Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieser Photokonversionstechnik ist es, einzelne Zellen in einem einzelnen Tier von anderen fluoreszierenden Zellpopulationen zu unterscheiden. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Entwicklungsfragen in diesem Bereich zu beantworten und ermöglicht es uns, die Migration einzelner Zellen im Laufe der Zeit zu visualisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie minimalinvasiv ist und zur Markierung einzelner Zellen oder größerer Populationen verwendet werden kann.

Darüber hinaus kann der Benutzer den spezifischen Interessenbereich auswählen und das gewünschte Ziel in Fotos konvertieren. Nach der Paarung von männlichen und weiblichen transgenen Zebrafischen, die ein photokonvertierbares Protein exprimieren und die Eier gemäß dem Textprotokoll sammeln, verwenden Sie ein Präpariermikroskop mit einer 488-Nanometer-Lichtquelle und GFP-Filtersets, um 24 HPF-Embryonen zu screenen. Dechorionieren Sie die Embryonen mit einer Nadel oder Pinzette manuell.

Bereiten Sie fünf Milliliter Agaroselösung mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 0,8 % in der Mikrowelle zu. Sobald die Agarose abgekühlt ist, legen Sie drei bis vier anästhesierte transgene sox10 eos positive 48 hpf Fische in die Mitte einer zehn Millimeter dick dicken Petrischale mit Deckboden. Fügen Sie etwa einen Millimeter oder so viel Agarose hinzu, dass die Oberfläche des Deckglases bedeckt ist.

Ordnen Sie dann den Fisch mit einer Sondennadel auf die Seite und passen Sie ihn nach Bedarf an, während die Agarose fest wird, was etwa zwei Minuten dauert. Nachdem die Agarose zwei Minuten lang erstarrt ist, geben Sie langsam Embryomedium mit 0,02 % Aminobenzoesäureester Tricain in die Schale, bis die Unterseite des Agars und der Schale untergetaucht ist. Um die konfokale Mikroskopie durchzuführen, öffnen Sie die konfokale Software und wählen Sie das Aufnahme- und Fokusfenster aus.

Um ein Imaging vor der Konvertierung durchzuführen, wählen Sie im Erfassungsfenster und auf der Dropdown-Registerkarte für die Erfassungseinstellungen die Imaging-Parameter aus. Hier wird die laborspezifische Stack-Einstellung als Fischbildgebung bezeichnet. Legen Sie die Probe auf das Konfokalmikroskop und verwenden Sie die Grob- und Feineinstellknöpfe, um sie in den Fokus zu bringen.

Öffnen Sie dann das Fokusfenster, und suchen Sie die gewünschte Region, z. B. das Spinalganglion. Wählen Sie im Menü "Filtereinstellung" den Laser c488 aus, stellen Sie die Belichtung auf 300 Millisekunden, die Laserleistung auf fünf und die Intensivierung auf 75 Millisekunden ein. Aktivieren Sie anschließend im Abschnitt Aufnahmetyp das Kontrollkästchen 3D.

Wählen Sie im Abschnitt 3D-Erfassung die Option Aktuelle Position verwenden aus, und überprüfen Sie den Bereich um die aktuelle. Legen Sie im selben Abschnitt den Bereich auf 35, die Anzahl der Ebenen auf 36 und die Schrittweite auf eins fest. Wählen Sie den aktuellen Speicherort aus und klicken Sie dann unten im Aufnahmefenster auf Start, um ein Bild aufzunehmen.

Achten Sie vor dem Fotoumwandlungsprozess darauf, die Laserparameter doppelt und dreifach zu überprüfen. Manchmal ist es notwendig, die Konvertierungseinstellungen neu anzupassen, wenn das Konvertierungsfenster geöffnet ist. Wählen Sie im Erfassungsfenster auf der Dropdown-Registerkarte für die Einstellung des Aufnahmefensters die laborspezifische Einstellung für die Konvertierungsbildgebung aus.

Hier heißt die laborspezifische Einstellung "Fish ablate Full Chip". Wählen Sie im Filtermenü die Laser c488 und c541 aus. Stellen Sie die Belichtungszeiten auf 300 Millisekunden, die Laserleistung auf fünf und die Intensivierung auf 75 Millisekunden ein, wodurch ein ausreichendes Fluoreszenzsignal erzeugt wird, ohne Photobleiche oder Toxizität zu verursachen.

Klicken Sie im Fokusfenster auf die Registerkarte Fotomanipulation, ändern Sie die Laserstack-Leistung auf zwei und klicken Sie dann auf Los. Ändern Sie die Raster-Blockgröße in eins, und klicken Sie auf Festlegen. Ändern Sie dann die Doppelklickgröße auf vier und die Laserlinie auf v405.

Öffnen Sie anschließend im Aufnahmefenster die erweiterten Aufnahmeeinstellungen. Wählen Sie die Registerkarte "Fotomanipulation" aus, ändern Sie die Doppelklick-Wiederholungen in zwei und klicken Sie dann auf "OK". Wählen Sie die Registerkarte xy im Fokusfenster aus.

Überprüfen Sie auf der Registerkarte Fotomanipulation die Laserparameter. Legen Sie dann die Lasereinstellungen so fest, dass die gewünschte Zelle photokonvertiert wird, ohne dass die umgebenden Zellen photokonvertiert werden. Aktivieren Sie unter Aufnahmetyp das Kontrollkästchen Zeitraffer und klicken Sie dann auf Start.

Sobald sich das Live-Zeitrafferfenster öffnet, wählen Sie das Kreiswerkzeug in der oberen Symbolleiste aus. Zeichnen Sie einen Kreis in der Mitte der Zelle, klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf den gezeichneten Kreis, wählen Sie FRAP-Bereich aus, und warten Sie drei Sekunden. Der ausgewählte Bereich sollte dunkler werden, wenn er auf Aufnahme stoppen klickt.

Wenn Sie mehr als ein Tier fotografieren, gehen Sie zurück zur Registerkarte xy im Fokusmenü und wählen Sie Position zwei. Wiederholen Sie dann die Fotokonvertierung. Um eine Population von Zellen umzuwandeln, befolgen Sie das Protokoll und die Laserperameter, indem Sie das Zeitrafferfenster öffnen.

Anstatt nun einen Kreis zu zeichnen, um den Interessenbereich zu FRAPEN, verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie auf dem Interessenbereich zu zeichnen. Führen Sie dann die FRAP für den Bereich mit den gleichen Parametern aus, die gerade demonstriert wurden. Nachdem alle Punkte fotokonvertiert wurden, wählen Sie auf der Dropdown-Registerkarte "Aufzeichnungseinstellung" im Erfassungsfenster die labspezifische Standardstapeleinstellung aus, die weiter oben in diesem Video beschrieben wurde.

Wählen Sie den Laser c488 aus und stellen Sie die Belichtung auf 300 Millisekunden, die Laserleistung auf fünf und die Intensivierung auf 75 Millisekunden ein. Wählen Sie den Laser c541 aus und stellen Sie die Belichtung auf 500 Millisekunden, die Laserleistung auf zehn und die Intensivierung auf 75 Millisekunden ein. Aktivieren Sie im Abschnitt Aufnahmetyp das Kontrollkästchen 3D.

Wählen Sie im Abschnitt 3D-Erfassung die Option Aktuelle Position verwenden aus, und überprüfen Sie den Bereich um die aktuelle. Legen Sie im selben Abschnitt den Bereich auf 35, die Anzahl der Ebenen auf 36 und die Schrittweite auf eins fest. Die Bereichszahl kann sich vergrößern oder verringern, um die gewünschte Bildtiefe zu erreichen.

Wenn auf der Registerkarte "xy-Fokus" Mehrfachpunkte vorhanden sind, wählen Sie im Aufnahmefenster die Option "Mehrpunktliste" aus. Wenn nicht, wählen Sie den aktuellen Standort aus. Klicken Sie abschließend am unteren Rand des Aufnahmefensters auf Start, um ein Bild aufzunehmen.

Diese Panels zeigen eine einzelne Präphoto-Konversionszelle in einem Ganglion eines transgenen Zebrafisches, die das photokonvertierbare EOS-Protein exprimiert, unter Kontrolle der sox10-regulatorischen Sequenz. Nach der Photokonversion war eos deutlich innerhalb des interessierenden Bereichs vorhanden, während keine benachbarten Zellen markiert wurden. Um den Nutzen dieser Photokonversionstechnik zu demonstrieren, wurde eine Population von Zellen auf der ventralen Seite des Rückenmarks mit Hilfe einer Linie UV-Licht ausgesetzt.

Anschließend wurden Bilder aufgenommen, die das photokonvertierte eos-Protein im Bereich der Linie zeigten. In allen anderen Bereichen war das nicht photokonvertierte EOS-Protein sichtbar. Einige Stunden nach der Photokonversion wurden identische Bilder aufgenommen, die photokonvertierte EOS-positive Zellen zeigten, die über die gesamte Rückenmarksregion verstreut waren, sowohl an dorsalen als auch an ventralen Stellen.

Dieser Befund stimmt mit der Hypothese überein, dass ventrale Spinalzellen in dorsale Lagen umgesiedelt wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 bis 45 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, denken Sie daran, ein Bild nach der Konvertierung aufzunehmen, um zu bestätigen, dass in Ihrer Region of Interest eine Fotokonversion aufgetreten ist.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie z.B. Zeitraffer-Bildgebung durchgeführt werden, um die zelluläre Migration und Dynamik im Laufe der Zeit zu beobachten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne Zellen innerhalb einer fluoreszierenden Zellpopulation unterscheidet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ultraviolettem Licht äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.

Starren Sie zum Beispiel niemals direkt ins Licht.