Name: Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Lernen Sie die Photokonvertierungstechnik zur Unterscheidung einzelner Zellen in lebenden Zebrafischen. Diese minimal-invasive Methode ermöglicht die Visualisierung von Zellmigration und liefert Einblicke in Entwicklungsprozesse.

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Wir danken Bernard Kulemaka und Mitglieder des Smith-Lab für ihre hilfreichen Kommentare und Reagenz Beratung, Sam Connell und Brent Redford von 3i für fielding Bildgebung Fragen und Deborah Bang, Karen Heed und Kay Stewart für Zebrafisch Pflege. Diese Arbeit wurde von der University of Notre Dame, die Elisabeth und Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der University of Notre und Zentrum von Stammzellen und Regenerationsmedizin an der University of Notre unterstützt. Dame. Alle tierexperimentellen Studien erfolgten in Übereinstimmung mit der University of Notre Dame IACUC Dr. Cody Smith.

Alle Tierversuche wurden von der University of Notre Dame institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung der Zebrafisch-Probe
<ol><li>Legen Sie einen erwachsenen Mann und einem Erwachsenen weiblichen Tg (Cabrio Protein) in einer Paarung Kammer pro Standardverfahren13. Verwenden Sie in diesem Manuskript Tg(sox10:eos) Fisch9 wegen Zugang aber andere transgenen Linien mit Photoconvertible Protein gleichermaßen genutzt werden kann. Richten Sie mehr als eine Kammer für den Fall, dass Fische nicht verlegen zu tun. Lassen Sie die Fische über Nacht in der Kammer verbleiben.</li>
	<li>Sammeln Sie am nächsten Morgen Eiern in 100 mm Petrischalen. Eiern bis zu 24 h nach Befruchtung (hpf) Reifen vor dem Screening zu ermöglichen.</li>
	<li>Wenn Tiere oben heterozygot für das Transgen waren, Filtersätze Bildschirm 24 hpf Gerichte für Tg(sox10:eos) + Embryonen mit 488 nm Lichtquelle und GLP auf dem sezierenden Mikroskop. Tg(sox10:eos) + Embryonen zu isolieren und zu 48 Reifen erlauben hpf.</li>
	<li>Dechorionate Embryonen manuell mit einer Nadel oder Pinzette.</li>
	<li>Bereiten Sie und Mikrowellen Sie-5 mL 0,8 % niedrig schmelzende Punkt Agarose-Lösung.<ol>
<li>Sobald Agarose kühl anfühlen wird, legen Sie 3-4 narkotisierten Tg (Sox10:eos) + 48 hpf Fisch in der Mitte von einem 10 mm Glas-Deckgläschen unten Petrischale.</li>
		<li>Fügen Sie genügend Agarose bedecken die Oberfläche des Deckglases, etwa 1 mL. Verwenden Sie eine Sonde Nadel, um Fisch auf ihren Seiten zu arrangieren. Lassen Sie Agarose zu festigen, um die Montage der Tiere zu gewährleisten. Es möglicherweise notwendig, ständig der Zebrabärbling neu zu ordnen, bis der Agar14erstarrt. Erstarrung dauert ca. 2 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem die Agarose für 2 min erstarrt ist, fügen Sie langsam Embryo Medium mit 0,02 % Aminobenzoic Acid Ester (Tricaine), Schüssel, bis die Bodenfläche des Agar und Gericht untergetaucht ist. Dies sollte etwa 3 mL.</li>
</ol>2. Mikroskop Montage und unkonvertierte Imaging
<ol><li>Öffnen Sie konfokale Software und wählen Sie die Erfassung und Fokus-Fenster [Abb. 1]. Wählen Sie unter das Aufnahmefenster imaging Lab-spezifische Konvertierungseinstellung unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte [Abb. 1] einstellen. Hier wird die Lab-spezifische Einstellung genannt "Imaging-Fisch."</li>
	<li>Probe auf konfokalen Umfang und bringen in den Fokus mit Kurs und Feineinstellung Knöpfe.</li>
	<li>Öffnen Sie das Fenster und suchen Sie die gewünschte Region von Interesse (d.h. Dorsal Root Ganglien).</li>
	<li>Wählen Sie die c488 Laser im Menü Filter setzen. Stellen Sie die Belichtung auf 300 ms, Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2].</li>
	<li>Kontrollkästchen Sie das 3D im Abschnitt Typ zu erfassen . Wählen Sie im Bereich 3D Capture aktuelle Position und überprüfen Sie Bereich um Stromzu. Legen Sie in diesem Abschnitt den Bereich bis 35, die Zahl der Flugzeuge bis 36 und die Schrittweite auf 1. Das Angebot kann erhöht oder verringert, um Platz für die Tiefe der imaging-Bereich. Für das Rückenmark ist ein Wert zwischen 35-40 Stapeln in der Regel ausreichend [Abb. 5].</li>
	<li>Wählen Sie aktuelle Position [Abb. 5].</li>
	<li>Klicken Sie auf Start am unteren Rand des Aufnahmefensters Bild zu erwerben.</li>
</ol>3. Single-Cell Ladungszustand
<ol><li>Öffnen Sie konfokale Software und wählen Sie die Erfassung und Fokus-Fenster [Abb. 1]. Wählen Sie unter das Aufnahmefenster imaging Lab-spezifische Konvertierungseinstellung unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte [Abb. 1] einstellen. Hier nennt man die Lab-spezifische Einstellung "Fisch Abtragen vollen Chip."</li>
	<li>Wählen Sie die c488 und c541 Laser im Menü Filter setzen. Wenn nicht die gleiche Mikroskop-Software verwenden, finden Sie das Menü, verschiedene Laser und wählen Sie die 488 nm und 541 nm Laser auszuwählen. Die Belichtungen auf 300 ms eingestellt, Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2]. Diese Lasereinstellungen werden auf die Produktion von genügend Fluoreszenzsignal ohne Immunofluoreszenz oder Toxizität ausgewählt. Wenn Toxizität oder Immunofluoreszenz visualisiert wird, reduzieren Sie Laserleistung oder Belichtung.</li>
	<li>Öffnen Sie das Fenster und klicken Sie auf die Registerkarte "Photomanipulation" im Fenster "Fokus". Laserparameter entsprechend anpassen. Ändern Sie die Laserleistung Stack auf 2, und klicken Sie dann auf Go. Ändern Sie die Raster-Blockgröße auf 1 und klicken Sie auf festlegen. Ändern Sie doppelklicken Sie auf 4. Ändern Sie die Laserlinie auf v405 [Abb. 3].</li>
	<li>Öffnen Sie die erweiterten Einstellungen im Fenster "Aufnahme". Wählen Sie die Registerkarte "Photomanipulation" und ändern Sie die Doppelklick-Wiederholungen in 2. Klicken Sie auf "OK" [Abb. 4].</li>
	<li>Wählen Sie die Registerkarte "XY" im Fenster "Fokus". Überprüfen Sie die Laserparameter aus Schritt 2 im Register Fotomanipulation [Abbildung 3, Abbildung 4]. Photoconvert die Zelle ohne Ladungszustand der umgebenden Zellen Lasereinstellungen gesetzt.<ol>
<li>Wenn Ladungszustand benachbarter Zellen vorhanden ist, reduzieren Sie Laserleistung. Wenn Ladungszustand der Zellen nicht auftritt, können Laserleistungen erhöht werden. Laserleistung soll optimal, Photoconvert nur die Region von Interesse und nicht die Umgebung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Kontrollkästchen Sie Timelapse unter Typ zu erfassen. Klicken Sie auf [Abbildung 6A] starten .</li>
	<li>Sobald das live Zeitraffer-Fenster öffnet, wählen Sie das Werkzeug Kreis in der oberen Symbolleiste [Abb. 7]</li>
	<li>Zeichnen Sie einen Kreis, in welcher Region der Zelle. Rechtsklick den gezeichneten Kreis, FRAP Regionauswählen, und warten Sie 3 Sekunden. Der ausgewählte Bereich sollte dimmer werden [Abb. 8]. Klicken Sie auf Aufzeichnung beenden.</li>
	<li>Wenn mehr als ein Tier imaging, gehen Sie auf die Registerkarte "XY" im Fokus-Menü und wählen Sie Position 2 zurück. Wiederholen Sie Schritte 4.1-4.6.</li>
	<li>Um eine Population von Zellen zu konvertieren, folgen Sie dem Protokoll und Laser Parameter für Schritte 4.1-4.4 außer statt Zeichnen eines Kreises des Interessenbereichs FRAP, verwenden Sie das Linienwerkzeug. Zeichnen Sie eine Linie auf die Region des Interesses und die Region mit den gleichen Parametern, die oben aufgeführten FRAP.</li>
</ol>4. Post-Ladungszustand Imaging
<ol><li>Nachdem alle Punkte Photoconverted sind. Wählen Sie die Labor-spezifischen standard Bildstapel Einstellung in der Precoversion imaging Schritt 3 beschrieben. Dies finden Sie unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte im Fenster "Aufnahme" [Abb. 5] einstellen.</li>
	<li>Wählen Sie die c488 Laser und stellen Sie die Belichtung auf 300ms Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2].</li>
	<li>Wählen Sie die c541 Laser finden Sie unter das gleiche Menü wie die c488 Laser. Stellen Sie die Belichtung auf 500 ms, Laserleistung bis 10 und bis 75 [Abb. 9] verstärken.</li>
	<li>Kontrollkästchen Sie das 3D im Abschnitt Typ zu erfassen . Wählen Sie im Bereich 3D Capture aktuelle Position und überprüfen Sie Bereich um Strom zu. Legen Sie in diesem Abschnitt den Bereich bis 35, die Zahl der Flugzeuge bis 36 und die Schrittweite auf 1. Die Palette-Anzahl kann erhöhen oder verringern um die gewünschte bildgebenden Tiefe [Abb. 5] unterzubringen.</li>
	<li>In der Registerkarte "XY-Fokus" gibt es mehrere Punkte, die multipoint Liste Option im Fenster "Aufnahme". Wenn dies nicht der Fall ist, wählen Sie aktuelle Position.</li>
	<li>Klicken Sie auf Start am unteren Rand des Aufnahmefensters Bild zu erwerben.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
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<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
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<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
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<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In komplexen Gewebe organisieren verschiedene Zelltypen in bestimmten Domänen. Vor kurzem wurden Techniken zur Bezeichnung einzelner Zellen innerhalb dieser großen Gewebe Strukturen1,2,3genutzt. Hier zeigen wir zwei Techniken, die in ähnlicher Weise genutzt werden können, um einzelne Zelle Interaktionen und Zelle Bevölkerung Wechselwirkungen in komplexen Gewebe sichtbar zu machen. Der Vorteil der Ladungszustand Technik ist die r...

Mehrere unterschiedliche Zellen interagieren, um aufzubauen und zu pflegen komplexe tierischen und pflanzlichen Geweben. Diese Zellen sind oft eingefügten und schwer zu unterscheiden von Nachbarn auf eine einzelne Zellenebene ohne Hochauflösende Mikroskopie, die Fixierung des Gewebes erfordern. Zu verstehen, wie diese Gewebe bilden, sind gepflegt und werden krank, es war jedoch wichtig, zu untersuchen, wie einzelne Zellen im Gewebe sind im Laufe der Zeit interagieren. Idealerweise benötigen diese Experimente die Kennzeichnung einzelner Zellen innerhalb eines Gewebes in einer nicht-invasive Weise ohne das Erfordernis einer Fixierung. Wissenschaftler haben jetzt zahlreiche Techniken, um diese Aufgabe1,2,3,4zu erreichen entwickelt.
Die Entdeckung und Umsetzung von Quallen grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde ein spannender Ansatz, der für die Kennzeichnung von verschiedenen Zellen in einem Gewebe Umwelt1erlaubt. Mit zellspezifische Promotoren, ist es möglich, eine Teilmenge von Zellen genetisch zu wählen, die1bezeichnet werden. Alternativ kann virale induzierte Expression von GFP vom Benutzer ausgewählte Ausdruck der GFP3,4einsetzbar. Obwohl ziemlich nützlich, erlaubt vermittelten Genexpression der GLP nicht vom Benutzer ausgewählte Ausdruck in einer Teilmenge von Zellen im Gewebe; und virale Ausdruck der GFP, zwar vorteilhaft, kann invasive. Mit dem Aufkommen von GFP-Derivaten und clevere Techniken wie Brainbow verschiedene fluoreszierende Proteine mehr spärlich in den Geweben zum Ausdruck zu bringen ist es möglich, einzelne Zellen und die Interaktionen zwischen ihnen in komplexen Gewebe2, zu visualisieren geworden. 5. jedoch diese Ansätze Zellen in einer zufälligen beschriften. Wenn das gewünschte Experiment erfordert Visualisierung einer einzelnen Zelle oder Population von Zellen, die durch den Versuchsleiter definiert ist, sind sie daher beschränkt. Mit solchen Experimenten wäre es vorteilhaft, ein genetisch ausgedrückt fluoreszierendes Protein zu haben, die manipuliert werden können, um in eine einzelne Zelle Art und Weise unterscheiden es von anderen Leuchtstofflampen und nicht fluoreszierenden Zellen.
Um dieses Ziel zu erreichen und die Zellbiologie einzelner Zellen innerhalb einer komplexen lebendes Gewebe zu visualisieren, nutzt die wissenschaftliche Gemeinschaft Einzelzelle Ladungszustand verschiedene fluoreszierende Proteine6,7,8. Mit genetisch kontrolliert Ausdruck eines Photoconvertible Proteins (z.B. Eos, Kaede, etc.), die Übergänge von Grün auf rot fluoreszierenden UV ausgesetzt (488 nm) Licht, können wir eine einzelne Zelle unterscheiden, von seiner Eindringmittel beschrifteten Nachbarn6,7,8. Dieser Ansatz nutzt eine Vorrichtung an unsere confocal Mikroskop das Licht von einem Laser-Stapel zu einer Beugung begrenzte Region of Interest kann direkt angeschlossen. Mit dieser Technik können wir entweder einzelne Zellen oder größere Populationen in einem frei definierbaren Weise9,10,11beschriften. Die Technik ist minimal-invasiv im Vergleich zu einzelnen Zelle Injektionen von viralen GFP. Als ein Proof of Concept zeigen wir, dass wir Photoconvert einzelner Zellen in ein Ganglion im peripheren Nervensystem und Photoconvert größere Populationen wie Zellen befindet sich auf der Bauchseite des Rückenmarks9,10können, 11,12. Wir können diese Photoconverted-Zell-Populationen 24 h später dann visualisieren, um Einblick in ihre Bewegung und Differenzierung während der Entwicklung.

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10:eos) Zebrafisch-Tiere</td><td></td><td></td><td>Fische wurden aus der Fischanlage der University of Notre Dame entnommen und gekreuzt</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petrischale</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Embryo-Medium</td><td></td><td></td><td>Das Embryomedium wird wöchentlich hergestellt und von der Fischanlage an der University of Notre Dame zur Verfügung gestellt, das 5 l RO-Wasser, 30 μl Methylenblau und 200 ml Salzfond enthält.</td></tr><tr><td>0,8 % niedriger Schmelzpunkt Agarose</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Glasdeckglas Boden Petrischale</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>Nadel-Präpariersonde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,002% 3-Aminobenzoesäureester (Tricain)</td><td>Fluka analytical</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Präpariermikroskop mit GFP-Filtern</td><td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop mit Lasern zur Anregung von GFP und RFP Filtersets</td><td>3i Spinning-Disk konfokal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Lichtquelle (Laser) für die Photokonversion</td><td>405 nm Laser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diabuch-Software</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einzellige ladungszustand im lebendigen intakten zebrafisch

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Tierischen und pflanzlichen Gewebe besteht aus unterschiedlichen Populationen von Zellen. Diese Zellen interagieren im Laufe der Zeit zum Aufbau und Erhalt des Gewebes und können verursachen Krankheit wenn gestört. Wissenschaftler haben clevere Techniken um Eigenschaften und natürliche Dynamik dieser Zellen innerhalb von intaktem Gewebe zu untersuchen, zum Ausdruck bringen, fluoreszierende Proteine in Teilmengen von Zellen entwickelt. Jedoch erfordern manchmal Experimente mehr ausgewählten Visualisierung von Zellen im Gewebe, manchmal auf die einzelne Zelle oder Bevölkerung der Zellen Art und Weise. Um dies zu erreichen und Einzelzellen innerhalb einer Bevölkerung der Zellen zu visualisieren, haben Wissenschaftler einzellige Ladungszustand der fluoreszierende Proteine genutzt. Um diese Technik zu demonstrieren, zeigen wir hier wie UV-Licht auf eine Eos exprimierenden Zelle des Interesses an einem intakten, direkte Leben Zebrafisch. Wir Bild dann diese Photoconverted Eos+ Zellen 24 h später um festzustellen, wie sie im Gewebe verändert. Wir beschreiben zwei Techniken: einzelne Zelle Ladungszustand und Photoconversions der Bevölkerung der Zelle. Diese Techniken können verwendet werden, zu visualisieren, Zell-Zell-Interaktionen, Zelle-Schicksal und Differenzierung und Zelle Migrationen, so dass es eine Technik, die in zahlreichen biologischen Fragestellungen anwendbar ist.

Ladungszustand der fluoreszierenden Proteinen kann verwendet werden, um verschiedene Zellen in einem Gewebe6beschriften. Um dies zu demonstrieren, wurden Tg(sox10:eos) Fisch9 verwendet, um das Photoconvertible Protein Eos unter die regulatorischen Sequenzen des sox10. Die Tg(sox10:eos) Tiere bei 48 hpf waren zunächst montiert, und dann ein Image erstellt um eine unspezifische Ladungszustand erkennen, die möglicherw...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um zu zeigen, wie die Zelle Ladungszustand durch UV-Einwirkung auf bestimmte Bereiche, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Proteins, Eos, in lebenden Tieren erreicht wird.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Das übergeordnete Ziel dieser Photokonversionstechnik ist es, einzelne Zellen in einem einzelnen Tier von anderen fluoreszierenden Zellpopulationen zu unterscheiden. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Entwicklungsfragen in diesem Bereich zu beantworten und ermöglicht es uns, die Migration einzelner Zellen im Laufe der Zeit zu visualisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie minimalinvasiv ist und zur Markierung einzelner Zellen oder größerer Populationen verwendet werden kann.Darüber hinaus kann der Benutzer den spezifischen Interessenbereich auswählen und das gewünschte Ziel in Fotos konvertieren. Nach der Paarung von männlichen und weiblichen transgenen Zebrafischen, die ein photokonvertierbares Protein exprimieren und die Eier gemäß dem Textprotokoll sammeln, verwenden Sie ein Präpariermikroskop mit einer 488-Nanometer-Lichtquelle und GFP-Filtersets, um 24 HPF-Embryonen zu screenen. Dechorionieren Sie die Embryonen mit einer Nadel oder Pinzette manuell.Bereiten Sie fünf Milliliter Agaroselösung mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 0,8 % in der Mikrowelle zu. Sobald die Agarose abgekühlt ist, legen Sie drei bis vier anästhesierte transgene sox10 eos positive 48 hpf Fische in die Mitte einer zehn Millimeter dick dicken Petrischale mit Deckboden. Fügen Sie etwa einen Millimeter oder so viel Agarose hinzu, dass die Oberfläche des Deckglases bedeckt ist.Ordnen Sie dann den Fisch mit einer Sondennadel auf die Seite und passen Sie ihn nach Bedarf an, während die Agarose fest wird, was etwa zwei Minuten dauert. Nachdem die Agarose zwei Minuten lang erstarrt ist, geben Sie langsam Embryomedium mit 0,02 % Aminobenzoesäureester Tricain in die Schale, bis die Unterseite des Agars und der Schale untergetaucht ist. Um die konfokale Mikroskopie durchzuführen, öffnen Sie die konfokale Software und wählen Sie das Aufnahme- und Fokusfenster aus.Um ein Imaging vor der Konvertierung durchzuführen, wählen Sie im Erfassungsfenster und auf der Dropdown-Registerkarte für die Erfassungseinstellungen die Imaging-Parameter aus. Hier wird die laborspezifische Stack-Einstellung als Fischbildgebung bezeichnet. Legen Sie die Probe auf das Konfokalmikroskop und verwenden Sie die Grob- und Feineinstellknöpfe, um sie in den Fokus zu bringen.Öffnen Sie dann das Fokusfenster, und suchen Sie die gewünschte Region, z. B. das Spinalganglion. Wählen Sie im Menü "Filtereinstellung" den Laser c488 aus, stellen Sie die Belichtung auf 300 Millisekunden, die Laserleistung auf fünf und die Intensivierung auf 75 Millisekunden ein. Aktivieren Sie anschließend im Abschnitt Aufnahmetyp das Kontrollkästchen 3D.Wählen Sie im Abschnitt 3D-Erfassung die Option Aktuelle Position verwenden aus, und überprüfen Sie den Bereich um die aktuelle. Legen Sie im selben Abschnitt den Bereich auf 35, die Anzahl der Ebenen auf 36 und die Schrittweite auf eins fest. Wählen Sie den aktuellen Speicherort aus und klicken Sie dann unten im Aufnahmefenster auf Start, um ein Bild aufzunehmen.Achten Sie vor dem Fotoumwandlungsprozess darauf, die Laserparameter doppelt und dreifach zu überprüfen. Manchmal ist es notwendig, die Konvertierungseinstellungen neu anzupassen, wenn das Konvertierungsfenster geöffnet ist. Wählen Sie im Erfassungsfenster auf der Dropdown-Registerkarte für die Einstellung des Aufnahmefensters die laborspezifische Einstellung für die Konvertierungsbildgebung aus.Hier heißt die laborspezifische Einstellung "Fish ablate Full Chip". Wählen Sie im Filtermenü die Laser c488 und c541 aus. Stellen Sie die Belichtungszeiten auf 300 Millisekunden, die Laserleistung auf fünf und die Intensivierung auf 75 Millisekunden ein, wodurch ein ausreichendes Fluoreszenzsignal erzeugt wird, ohne Photobleiche oder Toxizität zu verursachen.Klicken Sie im Fokusfenster auf die Registerkarte Fotomanipulation, ändern Sie die Laserstack-Leistung auf zwei und klicken Sie dann auf Los. Ändern Sie die Raster-Blockgröße in eins, und klicken Sie auf Festlegen. Ändern Sie dann die Doppelklickgröße auf vier und die Laserlinie auf v405.Öffnen Sie anschließend im Aufnahmefenster die erweiterten Aufnahmeeinstellungen. Wählen Sie die Registerkarte "Fotomanipulation" aus, ändern Sie die Doppelklick-Wiederholungen in zwei und klicken Sie dann auf "OK". Wählen Sie die Registerkarte xy im Fokusfenster aus.Überprüfen Sie auf der Registerkarte Fotomanipulation die Laserparameter. Legen Sie dann die Lasereinstellungen so fest, dass die gewünschte Zelle photokonvertiert wird, ohne dass die umgebenden Zellen photokonvertiert werden. Aktivieren Sie unter Aufnahmetyp das Kontrollkästchen Zeitraffer und klicken Sie dann auf Start.Sobald sich das Live-Zeitrafferfenster öffnet, wählen Sie das Kreiswerkzeug in der oberen Symbolleiste aus. Zeichnen Sie einen Kreis in der Mitte der Zelle, klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf den gezeichneten Kreis, wählen Sie FRAP-Bereich aus, und warten Sie drei Sekunden. Der ausgewählte Bereich sollte dunkler werden, wenn er auf Aufnahme stoppen klickt.Wenn Sie mehr als ein Tier fotografieren, gehen Sie zurück zur Registerkarte xy im Fokusmenü und wählen Sie Position zwei. Wiederholen Sie dann die Fotokonvertierung. Um eine Population von Zellen umzuwandeln, befolgen Sie das Protokoll und die Laserperameter, indem Sie das Zeitrafferfenster öffnen.Anstatt nun einen Kreis zu zeichnen, um den Interessenbereich zu FRAPEN, verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie auf dem Interessenbereich zu zeichnen. Führen Sie dann die FRAP für den Bereich mit den gleichen Parametern aus, die gerade demonstriert wurden. Nachdem alle Punkte fotokonvertiert wurden, wählen Sie auf der Dropdown-Registerkarte "Aufzeichnungseinstellung" im Erfassungsfenster die labspezifische Standardstapeleinstellung aus, die weiter oben in diesem Video beschrieben wurde.Wählen Sie den Laser c488 aus und stellen Sie die Belichtung auf 300 Millisekunden, die Laserleistung auf fünf und die Intensivierung auf 75 Millisekunden ein. Wählen Sie den Laser c541 aus und stellen Sie die Belichtung auf 500 Millisekunden, die Laserleistung auf zehn und die Intensivierung auf 75 Millisekunden ein. Aktivieren Sie im Abschnitt Aufnahmetyp das Kontrollkästchen 3D.Wählen Sie im Abschnitt 3D-Erfassung die Option Aktuelle Position verwenden aus, und überprüfen Sie den Bereich um die aktuelle. Legen Sie im selben Abschnitt den Bereich auf 35, die Anzahl der Ebenen auf 36 und die Schrittweite auf eins fest. Die Bereichszahl kann sich vergrößern oder verringern, um die gewünschte Bildtiefe zu erreichen.Wenn auf der Registerkarte "xy-Fokus" Mehrfachpunkte vorhanden sind, wählen Sie im Aufnahmefenster die Option "Mehrpunktliste" aus. Wenn nicht, wählen Sie den aktuellen Standort aus. Klicken Sie abschließend am unteren Rand des Aufnahmefensters auf Start, um ein Bild aufzunehmen.Diese Panels zeigen eine einzelne Präphoto-Konversionszelle in einem Ganglion eines transgenen Zebrafisches, die das photokonvertierbare EOS-Protein exprimiert, unter Kontrolle der sox10-regulatorischen Sequenz. Nach der Photokonversion war eos deutlich innerhalb des interessierenden Bereichs vorhanden, während keine benachbarten Zellen markiert wurden. Um den Nutzen dieser Photokonversionstechnik zu demonstrieren, wurde eine Population von Zellen auf der ventralen Seite des Rückenmarks mit Hilfe einer Linie UV-Licht ausgesetzt.Anschließend wurden Bilder aufgenommen, die das photokonvertierte eos-Protein im Bereich der Linie zeigten. In allen anderen Bereichen war das nicht photokonvertierte EOS-Protein sichtbar. Einige Stunden nach der Photokonversion wurden identische Bilder aufgenommen, die photokonvertierte EOS-positive Zellen zeigten, die über die gesamte Rückenmarksregion verstreut waren, sowohl an dorsalen als auch an ventralen Stellen.Dieser Befund stimmt mit der Hypothese überein, dass ventrale Spinalzellen in dorsale Lagen umgesiedelt wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 bis 45 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, denken Sie daran, ein Bild nach der Konvertierung aufzunehmen, um zu bestätigen, dass in Ihrer Region of Interest eine Fotokonversion aufgetreten ist.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie z.B. Zeitraffer-Bildgebung durchgeführt werden, um die zelluläre Migration und Dynamik im Laufe der Zeit zu beobachten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne Zellen innerhalb einer fluoreszierenden Zellpopulation unterscheidet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ultraviolettem Licht äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.Starren Sie zum Beispiel niemals direkt ins Licht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht die Steuerung von Photonen niedriger Energie mit tiefen optischen Durchbruch und geringere Phototoxizität. Wir beschreiben den Einsatz dieser Technologie für Live-Cell-Kennzeichnung in Zebrafisch-Embryonen. Dieses Protokoll kann leicht für die Foto-Induktion verschiedener Licht-responsive Moleküle angepasst werden.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu...

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Eine Methode ist beschrieben, um einzelne Zellen mit einem Käfig fluoreszierenden Proteins mit Zwei-Photonen-Absorption aus einer Ti photoaktivieren: Sapphire Femtosekunden-Laser-Oszillator. Um das Schicksal der Karte photoaktivierte Zelle, ist die Immunhistochemie verwendet. Diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

Hier stellen wir eine Methode zur lichtaktivierten Umschaltung von photoveränderbaren fluoreszierenden Proteinen (PCFPs) im lebenden Zebrafischembryo sowie die anschließende Verfolgung des photoveränderten Proteins zu bestimmten Zeitpunkten während der Entwicklung vor. Diese Methodik ermöglicht die Beobachtung zellbiologischer Vorgänge, die verschiedenen Entwicklungsprozessen in einem lebenden Wirbeltierorganismus zugrunde liegen.

Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Dieses Video zeigt die Verfolgung der Leukozytenrekrutierung mit transgenen Zebrafischlarven, die photokonvertierbares grün fluoreszierendes Protein exprimieren. Die Vorinjektion von rot fluoreszierenden Farbstoff-markierten Bakterien in das otische Vesikel und die Induktion der Photokonversion ermöglicht die Beobachtung der Migration, Phagozytose und Ausbreitung von Leukozyten im Körper und liefert wertvolle Einblicke in die Dynamik der Immunantwort.

Photokonversionsbasiertes Leukozyten-Tracking in bakteriell infizierten transgenen Zebrafischen

Die Untersuchung der frühesten Ereignisse präneoplastischen Zellprogression und angeborenen Immunzellinteraktion ist von zentraler Bedeutung, zu verstehen und Behandlung von Krebs. Hier beschreiben wir eine Methode, um bedingt induzieren epithelialen Zelltransformationen und der anschließenden Live-Imaging von angeborenen Immunzellinteraktion mit HRAS G12V exprimierenden Hautzellen im Zebrafisch-Larven.

Live-Imaging von angeborenen Immun und Präkanzeröse Zell-Interaktionen unter Verwendung eines induzierbaren Gal4 / UAS Expression System in Zebrafisch-Larven Haut

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Wir haben das photokonvertierbare PSmOrange-System als leistungsstarkes, unkompliziertes und kostengünstiges Werkzeug für die in vivo Zellverfolgung in GFP-transgenen Hintergründen etabliert. Dieses Protokoll beschreibt seine Anwendung im Zebrafisch-Modellsystem.

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den Ladungszustand Kaede fluoreszierenden Proteins in endokardialen Zellen der lebenden Zebrafischembryo, die es die Verfolgung von endokardialen Zellen während der ventrikulären Kanal und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung ermöglicht .

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

Wir präsentieren Ihnen eine effiziente und einfach zu bedienende Protokoll für die Zubereitung von primären Zellkulturen von Zebrafisch-Embryonen zu Transfektion und live Cell Imaging sowie ein Protokoll Primärzellen von Erwachsenen Zebrafisch Gehirn vorzubereiten.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Lernen Sie die Photokonvertierungstechnik zur Unterscheidung einzelner Zellen in lebenden Zebrafischen. Diese minimal-invasive Methode ermöglicht die Visualisierung von Zellmigration und liefert Einblicke in Entwicklungsprozesse.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

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