Native Chromatin Immunopräzipitation mit Murine Gehirn Tumor Neurosphären

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Anreicherung von Histonmarkierungen an einer bestimmten genomischen Stelle zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, z. B. wie sich Mutationen in epigenetischen Regulatoren, die Histonmodifikationen verändern, auf das Transkriptom von Tumorzellen auswirken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zellen nicht vernetzt sind, so dass sie sich in einem natürlicheren Zustand befinden, was die Antikörperspezifität unterstützen kann.

Beginnen Sie damit, den experimentell induzierten Tumor aus dem Gehirn einer Maus in einer 10 Zentimeter großen Petrischale zu präparieren. Wenn der Tumor ein fluoreszierendes Protein exprimiert, visualisieren Sie den Tumor durch ein Fluoreszenzpräpariermikroskop, das auf den entsprechenden Fluoreszenzkanal in 0,3-facher Vergrößerung eingestellt ist. Trennen Sie das Tumorgewebe mit einem Skalpell und einer Pinzette vom normalen Gehirn und zerkleinern Sie den Tumor in der Petrischale in kleine Stücke.

Übertragen Sie den präparierten Tumor in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 300 Mikrolitern NSC-Medium und verwenden Sie eine Einwegspritze, um den Tumor sanft zu homogenisieren. Fügen Sie dann einen Milliliter Zellablösungsmedium hinzu und inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geleitet.

Waschen Sie dann das Sieb mit 25 Millilitern NSC-Medium und zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300-fachem G. Nach dem Dekantieren des Überstands wird das Pellet in sechs Millilitern NSC-Medium wieder suspendiert und die Tumorzellsuspension in einen T25-Kulturkolben überführt. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator mit einer Atmosphäre von 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid, bis Neurosphären gebildet sind.

Sobald die Neurosphären geerntet sind, zentrifugieren Sie eins mal 10 auf die sechs Neurosphärenzellen pro Aminofällung bei 300 mal G für fünf Minuten. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand dekantiert und das Neurosphärenpellet in einem Milliliter balancierter Salzlösung wieder suspendiert. Übertragen Sie die Suspension in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung und zentrifugieren Sie dann wie zuvor.

Als nächstes wird der Überstand dekantiert und das Zellpellet in 95 Mikrolitern Verdauungspuffer resuspendiert, ergänzt um eins bis 100 mit Proteaseinhibitor-Cocktail pro einmal 10 der sechs Zellen. Pipettieren Sie die Zellen sofort auf und ab, um ein Verklumpen zu vermeiden und Blasenbildung zu vermeiden. Mischen Sie dann fünf Mikroliter 0,1-fache Mikrokokken-Nuklease in 145 Mikroliter Verdauungspuffer und fügen Sie den sechs Zellen fünf Mikroliter verdünnte Mikrokokken-Nuklease pro mal 10 hinzu.

Schnippen Sie die Tube zum Mischen und legen Sie sie genau 12 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius heißen Block. Der Mikrokokken-Nuklease-Verdau zur Fragmentierung des Chromatins ist der kritischste Schritt. Die richtige Chromatinfragmentierung ist wichtig, um eine hohe Auflösung für ChIP zu erreichen.

Um sicherzustellen, dass der Schritt erfolgreich ist, inkubieren Sie mehrere Proben nacheinander, um sicherzustellen, dass es nicht zu einer Überverdauung kommt. Geben Sie nach 12 Minuten 10 Mikroliter 10X Mikrokokken-Nuklease-Stopppuffer pro einmal 10 zu den sechs Zellen. Ab diesem Zeitpunkt müssen die Proben auf Eis aufbewahrt werden.

Die Bioanalyseanalyse der verdauten Mikrokokken-Nuklease-Probe zeigt, dass der größte Teil der DNA in Mono-, Di- und Tri-Nukleosomen fragmentiert wurde. Als nächstes fügen Sie den sechs Zellen 110 Mikroliter 2X Ripa-Puffer hinzu, der um eins bis 100 mit Proteaseinhibitor-Cocktail ergänzt wird. Schnippen Sie das Röhrchen zum Mischen, zentrifugieren Sie dann 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius in 1700 mal G. Übertragen Sie den Überstand, der das Chromatin enthält, in ein normales 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es auf Eis.

Verwenden Sie Ripa-Puffer, der mit Proteaseinhibitoren in einer Höhe von eins bis 1000 ergänzt ist, um das Chromatin zu verdünnen, so dass jedes IP ein Volumen von 100 bis 200 Mikrolitern hat. Entfernen Sie dann ein Aliquot, das 10 % des ChIP-Volumens als Eingabe-Sample entspricht. Bereiten Sie die Eingabe vor, indem Sie 100 Mikroliter TE-Puffer hinzufügen, der mit Proteinase K ergänzt ist, und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius.

Messen Sie nach der Reinigung des Eingangs mit einem PCR-Aufreinigungskit die Konzentration des Eingangs mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer. Notieren Sie die Ergebnisse in einem Notizbuch. Fügen Sie 10 Mikroliter gewaschene Protein-A- und G-Magnetkügelchen pro IP hinzu, die an jeder Probe durchgeführt werden, und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 4 Grad Celsius mit einer Drehung bei 20 U/min.

Legen Sie die Probe auf einen Magnethalter, lassen Sie die Kügelchen sich trennen und übertragen Sie dann das erforderliche Volumen in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie den gewünschten Antikörper in jedes Röhrchen und umwickeln Sie die Kappen mit Kunststoffparaffinfolie, um eine Verdunstung zu vermeiden. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 Grad Celsius mit Rotation wie zuvor.

Am nächsten Tag drehen Sie die Röhrchen 10 Sekunden lang bei 2000 mal G, fügen Sie dann 10 Mikroliter Kügelchen zu jedem IP hinzu und inkubieren Sie 3 Stunden lang bei 4 Grad Celsius mit einer Drehung bei 20 U/min. Legen Sie dann die Proben auf einen Magnetständer und lassen Sie die Magnetkügelchen sich trennen. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen, fügen Sie dann 150 Mikroliter Ripa-Puffer mit Proteaseinhibitoren zu jedem IP hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 20 U/min.

Legen Sie die Proben nach der Inkubationszeit auf einen Magnetständer und lassen Sie die magnetischen Kügelchen sich trennen. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen, fügen Sie dann 150 Mikroliter Lithiumchloridpuffer hinzu, der mit Proteaseinhibitoren in niedriger Konzentration ergänzt ist, zu jedem IP und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit einer Drehung bei 20 U/min. Legen Sie die Proben nach der Inkubationszeit auf einen Magnetständer und lassen Sie die magnetischen Kügelchen sich trennen, dann verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen.

Geben Sie dann 150 Mikroliter kaltes TE ohne Proteaseinhibitoren zu den Kügelchen und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit einer Rotation bei 20 U/min. Nach dem letzten Waschschritt wird die Probe in 100 Mikrolitern TE-Puffer, ergänzt mit der Endkonzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter Proteinase K, erneut suspendiert und eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius inkubiert. Zum Schluss reinigen Sie die aminogefällte DNA mit einem PCR-Aufreinigungskit.

Um zu überprüfen, ob die IP erfolgreich ist, führen Sie dann eine qPCR mit Primern durch, die auf positive und negative Kontrollregionen abzielen. Die qPCR wurde mit IGG-ChIP-DNA, Histon-3-Lycen-4-trimethylierter ChIP-DNA und Histon-3-Lyzen-27-thrimethylierter ChIP-DNA durchgeführt, wobei Primer für Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase verwendet wurden. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass Gapdh, ein Housekeeping-Gen, nur mit der H3K4me3-Modifikation angereichert ist, die mit aktiver Transkription assoziiert ist, und nicht mit der H3K27me3-Modifikation, die mit unterdrücktem Chromatin assoziiert ist.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie ChIP-C durchgeführt werden, um Veränderungen der Histonmarkierungen genomweit zu identifizieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie natives ChIP in Neurosphären durchführen können, um die Histonmarkierung an bestimmten Genstellen zu identifizieren.