Isolierung und Charakterisierung tumorinitiierender Zellen aus Sarkom-Patienten-abgeleiteten Xenografts

Wir entdeckten, dass HLA-I epigenetisch in einer Subpopulation von Krebszellen reguliert ist, die Stammzelleigenschaften und tumorinitiierende Kapazität aufweisen. Die HLA-I-Downregulation steht in direktem Zusammenhang mit der Immunflucht und bietet Überlebensvorteile für Krebsstammzellen, wodurch die HLA-I-Negativität zu einem genauen funktionellen Marker für diese Zellen wird. Demonstriert wird das Verfahren von Sudeh Izadmehr, einem Postdoc aus unserem Labor.

Nach dem Erwerb der Probe das Gewebe in eine 100-Millimeter-Petrischale in einem sterilisierten Bio-Sicherheitsschrank legen und 500 Mikroliter sterilen PBS in die Schale geben. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um das Gewebe mechanisch in kleine Stücke zu trituieren, bis kein Fragment größer als 0,1 Millimeter ist. Übertragen Sie das gesamte 500-Mikroliter-Volumen von PBS durch ein 35-Mikrometer Porenzellsieb in ein 50-Milliliter-Konikonnit.

Fügen Sie weitere 500 Mikroliter PBS zu den Gewebefragmenten hinzu und zerkleinern Sie das Gewebe erneut. Filtern Sie dann den Überstand durch das Zellsieb in das gleiche Sammelrohr und schneiden Sie die Gewebestücke weiter, bis die Probe vollständig getrennt ist. Wenn das letzte Volumen der Zellen gesammelt wurde, spinnen Sie die Tumorzellen durch Zentrifugation herunter und setzen Sie das Pellet in fünf MilliliterHämolysepuffer wieder auf.

Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation sammeln und das Pellet mit weiteren fünf Millilitern PBS waschen. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS wieder aus, und zählen Sie die lebensfähigen Zellen. Verdünnen Sie die Zellen auf ein mal 10 bis siebente Zellen pro 200 Mikroliter PBS-Konzentration auf Eis, und fügen Sie den Zellen 200 Mikroliter Kellermembranmatrix mit sanfter Mischung hinzu.

Dann injizieren Sie die Zellsuspension-Keller-Membran-Matrix subkutan in die Flanke einer NOD-Scid-Gamma-Maus und überprüfen Sie das Wachstum des Tumors an der Injektionsstelle zweimal pro Woche. Wenn der Tumor einen Zentimeter Durchmesser erreicht, den Tumor halbieren und die Hälfte des Xenografts mit 4%Paraformaldehyd über Nacht für die histologische Analyse fixieren. Verarbeiten Sie die zweite Hälfte des Tumors, wie gerade gezeigt, um eine Einzelzellsuspension zu erreichen, und verdünnen Sie die Zellen auf ein zwei mal 10 bis die sechs Zellen pro Milliliter PBS, ergänzt mit 5%FBS-Konzentration.

Bewahren Sie die Zellen 30 Minuten auf Eis auf, bevor Sie die Zellsuspension zwischen einer Isotypkontrolle und einem Antikörperrohr aufteilen. Beachten Sie die Anzahl der Zellen in jedem Rohr, und mischen Sie die Zellen im Antikörperrohr mit Anti-HLA-Antikörper nein und die Zellen im Isotyp-Kontrollrohr mit einem geeigneten Anti-Isotype-Kontrollantikörper für eine 90-minütige Inkubation auf Eis. Am Ende der Inkubation sammeln Beide Zellpopulationen durch Zentrifugation, gefolgt von zwei 10-Milliliter-PBS-Washes durch Zentrifugation.

Nach der zweiten Wäsche die Pellets in 10 Mikrogramm pro Milliliter DAPI auf ein mal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter Konzentration wieder aufhängen. Filtern Sie dann jede Zellsuspension durch ein 35-Mikrometer Porensieb in einzelne 12-mal-75-Millimeter-Polystyrolröhren. Nach fluoreszenzaktivierter Zellsortierung die HLA-I-negativen und positiven Zellpopulationen in 15 Milliliter des Sarkosphärenwachstumsmediums pro Teilmenge auf einzelne einmal 10 bis fünfliter Zellkonzentrationen verdünnen.

Die Zellen in 15 Milliliter frischem Sarkosphärenwachstumsmedium pro Verdünnung auf ein mal 10 bis vier, 10 bis dritte und 10 auf die zweite Konzentration in 15 Milliliter frisches Sarkosphärenwachstumsmedium pro Verdünnung verdünnen und 100 Mikroliter Zellen aus jeder Verdünnung zu jedem Brunnen einer 96-well ultraniedrigen Zellkulturplatte pro Verdünnung hinzufügen. Legen Sie die Platten in einen 37-Grad-Celsius-, 5%Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator, überwachen Sie die Sarkosphärenbildung täglich durch Lichtmikroskopie und fügen Sie jedem Brunnen einen frischen Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor und einen epidermalen Wachstumsfaktor hinzu, ohne das Medium alle drei Tage zu ändern. Zählen Sie nach drei Wochen die Anzahl der sarkospheren- und sarkospherennegativen Brunnen für jede Zellverdünnung sowohl von HLA-I-negativen als auch von HLA-I-positiven Zellen, um die Berechnung der kugelbildenden Zellfrequenz auf der Grundlage einer Poisson-Wahrscheinlichkeitsverteilung zu ermöglichen.

Typischerweise bestehen von menschlichen Patienten abgeleitete Sarkom-Xenografts aus zwei unterschiedlichen HLA-I-positiven und negativen Populationen, mit einer ähnlichen Histologie wie der primäre Tumor der Eltern. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung von Sarkom-Patienten-abgeleiteten Xenograft-Tumor-initiierenden Zellen, wie nachgewiesen, erleichtert die Anreicherung einer hohen Anzahl von HLA-I-negativen Zellen aus der elterlichen Zellpopulation. HLA-I-negative Zellen sind in der Lage, Kugeln mit einem anfänglichen Input von nur 10 Zellen zu bilden und zeigen eine höhere Tumorbildungsfähigkeit als HLA-I-positive Sarkom-Patienten angekommen Xenograft Tumor-initiierende Zellen.

Die Subkutane Injektion der gleichen Anzahl von HLA-I-Negativen und positiven Zellen in gegnerische Flanken derselben Maus zeigt, dass HLA-I-negative Zellen eine signifikant höhere Tumorbildungsfähigkeit besitzen. Während Xenografts, die sowohl von HLA-I negativen als auch von positiven Subpopulationen gebildet werden, zellulär heterogene Tumoren sind. Darüber hinaus zeigt die Genexpressionsanalyse der tumorinitiierenden Zellen, dass HLA-I-negative Zellen Stammzelldifferenzierungsmarker exprimieren und dazu gebracht werden können, sich sowohl entlang lipogener als auch osteogener Bahnen zu differenzieren, was eine starke Oil-Red-O- und Alizarin-Red-S-Färbung und -Kultur demonstriert.

Diese Methode kann verwendet werden, um Krebsstammzellen bei verschiedenen menschlichen Krebsarten zu isolieren. Die molekulare Karbonisierung, zum Beispiel durch Sequenzierung der nächsten Generation, kann gemeinsame Marker für die therapeutische Ausrichtung der Zellen aufdecken. Unsere Entdeckung zeigt, dass die Wiederherstellung von HLA-I ein entscheidender Schritt für den Erfolg von Strategien zur Erweiterung der funktionellen Einheitsimmunzellen ist.