aufweisen. Patientenzellen, die mit einem Dysferlin-Plasmid in voller Länge transfiziert wurden, zeigten eine reduzierte relative FM4-64-Fluoreszenzintensität im Vergleich zu unbehandelten Patientenkontrollen, aber ähnlich wie die Fluoreszenzwerte, die bei gesunden Kontrollen beobachtet wurden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass die Zellen in der Pufferlösung langsam absterben, also arbeiten Sie schnell und wechseln Sie in regelmäßigen Abständen zu frischen Zellen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Membranläsionen mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop regeneriert werden und wie Sie die Membranwiederversiegelung in Echtzeit quantifizieren können.