Name: Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Erfahren Sie laminare Flussbasierte Assays zur Untersuchung der Leukozytenrekrutierung auf vaskulären Zellen und Thrombozyten. Diese kostengünstige Methode ermöglicht vielfältige experimentelle Bedingungen in der Immunologie.

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Wir danken Dr. Martin M. Schmitt und Linie Fraemohs. Diese Arbeit wurde von der niederländischen Stiftung für wissenschaftliche Forschung (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR Nr. 1638) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) an R.R.K. vergeben unterstützt.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der medizinischen Ethik und Tier ethischen Gremien der Universität Maastricht genehmigt.
(1) Flow-Based Assays mit menschlichen Zellen
<ol><li>
Isolierung von Thrombozyten aus menschlichem Blut
	<ol>
<li>Zeichnen Sie venöses Blut in Antikoagulanz Citrat (3,2 %).</li>
		<li>Volumen 1/15 der Acid Citrat Dextrose (ACD: 80 mM Trinatrium Citrat, 52 mM Zitronensäure und 183 mM Glukose) ins Blut.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 350 X g ohne Bremse für 15 min, Platelet rich Plasma (PRP) zu erhalten.</li>
		<li>Übertragen Sie den überstand auf eine 15 mL konische Rohr und fügen Sie 1/20-bändige von ACD.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 1.110 g ohne Bremse für 15 min, Thrombozyten Armen Plasma (PPP) zu erhalten.</li>
		<li>Verwerfen Sie den überstand. Schneiden Sie das Ende der pipettieren Spitze (P-1000), breite Bohrung, welche Hilfsmittel bei der Prävention von Thrombozyten Aktivierung und sorgfältig aussetzen der Thrombozyten Pellet in das gleiche Volumen wie PRP Platelet Puffer pH 6,6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, MgCl22 mM, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Glukose). 1/20-bändige von ACD hinzufügen und vorsichtig mischen.</li>
		<li>Pellet-die Thrombozyten bei 1.110 g ohne Bremse für 15 Minuten.</li>
		<li>Den überstand verwerfen und sorgfältig aussetzen der Thrombozyten als oben in 1 mL Thrombozyten Puffer (pH 7,5).</li>
		<li>Messen Sie die Thrombozyten Konzentration in einer Verdünnung von 1/10 mit einem automatisierten Hämatologie-Analysator.</li>
		<li>Stellen Sie die Lautstärke mit Thrombozyten-Puffer (pH 7,5), eine Anzahl von 2 x 107/mL zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolation von polymorphkernigen Zellen aus menschlichem Blut (adaptiert von Brinkmann Et al. ( 11 )
	<ol>
<li>Ziehen Sie 24 mL Blut in Heparin (10 U/mL) als Antikoagulans.</li>
		<li>6 mL 1,077 g/mL Dichte Polysucrose-Natrium Diatrizoate Medium hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien), eine 15 mL konische Rohr und sorgfältig Schicht 5-6 mL Vollblut an der Spitze.</li>
		<li>Zentrifuge für 20 min bei 800 X g ohne Bremse.</li>
		<li>Aspirieren Sie und verwerfen Sie die klare gelbliche oberste Schicht und übertragen Sie die untere rötliche Phase mit Granulozyten in frischen 15 mL konische Röhrchen zu. Waschen Sie Zellen durch Zugabe von PBS mit 2 mM EDTA zu einem Endvolumen von 14 mL und Zentrifuge für 10 min bei 300 X g ohne Bremse.</li>
		<li>In der Zwischenzeit bereiten ein Dichte-Gradienten-Medium (z. B.Percoll, siehe Tabelle of Materials) funktionierende Lösung durch Mischen von 18 mL-Dichte-Gradienten-Medium mit 2 mL 10 x PBS-Stammlösung. Diese funktionierende Lösung mit PBS verdünnen (1 X), 4,25 mL jeweils 85 %, 80 %, 75 %, 70 % und 65 % Steigung mittlere Lösungen zu erhalten.</li>
		<li>Bereiten Sie 2 konische Rohre mit der dichtegradient durch 2 mL jeden mittlerer Prozentsatz übereinander Schichten. Mit der höchsten Konzentration beginnen und weiter in absteigender Reihenfolge. Markieren Sie die Schichten auf dem Rohr mit einer wasserdicht-Markierung.</li>
		<li>Sorgfältig Schicht 2 mL Zellsuspensionen auf jede der beiden vorbereiteten Gradienten.</li>
		<li>Zentrifuge für 20 min bei 800 X g ohne Bremse in einer sorgfältig ausbalancierten Zentrifuge.</li>
		<li>Nach Zentrifugation, entfernen Sie die obere Schicht und den Großteil der 65 % layer (erste Ring) mit PBMCs und sammeln Sie in neue Schläuche die weißen noch Grenzschichten bis 85 %-Schicht (zweiter ring, PMN).</li>
		<li>Waschen Sie Zellen durch Auffüllen der Rohre mit PBS 2 mM EDTA und Zentrifuge für 10 min bei 300 X g ohne Bremse.</li>
		<li>Den überstand zu entfernen und die sedimentierten Zellen (in der Regel sind ≥95 % PMN) in 1 mL Hanks Puffer (pH 7,45), mit 10 mM Hepes und 0,2 % Humanalbumin (testpuffer) aussetzen.</li>
		<li>Zählen der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer und Zellen auf 1 x 106/mL auszusetzen.</li>
		<li>Fahren Sie mit fluoreszierenden Etikettier- und Perfusion der Leukozyten (Schritt 3.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der adhärenten Thrombozyten- und vaskuläre Zelle-Monolagen
	<ol>
<li>
Zell-Kultur Gericht Vorbereitung (kultivierten Zellen)
		<ol>
<li>Pre-Mantel die 35 mm Zelle Kultur Gerichte mit 1 mL verdünnter Ratte Schweif Kollagen (30 µg/mL verdünnt mit PBS-Puffer über einen 0,2 µm-Filter gefiltert).</li>
			<li>30 min bei 37 ° C inkubieren, die Kollagen-Lösung zu verwerfen und das Gericht einmal mit PBS waschen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Kultur der vaskulären Zellen in Kultur Gerichte
		<ol>
<li>Lösen von primären (z. B.HUVECS, HAoEC, HAoSMC) oder verewigt vaskuläre Zellen (z.B.EA. Hy926, SVEC) bis Mündung in einem T75 Kolben mit 1,5 mL Zelle Ablösung Lösung (z.B., Accutase) angebaut. Hinzugeben Sie 4,5 mL geeigneten Wachstumsmedium zu neutralisieren die Zelle Ablösung Lösung und bestimmen die Zellkonzentration mit einer Zelle zählen Kammer. Die Zellen bei 0,5 x 105 Zellen/mL in geeigneten Wachstumsmedium (z.B. komplette Endothelzellen Wachstumsmedium) aussetzen.</li>
			<li>Jedes Gericht 35 mm 2 mL Zellsuspension hinzufügen. Die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 bis zum Zusammenfluss (unter 24 – 48 h, je nach Zelltyp) Kultur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Deckglas Glasbearbeitung (adhärenten Thrombozyten)
		<ol>
<li>Tauchen Sie die Glas-Deckglas einmal in HCl-EtOH (1,2 M / 50 % V/V).</li>
			<li>Spülen Sie das Deckglas 2mal in Reinstwasser.</li>
			<li>Trocknen Sie das Deckglas unter N2.</li>
			<li>Pre-Mantel der Glas-Deckglas mit 100 µL, entsprechend der Position des Kanals der Perfusion Kammer des verdünnten Ratte Schweif Kollagen Typ I (30 µg/mL verdünnt mit PBS-Puffer über einen 0,2 µm-Filter gefiltert).</li>
			<li>30 min bei RT inkubieren, entsorgen Sie die Kollagen-Lösung und waschen das Deckglas 3 X mit PBS.</li>
			<li>Block das Deckglas Kollagen beschichtet mit 1 % BSA in HEPES für 0,5 h bei RT</li>
			<li>Waschen Sie und trocknen Sie das Deckglas und montieren Sie ihn in die Perfusion Kammer. Thrombozyten aus menschlichen oder Maus Blut wie in Schritt 1.1 oder 2.1, bzw. zu isolieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Immobilisierung von Thrombozyten
		<ol>
<li>Fügen Sie 70 µL einer 2 x 107/mL Thrombozyten Suspension pro Kanal und inkubieren Sie für 1,5 h bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
			<li>Ersetzen Sie sorgfältig nicht adhärenten Thrombozyten durch blockierende Lösung (5 % BSA in HEPES) für mindestens 30 min bei RT weiter mit fluoreszierenden Kennzeichnung und Perfusion der Leukozyten (Schritt 3.3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Stimulation der vaskulären Zelle Monoschicht
		<ol>
<li>Stimulieren Sie die vaskulären Zellen durch Austauschen der Medien mit frischem Medium mit 10 ng/mL Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF) 4 h bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Flow-based Assays mit murinen Zellen
<ol><li>
Isolierung von Thrombozyten aus Maus Blut
	<ol>
<li>Zeichnen Blut durch Herzpunktion mit Hilfe einer Nadel 21 G (~ 1 mL) von betäubt (Ketamin 80 mg/kg und Medetomidine 0,3 mg/kg) 6 – 8 Wochen-alte Mäuse (C57Bl/6) in (3,2 %) Citrat als Antikoagulans.</li>
		<li>Fügen Sie 1/6 Volumen von ACD.</li>
		<li>Zentrifuge bei 220 X g, mittlere Bremse für 5 min, Platelet rich Plasma (PRP) zu erhalten.</li>
		<li>Den überstand (~ 600 µL) plus 1/3 der roten Blutkörperchen zu übertragen, zu einem neuen Schlauch</li>
		<li>95 X g ohne Bremse für 6 min zentrifugieren.</li>
		<li>Den überstand (PRP) zu übertragen und die Thrombozyten Konzentration in einer Verdünnung von 1/10 in Tyrode Puffer Messen (TH Puffer: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Glukose) mit einem automatisierten Hämatologie-Analysator.</li>
		<li>Waschen Sie die Thrombozyten durch Hinzufügen von 1/25 Volumen von ACD + 0,1 U/mL Apyrase und 2.870 g, mittlere Bremse für 2 min zentrifugieren.</li>
		<li>Den überstand verwerfen und 600 µL TH Puffer, 1/10-bändige von ACD und 0,1 U/mL Apyrase hinzufügen. Schneiden Sie die pipettieren Spitze (P-1000), trug breit zu machen, hilft bei der Verhinderung von Thrombozyten Aktivierung und sanft auszusetzen das Pellet.</li>
		<li>Zentrifuge auf 2.870 g, mittlere Bremse für 2 min</li>
		<li>Den überstand verwerfen und sanft aussetzen der Thrombozyten in TH Puffer.</li>
		<li>Stellen Sie die Lautstärke mit TH-Puffer, eine Anzahl von 2 x 107/mL zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der adhärenten Thrombozyten Monoschichten
	<ol>
<li>Glas-Deckglas (adhärenten Thrombozyten) gemäß 1.3.3 vorzubereiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immobilisierung von Thrombozyten
	<ol>
<li>Fügen Sie 100 µL einer 2 x 107/mL Thrombozyten Suspension pro Kanal und inkubieren Sie für 1,5 h bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		<li>Ersetzen Sie sorgfältig nicht adhärenten Thrombozyten durch blockierende Lösung (5 % BSA in HEPES) für mindestens 30 min bei RT weiter mit fluoreszierenden Kennzeichnung und Perfusion der Leukozyten (Schritt 3.3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimulation der Maus Thrombozyten Monoschicht
	<ol>
<li>Vor Perfusion der Leukozyten (Schritt 3.3), stimulieren die Thrombozyten durch Perfusion von Thrombin (0,5 nM) in HHHSA Puffer für 3 min bei 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) fluoreszierende Etikettier- und Perfusion der Leukozyten (PMN oder THP-1 für Menschen- und RAW264.7 oder primäre Maustaste Monozyten für Murine Flow-Based Assay)
<ol><li>
Fluoreszierende Kennzeichnung
	<ol>
<li>Beschriften Sie die Leukozyten (1 x 106/mL) mit der Zelle-permeationsfähigen grün fluoreszierenden Nukleinsäure-Fleck (1 µM). Inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 37 ° c</li>
		<li>Waschen mit PBS-Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min, und Zellen zu einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/mL (5 mL pro Testbedingung, abhängig vom Volumenstrom) in testpuffer auszusetzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Flow Kammer-Test Vorbereitung
	<ol>
<li>Verwerfen Sie für Leukozyten Adhäsion auf eine Zelle Monolage Zellkulturmedium aus der Schale zu, und setzen Sie es in die Kammer fließen. Schlauch an der Spritze anschließen. Verbinden Sie für Leukozyten Adhäsion auf immobilisierte Thrombozyten die Mikro Folie an der Spritze. Ein Wasserbad auf 37 ° c Vorwärmen</li>
		<li>Nehmen Sie eine Perfusion Spritze (50 mL), Install Spritze auf die Spritze Halter, und die Pumpe auf zurückzutreten Modus. Stellen Sie die Pumpe Lautstärke auf 0 mL, und geben Sie den Durchmesser 26,70 mm für die 50 mL-Spritze.</li>
		<li>Verbinden Sie einen Ellenbogen Luer-Anschluss an einem Ende des Schlauches. Legen Sie ein Luer-Lock-Koppler an der Spritze und verbinden Sie den Schlauch mit dem Ellenbogen Luer-Anschluss an der Luer-Lock-Koppler. Schließen Sie das kostenlose Schläuche an den Strömungsraum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leukozyten-Perfusion und Haftung
	<ol>
<li>Verwerfen Sie für Leukozyten Adhäsion auf eine Zelle Monolage Zellkulturmedium aus der Schale zu, und setzen Sie es in die Kammer fließen. Schlauch an der Spritze anschließen. Verbinden Sie für Leukozyten Adhäsion auf immobilisierte Thrombozyten die Mikro Folie an der Spritze.</li>
		<li>Für Leukozyten Perfusion und Haftung über einen Kreislauf- oder Thrombozyten Monolage, legen Sie den zweiten Schlauch in ein 50 mL konische Röhrchen mit testpuffer und Füllung tubing mit 1 mL pipettieren, dann drücken Sie den Schlauch und schließen sie eine Strömungsraum.</li>
		<li>Vor der Leukozyten Perfusion der Zellsuspension 3 mM CaCl2 und 2 mM MgCl2 hinzufügen und 5 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Perfundieren Sie testpuffer vor Perfusion der Zellen möglich Luft aus der Kammer und Schläuche zu entfernen.</li>
		<li>Rohrenden in unmittelbarer Nähe drückte sie fest und wechseln Schläuche von testpuffer Zellsuspension, verhindern, dass Luftblasen gefangen. Durchspülen Sie Zellen mit geeigneten Flow Rate/Scherbeanspruchung, bis die ersten Zellen kommen.</li>
		<li>Zellen mit geeigneten Flow Rate/Schubspannung für 2 min durchspülen und mindestens 6 Aufnahmen zwischen 2 – 6 min von Roll- und adhärente Zellen mit einer invertierten Phase Kontrast/Fluoreszenzmikroskop (z.B.EVOS-FL) verbunden mit 100 X Vergrößerung CCD- oder CMOS-Digitalkamera. Hinweis: Flow Rate/Scherbeanspruchung hängt Fluss Kammer Abmessungen und Viskosität des Perfusat. Perfusion Kammer hier verwendet (siehe Tabelle der Materialien): Τ =η* 97.1*Φ Τ: Schubspannung (1 dyn/cm2) Η: Viskosität (0,015 dyn * s/cm2) Φ: Durchfluss (0,67 mL/min)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De-Adhäsion von Leukozyten
	<ol>
<li>Für De-adhesion wechseln Sie Schläuche von Zellsuspension testpuffer durch zusammendrücken der Schläuche verhindern, dass Luftblasen eingeschlossen.</li>
		<li>Zellen durch Perfusion mit testpuffer mit eine entsprechende Flow Rate/Scherbeanspruchung (siehe 3.3.7 Hinweis) abnehmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leukozyten Seelenwanderung
	<ol>
<li>Für Leukozyten Seelenwanderung perfundieren Leukozyten (Schritt 3) bis eine ausreichende Menge der Leukozyten halten (~ 50 Zellen/Sichtfeld).</li>
		<li>Leukozyten-Aufhängung mit testpuffer zu ersetzen.</li>
		<li>Zeichnen Sie fortziehenden Zellen durch Zeitraffer alle 10 – 15 s für 30 – 60 min bei 37 ° C auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li>
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<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immune+system+interactions+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).</li>
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<li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieser in-vitro- Test ist eine einfache Methode, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten während einer vaskulären Entzündung untersuchen, aber es gibt einige kritische Punkte zu beachten. Die erste Voraussetzung für die Durchführung von dieser Test erfolgreich ist die Perfusion der Leukozyten über ein intaktes und konfluierende Gefäß- oder Thrombozyten monomolekularen Film. Dies kann erreicht werden durch die vorherige Beschichtung der Oberflächen mit Kollagen Typ ich. Im Allgemeine...

Bei Verletzungen, Entzündungen oder Infektionen reagieren Leukozyten schnell auf Erreger - oder Schaden-assoziierte molekulare Muster (PAMPs, DAMPs), in einem aktivierten Zustand ändern und bewegen aus der Blutbahn zu Stätten der Entzündungen und Gewebeschäden. Die Fähigkeit der Leukozyten zur Interaktion mit ihrer zellulären und molekularen Umgebung unbedingt für ihr korrektes funktionieren wie Immunzellen, wie durch genetische Störungen wie Leukozyten Adhäsion Mangel1hervorgehoben. Leukozyten Adhäsion ist Gegenstand intensiver Untersuchung während der vergangenen Jahrzehnte und dies führte das Konzept der Leukozyten Adhäsion Kaskade in den frühen 1990er Jahren2,3. Leukozyten Adhäsion wird durch die selektin-vermittelte Aufnahme von Leukozyten des Endothels verursacht die Zellen die Fortschreibung der vaskulären Oberfläche initiiert. Diese Rollen kann Leukozyten Scannen für Endothel-gebundenen wandernden Hinweise, z. B., Chemokine, die die Aktivierung der Integrine zu induzieren. Anschließend vermitteln die aktivierten Integrine die Bindung an Endothelzellen Liganden, wodurch feste Leukozyten Verhaftung. Leukozyten können anschließend bereiten Sie Leber durch kriechen und verbreiten, vor dem Eindringen in die Endothelzellen Monolage und einen in das darunter liegende Gewebe. Das Grundkonzept der kanonischen Leukozyten Kaskade hat seit seiner Einführung weitgehend unverändert, mit einigen Zwischenschritten hinzugefügt4. Dennoch, die genauen molekularen Mechanismen und die Rollen der viele Akteure in der Rekrutierung von Leukozyten nicht geklärt so weit und Leukozyten Einstellung bleibt ein wichtiges Thema im Bereich der Infektion, Entzündung und (Auto-) immun Forschung.
Beispielsweise erhöht während der entzündlichen Gefäßerkrankungen wie Arteriosklerose, Leukozyten Rekrutierung in die Behälter Wand Laufwerke Plaque Entwicklung. Instabile arteriosklerotische Plaques könnte platzen, zu einer massiven Aktivierung von Blutplättchen und das Gerinnungssystem und anschließend zur Okklusion des Schiffes5führt. Dies kann zu schweren Herz-Kreislauf-Ergebnisse wie Herzinfarkt oder Schlaganfall führen. Endotheliale Denudation als es tritt klinisch, z.B. nach Stentimplantation einer Koronararterie führt zusätzlich zu einer Vielzahl von Interaktionen von Leukozyten und Thrombozyten, die exponierten Schiff wandinnenseite (z.B.Matrix Komponenten und glatt Muskel-Zellen) und der Leukozyten mit Thrombozyten deckt der gefäßverletzung. Diese Interaktionen sind wichtig für die weitere Entwicklung der Krankheit wie Monocyte-Thrombozyten Interaktionen Neointima Bildung6,7fahren könnte. Darüber hinaus Thrombozyten-Leukozyten Interaktion vermittelt durch Leukozyten Integrin Mac-1 (αMβ2) und Thrombozyten GPIbα vor kurzem als neue Treiber von Thrombosen in Mäusen8eingestuft wurden.
Angesichts die breite Verfügbarkeit von Mensch und Tier Blut als eine Quelle von Leukozyten und Thrombozyten für Forschung und das breite Spektrum der isolierten Matrix Moleküle und immortalisierte Zelllinien von Leukozyten und vaskulären Ursprungs ist es machbar, Leukozyten zu simulieren Interaktionen unter fließen in ein Labor einrichten, mit speziell entwickelten Fluss Perfusion Kammern. Viele Varianten wurden in den vergangenen Jahrzehnten, von Vakuum-getrieben bis hin zu selbstklebenden Perfusion Kammern entwickelt. Alle Varianten haben gemein, die der unbewegliche Teil (z.B., kultivierten vaskuläre Zellen oder matrixproteine) in eine größere auslaufsichere Kammer ausgestattet mit einem vorab definierten Kanal ermöglicht Perfusion von Flüssigkeiten über den unbeweglichen Teil montiert ist. Darüber hinaus ermöglichte Fortschritte in molding Technologie die Entwicklung von maßgeschneiderten Lösungen auf Basis von Kieselsäure Polymere9. Die Viskosität und die Durchflussmenge der PERFUNDIERTEN Flüssigkeiten und die Höhe des Kanals bestimmen vor allem die Scherspannung Eigenschaften der Strömung Perfusion Gerät10. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine in-vitro- Methode zu studieren zugrunde liegenden Mechanismen der Adhäsion, de-Adhäsion und Transmigration von Leukozyten unter venösen und arteriellen Strömungsformen. Der Vorteil der hier vorgestellten Methoden ist, dass sie mit einem gemeinsamen Kamera angeschlossen Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden können, und erfordern keine Experimentatoren, hohe technische Qualifikation besitzen. Der in-vitro- Test kann in vielerlei Hinsicht (z. B.durch Hinzufügen von Inhibitoren oder blockieren Antikörper), manipuliert werden und gilt somit in verschiedenen Modellen von vaskulären Entzündung und ermöglicht die Untersuchung der Adhäsion Proteinfunktionen oder die Bewertung der spezifischen Verbindungen.

<table><tbody><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop z.B. EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pump z.B. Modell: 210-CE</td><td>&nbsp; world precision instruments</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Zellkulturschale</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauch</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>Winkel-Luer-Konnektor männlich</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>weiblicher Luer-Lock-Kuppler</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Strömungskammer</td><td>Universitätsklinikum RWTH Aachen</td><td></td><td>Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&ouml; mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&auml; ngen an Zelloberfl&auml; Chen. 2005.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ibidi Sticky Slide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser für Sticky Dias&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ I, Rattenschwanz</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes TNF-& alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Thrombinrezeptor-Aktivator für Peptid 6 (TRAP - 6)</td><td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 grün fluoreszierender Nukleinsäure-Farbstoff</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Pufferlösung 1M, flüssig</td><td>Life Technologies Europe</td><td>bv 15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINAT Albumin, 25%&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>Wasser für Injektionszwecke</td><td>B. Braun</td><td>3624315</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Merck</td><td>102382&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Primäre Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsmedium für Endothelzellen (gebrauchsfertig)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Primäre humane Aorten-Endothelzellen (HAoEC)</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>Vaskuläres Zell-Basalmedium&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumskit für Endothelzellen-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>Primäre glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta (HAoSMC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumskit für vaskuläre glatte Muskelzellen</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>Humane Endothelzelllinie, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Endothelzelllinie, SV 40 transformiert (SVEC4-10)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>Humane monozytäre Zelllinie, THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mit Ultra-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Monozyten/Makrophagen RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), hohe Glukose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Vacutainer Blutentnahmeröhrchen aus Kunststoff mit Natriumheparin</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Gerinnungs-Natriumcitrat 3,2%&nbsp;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>HCl/EtOH Gemisch (1,2 mol/L HCl und 50% Ethanol) in Wasser</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>Vorbereiten durch Mischen von 0,3L HCl (4 mol/L) mit 0,7L 70% v/v Ethanol in einem Abzug</td><td></td></tr></tbody></table>

laminar-flow-based assays, rekrutierung von leukozyten auf kultivierten vaskuläre zellen und adhärenten thrombozyten zu untersuchen

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

Die Rekrutierung von Leukozyten nach Verletzung oder Entzündung zu Websites von Verletzungen oder Gewebeschäden wurde in den letzten Jahrzehnten untersucht und führte das Konzept der Leukozyten Adhäsion Kaskade. Die genauen molekularen Mechanismen bei der Rekrutierung von Leukozyten haben jedoch noch nicht vollständig geklärt. Da Leukozyten Rekrutierung ein wichtiges Thema im Bereich der Infektion, Entzündung und (Auto-) immun Forschung bleibt, präsentieren wir einen einfachen Laminar-Flow-based Assay zu studieren zugrunde liegenden Mechanismen der Adhäsion, de-Haftung und Transmigration von Leukozyten unter venösen und arteriellen Strömungsformen. Der in-vitro- Test kann verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu studieren, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner in verschiedenen Modellen von vaskulären Entzündung zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt eine Laminar-Flow-based Assays mit Parallel Strömungsraum und einem inversen Phase-Kontrast-Mikroskop mit einer Kamera verbunden, untersuchen die Wechselwirkungen der Leukozyten und Endothelzellen oder Thrombozyten, die visualisiert und dann aufgezeichnet werden können offline analysiert. Endothelzellen, Thrombozyten und Leukozyten können mit Inhibitoren oder Antikörper gegen die Rolle bestimmter Moleküle während dieses Prozesses bestimmen vorbehandelt werden. Scher Bedingungen, d.h. arterielle oder venöse Schubspannung, können leicht durch die Viskosität und die Durchflussmenge der PERFUNDIERTEN Flüssigkeiten und die Höhe des Kanals angepasst werden.

Um endotheliale Leukozyten Adhäsion zu untersuchen, wurden eindringmittel beschriftete THP-1-Zellen über eine TNF - oder nicht-stimulierten Endothelzellen Monolage für 2 min bei 3 dyn/cm2durchblutet. Die Gesamtzahl der anhaftende monozytären Zellen wurde nach 2 min der Perfusion durch die Erfassung von 6 unabhängige Felder über einen Zeitraum von 2 bis 6 min ermittelt. Adhärenten Zellen wurden in mindestens 6 Bilder eingefangen mit einer invertierten Phase Kontrast/Fluoreszenz...

Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Mechanismen hinter den Wechselwirkungen von Leukozyten mit adhärenten Gefäßzellen oder Blutplättchen unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, z. B. wie Leukozyten an Entzündungsherde rekrutiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie kostengünstig und benutzerfreundlich ist und die Untersuchung einer Vielzahl von Versuchsbedingungen ermöglicht.Diese Methode kann Aufschluss über die Adhäsion von Leukozyten geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z.B. die Adhäsion von Tumorzellen an immobilisierte Zellen oder Substrate unter Strömungsbedingungen. Das Verfahren wird von Annemiek Dickhout, einer Ingenieurin und Doktorandin, die in meinem Labor arbeitet, demonstriert.Geben Sie nach der Entnahme von Blutproben 1/15 Volumen saurer Citrat-Dextrose in das Blut. Als nächstes zentrifugieren Sie die Blutprobe, indem Sie die Bremsen 15 Minuten lang auf das 350-fache g stellen, um plättchenreiches Plasma zu erhalten. Dann wird der erhaltene Überstand in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Plättchenadhäsion Kaskade erfolgt in Gegenwart von Scherströmung, ein Faktor, nicht entfielen in konventionellen (statischen) Well-Platte-Assays. Dieser Artikel berichtet über eine Thrombozyten-Aggregation-Assay unter Verwendung eines mikrofluidischen Well-Platte-Format auf physiologische Scherströmung Bedingungen zu emulieren.

Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Wir beschreiben eine Methode, um unter adhärenten Zellen eine laminare Strömung Schubspannung in einem sterilen kontinuierlichen Kreislauf. Die Zellen "Haftung kann Morphologie durch die transparente Kammer untersucht werden, Proben aus der Schaltung für Metabolit-Analyse und-Zellen nach Scher-Belastung für zukünftige Experimente oder Kultur geerntet wurden.

Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Dieses Video zeigt einen auf Laminarströmung basierenden Assay zur Charakterisierung der Interaktion von Leukozyten und zellulären Partnern wie Endothelzellen. Diese Methode liefert dynamische Einblicke in die Adhäsion, Deadhäsion und Transmigration von Leukozyten, wenn sie über eine intakte und konfluente Schicht von Gefäßzellen perfundiert werden.

Ein Laminar-Flow-basierter Assay zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen

Das Video zeigt eine Methode zur Untersuchung des Einflusses von Stromazellen auf die Rekrutierung von Leukozyten. In einem Modell mit paralleler Plattenströmungskammer induzieren proinflammatorische Zytokine die Expression von Adhäsionsrezeptoren durch Endothelzellen, was die Rekrutierung und Migration von Neutrophilen erleichtert. Die Wechselwirkung zwischen Stromazellen und Endothelzellen verringert die Rekrutierung von Neutrophilen zu den Endothelzellen.

Eine in vitro Flow-Untersuchung der Wirkung von Stromazellen auf die Rekrutierung von Leukozyten

Leukozyten-Rekrutierung in die Leber tritt innerhalb der spezialisierten Kanäle der Lebersinuskurven, die durch einzigartige hepatischen sinusoidalen Endothelzellen ausgekleidet sind. Phasenkontrast-Mikroskopie von Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel unter physiologischen Bedingungen der Schubspannung kann die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die diesen Prozess zugrunde liegen, zu erleichtern.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Hier stellen wir ein Protokoll, das die Ermittler Leukozytenrekrutierung Dynamik ex vivo durch Verbinden einer Kammer mit Endothelzellen stamm Adhäsionsmolekülen auf das Kreislaufsystem der Maus beschichtet beurteilen können. Dieses Verfahren bietet deutliche Vorteile, da es eine Leukozyten-Beurteilung nach relativen biologischen Bedingungen.

Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem Ex vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Die Fähigkeit von entzündetem Endothel Leukozyten aus Strömungs Rekrutierung von mesenchymalen Stromazellen geregelt. Wir beschreiben zwei in vitro Modelle mit primären humanen Zellen, die verwendet werden können, um neutrophilen Rekrutierung von Flow zu bewerten und zu prüfen, welche Rolle die mesenchymalen Stromazellen bei der Regulierung dieses Prozesses spielen.

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Diese Arbeit beschreibt eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode für die Untersuchung von Thrombozytenadhäsion, -ausbreitung und -sekretion unter Strömung. Diese vielseitige Plattform ermöglicht die Untersuchung der Thrombozytenfunktion für die mechanistische Forschung auf Thrombose und Hämostase.

Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow

Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Dieses schrittweise Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Versuchsanordnung und Datenanalyse für die Bewertung von Entzündungsreaktionen in HiPSC-ECs und die Analyse der Leukozyten Adhäsion unter physiologischen Fluss.

Mikrofluidische Assay für die Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Endothelzellen (HiPSC-ECs)

Erfahren Sie laminare Flussbasierte Assays zur Untersuchung der Leukozytenrekrutierung auf vaskulären Zellen und Thrombozyten. Diese kostengünstige Methode ermöglicht vielfältige experimentelle Bedingungen in der Immunologie.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen (Video) | JoVE Journal

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

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