Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Gehirne von Drosophila-Larven für die mehrtägige Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zu kultivieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Drosophila-Neurogenetik zu beantworten, wie z.B. Veränderungen der Genexpression, die in bestimmten neuronalen Populationen auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Bildgebung von Fluoreszenzsonden mit Einzelzellauflösung im lebenden Gehirn über einen Zeitraum von Stunden bis Tagen ermöglicht.

Arbeiten Sie bei der Vorbereitung der Reagenzien für dieses Verfahren unter einer Kulturhaube. Sowohl ein Aliquot des SAM-Mediums als auch des Thrombins muss aufgetaut werden, um zu beginnen. Das Thrombin beiseite stellen.

Nehmen Sie ein Aliquot von 2,5 Millilitern SAM, legen Sie das restliche SAM auf Eis und legen Sie es beiseite. Geben Sie dann Penicillin-Streptomycin in das aliquotierte SAM und halten Sie es bei Raumtemperatur. Bereiten Sie für Langzeit-Bildgebungsexperimente eine Vorstellungskammer vor und tragen Sie autoklaviertes Vakuumfett auf die Kunststoffbereiche um die Vertiefung einer Glasbodenschale auf.

Anschließend die gefettete Form mit UV-Licht unter der Haube sterilisieren. Mischen Sie nun ein Aliquot SAM in das Fibrinogen und überführen Sie das Gemisch auf 37 Grad Celsius, wo es zwei Stunden lang nicht polymerisiert. Für die Dissektion reinigen Sie die Pinzette in zwei Dissektionsschalen aus Glas mit drei Vertiefungen mit 70 % Ethanol.

Beladen Sie dann vier Vertiefungen mit 400 Mikrolitern DSS und eine Vertiefung mit 400 Mikrolitern SAM. Bewahren Sie die Sezierschalen auf einem gekühlten Teller auf. Schöpfen Sie aus einem Fläschchen mit sich vermehrenden Fliegen etwas Medium mit nicht wandernden Larven des dritten Stadiums aus und geben Sie bis zu sieben mit einer Pinzette in eine Vertiefung mit kaltem DSS.

Führen Sie dann die Larven durch drei der vier mit DSS beladenen Vertiefungen, um sie zu reinigen, und lassen Sie sie in der letzten Vertiefung, bis sie präpariert sind. Verwenden Sie die vierte Vertiefung von DSS, um die Larvengehirne mit einer sauberen, feinen Pinzette zu sezieren.

Verwenden Sie die bewährte Inside-Out-Methode. Mit Geschick kann jede Larve in etwa 30 Sekunden verarbeitet werden. Verwenden Sie nach jeder Dissektion eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze, die mit DSS vorgespült wurde, um das Gehirn in etwa drei Mikrolitern DSS in die mit SAM gefüllte Vertiefung zu übertragen.

Bereiten Sie bis zu sieben Gehirne auf das Einbettungsverfahren vor. Nachdem Sie das Gehirn in die Arbeitslösung überführt haben, geben Sie das Gehirn und das Medium auf den Deckel einer sterilen Petrischale. Fügen Sie dann weitere 3,5 Mikroliter SAM mit Antibiotika hinzu und fügen Sie 3,5 Mikroliter warmes SAM mit Fibrinogen hinzu.

Es ist wichtig, das SAM-Medium während des gesamten Eingriffs mit Fibrinogen auf 37 Grad zu halten. Mischen Sie als Nächstes die Lösung um das Gehirn herum, indem Sie vorsichtig mit derselben Pipettenspitze pipettieren und aspirieren Sie zwei Mikroliter der Lösung, um sie auf einem Deckglas für eine Glasbodenschale abzulagern. Fügen Sie dann 0,8 Mikroliter Thrombin zum Tröpfchen hinzu und mischen Sie sehr schnell, um die Polymerisation zu initialisieren, die weiß erscheint.

Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Gehirn vorsichtig zu berühren und es auf die polymerisierende Fibrinmatrix zu setzen. Ich denke, das Thrombin, nachdem das Gehirn auf das Tröpfchen übertragen wurde, wird nicht empfohlen, da es einen Großteil des Verfahrens erschwert. Richten Sie das Gehirn nach Bedarf aus und schieben Sie das Gehirn ganz vorsichtig so nah wie möglich an das Deckglas.

Nehmen Sie dann eine Schicht polymerisiertes Fibrin und falten Sie sie mit kleinen und sanften Bewegungen, die sich nicht von der Matrix lösen, auf das Gehirn. Falten Sie weiterhin Schichten von polymerisiertem Fibrin aus verschiedenen Teilen des Gerinnsels über das Gehirn, um das Gehirn zu stabilisieren. Lagern Sie dann 20 Mikroliter SAM mit Antibiotika über dem eingebetteten Gehirn ab, um die Thrombinaktivität zu stoppen.

Mit diesem Verfahren fahren Sie fort, indem Sie fünf bis sechs Gehirne auf eine Glasbodenschale einbetten. Für die Langzeitbildgebung tauchen Sie die eingebetteten Gehirne in 600 Mikroliter SAM mit Antibiotika. Legen Sie dann ein Stück PTFE-Membran über das Medium und kleben Sie die Ränder der Membran auf die gefetteten Teile der Schale.

Füllen Sie für kurze Assays die Schale mit zwei Millilitern SAM mit Antibiotika, tauchen Sie das Gehirn ein und verzichten Sie auf die Verwendung der PTFE-Membran. Mit den beschriebenen Verfahren wurden Gehirne, die einen molekularen Uhrreporter exprimieren, der von einem Uhrenneuronentreiber gesteuert wird, in Hell-Dunkel-Phase mitgerissen und dann als Explantatkulturen präpariert. Die Langzeitkulturen wurden während der hellen Phase, kurz vor Einbruch der Dunkelheit, aufgebaut.

Es wurde ein SUMMEN-Stack erstellt, der das interessierende Neuron in der mittleren Fluoreszenzintensität des Bereichs enthält, der dem Neuron entspricht, das nach der Hintergrundsubtraktion gemessen wurde. Um die Rhythmizität der Reporterexpression zu bestimmen, wurden sowohl die Spektralanalyse der maximalen Entropie als auch die manuelle Inspektion verwendet. Als nächstes wurden Larven des gleichen Genotyps entweder eine Stunde nach der subjektiven Morgendämmerung oder eine Stunde nach der subjektiven Abenddämmerung seziert.

Die Gehirne wurden innerhalb einer Stunde zweimal abgebildet, um eine Ausgangsbasis zu erhalten. Dann wurde das Kulturmedium mit einer PDF-Datei oder einem Vehikel versehen und die Gehirne wurden sechs Stunden lang stündlich abgebildet. In Gehirnen, die kurz nach Einbruch der Dunkelheit entnommen wurden, zeigte das PER-TDT-Expressionsprofil in LNvs einen tageszeitabhängigen Anstieg der Fluoreszenzintensität nach PDF-Addition.

Dies geschah auch bei den DN1 und in geringerem Maße bei den DN2. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Ex-vivo-Gehirnkulturen aus Drosophila-Larven mit einer 3D-Matrix aus Fibrin herstellt. Einmal gemeistert, dauert das gesamte Verfahren etwa 30 Minuten, von der Präparierung bis zum Einbetten.

Bevor Sie mit den Dissektionen beginnen, bereiten Sie die Bildgebung vor, damit das Gehirn sofort nach der Einbettung abgebildet werden kann. Nach diesem Verfahren können auch adulte Drosophila-Gehirne für die Fluoreszenz-Zeitraffer-Bildgebung kultiviert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.