Name: In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Lernen Sie Methoden zur Messung der Darmepithelpermeabilität in vitro und in vivo bei Mäusen. Diese Techniken helfen Forschern, Barrieredysfunktionen bei gastrointestinalen Erkrankungen zu untersuchen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Dr. Jerrold R. Turner vom Brigham and Women es Hospital, Harvard Medical School, für seine großzügige Unterstützung bei der Durchführung dieser Studie. Diese Arbeit wird unterstützt von der National Natural Science Foundation von China (Grant-Nummer 81470804, 31401229 und 81200620), der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (Grant-Nummer BK20180838 und BK20140319), The Innovation Forschungsprogramm für College Absolventen der Provinz Jiangsu (Grant-Nummer KYLX16-0116), Advanced Research Projekte der Soochow University (Grant-Nummer SDY2015_06), Morbus Crohn und Colitis Foundation Research Fellowship Award (Gewährungsnummer 310801).

Diese Studie wurde von der Animal Care und Nutzung Protokoll der Cambridge-Suda genomische Resource Center (CAM-SU), Soochow University zugelassen.
1. Beschichtung und Pflege von Caco-2bbe auf porösen Polycarbonat Membranen
<ol><li>Zellen in einem T75 Kolben mit Medien wachsen (DMEM mit 10 % FBS). Flaschen sollten regelmäßig, je nach der Zelldichte gefüttert werden. Hinweis: Für optimale Beschichtung sollte Zellen teilen sich schnell und haben eine flache "gebraten-Ei"-Form, was darauf hindeutet, dass Zellen in der Wachstumsphase sind.</li>
	<li>Sobald Zellen 80 % konfluierende, nehmen Sie die Flasche aus dem Inkubator sind und entfernen Sie das Medium. Spülen Sie alle restlichen Medien mit 1-2 mL sterile PBS (ohne Ca2 +). Pipettieren 1,5 mL Trypsin-EDTA in den Kolben und sanft rocken die Flasche; Legen Sie dann die Flasche in den Inkubator 37 ° C für 20 min ohne Schaukeln.</li>
	<li>Während die Zellen trypsinizing sind, fügt Ort mit porösen Polycarbonat Membranen (Porengröße 0,4 µm; Fläche, 0,33 cm2; siehe Tabelle of Materials) in 24-Well Platten. 1,0 mL Nährmedien in der basalen Kammer (untere Bereich der Membran) hinzugeben.</li>
	<li>Pipettieren 5 mL der Medien in die Flasche und kräftig pipettieren der Zellen gegen die Seite des Kolbens 5-10mal Klumpen, lose, einzelne Zellen oder 2-3 Zelle zu erreichen.</li>
	<li>
Platte 0,166 mL Zellen (Erreichung ein Verdünnungsverhältnis von 1:8) in die apikale Kammer (der obere Raum der Membran). Bis zu 3 Wochen bei 37 ° C inkubieren.
	<ol>
<li>Füttern Sie Zellen dreimal wöchentlich durch sorgfältig Absaugen der Medien aus dem basalen Fach jeder gut mit einer Druckpumpe. Sanft tropft 1 mL der Medien in der apikalen Handelskammer jedes einfügen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Nutzung der epithelialen Meter (Volt/Ohm) zur Messung der TER
Hinweis: Nach ca. 3 Wochen der Kultur auf Polycarbonat-Membranen sind Caco-2BBe Zellen TER messbereit.
<ol><li>Ersetzen Sie für Zytokin Studien einen Tag vor der Messung die basalen Medien mit Medium mit 10 ng/mL IFNγ. Am Tag des Experiments ersetzen Sie die Medien mit HBSS mit 2,5 oder 7,5 ng/mL TNF. Hinweis: IFNγ Behandlung erhöht die Expression von TNF-Rezeptor 2 (TNFR2)16.</li>
	<li>Um das Messgerät zu beheben, legen Sie die Korrektur-Elektrode in die Input-Port, und wählen Sie "Ohm"-Modus. Verstellen Sie die R Adj-Schraube mit einem Schraubenzieher, bis das Messgerät eine Lesung von 1.000 Ω zeigt.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Elektroden zu, indem man sie in 70 % igem Ethanol für 15-30 min, und dann trocknen sie an der Luft für 15 S. Spülen der Elektrode in die experimentelle Zellkulturmedien.</li>
	<li>Schalten Sie das Gerät, und wählen Sie den Modus "Ohm". Legen Sie vorsichtig die langen Enden der Elektrode Brücken in die basale Kammer und die kurzen enden in die apikale Kammer. Sicherstellen Sie, dass die längeren Elektroden den Boden der Schale, berühren unter Beibehaltung der kürzeren Elektroden unterhalb der Oberfläche der Medien, sondern vor der Gewebekultur-Einsätze. Halten Sie die Elektroden senkrecht.</li>
	<li>Messen Sie den Widerstand der Probe Einsätze und leere Einsätze (d. h. , die die Kultur ohne Zellen aber mit HBSS fügt) auf 0, 1, 2, 3, 4 h nach der Zytokin-Behandlung. Notieren Sie den Widerstand.</li>
	<li>Um Konsistenz zu erreichen über verschiedene Plattenformate, berechnet das Produkt aus den Widerstand und die effektive Membranfläche: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> Für 24-Well-Einsätze ist die effektive Membranfläche 0,33 cm2.</li>
</ol>(3) Mausmodell Dextran Sulfat Natrium (DSS)-induzierte Kolitis
<ol><li>Hinzu kommt DSS autoklaviert Wasser, eine Endkonzentration von 3,5 % (wt/Vol).</li>
	<li>Verwalten von 3,5 % DSS 8 Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen für insgesamt 7 Tage. Kontroll-Mäusen verleihen Sie regelmäßig Trinkwasser ohne DSS.<ol>
<li>Wechseln Sie das DSS-haltigen Wasser nach Tag 7 zu regelmäßigen Trinkwasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mäuse wiegen und klinische Resultate von jedem Mausklick täglich zu bewerten. Körpergewicht von jeder Maus zu seiner ursprünglichen Körpergewichts zu normalisieren. Noten werden entsprechend der Schwere der Erkrankung durch vier Parameter definiert: rektale Prolaps (0-2), Stuhlkonsistenz (0-2), Blutungen (0-2) und Aktivität (0-2)5. Addieren Sie die Ergebnisse aus diesen Parametern für eine klinische Endstand.</li>
	<li>Um den histopathologischen Zustand der Doppelpunkt Gewebe zu analysieren, einschläfern Sie Mäuse durch Injektion intraperitoneal (i.p.) mit 1,2 % (Vol/Vol) Avertin (0,6 mL/10 g Körpergewicht) 7 Tage Post-DSS Behandlung. Um einen Bestand von 100 % avertin vorzubereiten, mischen Sie 10 g 2,2,2-Tribromoethanol mit 10 ml Tert-Amyl Alkohol.  Speichern Sie im Dunkeln bei 4° C. Verdünnen Sie um zu verwenden, bestand von 100 % bis 2 % in Wasser.</li>
	<li>Isolieren Sie den Dickdarm und Blinddarm zu, und Messen Sie die Länge des Dickdarms5.</li>
	<li>Schneiden Sie 0,5 cm Segmente aus dem distalen Kolon und Fix in einem 15 mL Falcon-Röhrchen mit 10 mL 10 % Formalin über Nacht. Waschen Sie das feste Gewebe mit abgestufter Ethanol (75, 95 und 100 %) und Xylol. Betten Sie des Gewebes in Paraffin ein und schneiden Sie 6 mm Abschnitte für die Hämatoxylin und Eosin Färbung8.</li>
</ol>4. messen die epitheliale Barriere Permeabilität in DSS-induzierte Kolitis Mäuse
<ol><li>Messen Sie die Durchlässigkeit Barriere 7 Tage nach dem Beginn der DSS-Verwaltung.</li>
	<li>Am Tag des Tests schnelle Mäuse für 3 h.</li>
	<li>Autoklaven eine Magensonde Nadel um Sterilität, dann Magensonde Mäuse mit 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-Dextran in sterilem Wasser sicherzustellen und halten Sie die ungenutzten FITC-Dextran um die Standardkurve nach Serum Collection messen. Wiegen Sie die Mäuse für die Berechnung der Durchlässigkeit. Hinweis: Die FITC-Dextran-Lösung sollte in Wasser erfolgen.</li>
	<li>Mit einer Schere, clip ein 1 cm Stück der Rute, und sammeln Sie 100 µL Blut vom Heck in Serum Röhrchen. Drehen Sie das gesammelte Blut bei 10.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verdünnen Sie das Serum 1:4 in Wasser. Zu einem Standard Kurve, verdünnen Sie ungenutzte FITC-Dextran mit Wasser bei 1: 300 000, 1:3, 1:1 000, 01:10, 000, 01:30, 000, 1: 100, 000, 1: 300, 000, 1:1 000 000 und 1:3, 000, 000. Fügen Sie 100 µL/Well das Serum und die Standardkurve Proben in 96-Well Platten.</li>
	<li>Lesen Sie die Fluoreszenz in einem Teller-Reader mit 485 Erregung/528-Emission. Berechnen Sie die Durchlässigkeit Werte anhand der Standardkurve und Multipliziere mit 4 für die Verdünnung zu korrigieren.</li>
	<li>Teilen Sie die Konzentration der FITC-Dextran durch das Gewicht, die Werte zu normalisieren (Dadurch wird den Unterschied in der FITC-Dextran-Lieferung zu normalisieren, wenn Mäuse krank sind und habe Gewicht verloren).</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Caco-2BBe (die Grenze des Pinsel-Ausdruck) Zellen sind immer für TER Messung, ausgewählt von der Caco-2-Zell-Linie für Pinsel-Grenze Proteinexpression verwendet. Caco-2BBe Zellen haben einen Villus absorptive Phänotyp bei differenziert (nach ca. 3 Wochen nach dem Zusammenfluss Kultur)17. Es ist notwendig zur Vermeidung von Kontaminationen während der Messung und die Elektrode zu sterilisieren. Da das Verfahren nicht steril ist, können die Messungen n...

Intestinale Epithelzellen sind nicht nur verantwortlich für die Absorption von Nährstoffen, sondern auch eine wichtige Barriere zur Abwehr von pathogenen Mikroorganismen und mikrobielle Toxine bilden. Diese Funktion der Darmbarriere unterliegt engen Kreuzung Durchlässigkeit und Epithelzelle Integrität1,2,3, und Dysfunktion der epitheliale Barrierefunktion ist verbunden mit entzündlichen Darmerkrankungen Krankheit (IBD). Perijunctional Actomyosin Ring (PAMR) liegt innerhalb der Zelle, die auf die tight Junctions eng zusammenhängend ist. Die Kontraktion der PAMR, die durch die Myosin-Leichtketten (MLC) geregelt wird, ist entscheidend für die Regulierung der engen Kreuzung Durchlässigkeit4,5,6,7,8, 9,10. Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ist zentral für die Darmbarriere Verlust durch heraufregulierende intestinale epitheliale MLC-Kinase (MLCK) Ausdruck und induzieren occludin Internalisierung11,12,13.
Ionen wie Na+ und Cl– können parazellulär Raum durchqueren, durch die Pore oder Leck Weg14. In einem "undichten" Epithel Änderungen in TER in erster Linie veränderte engen Kreuzung Durchlässigkeit. TER-Messung ist ein häufig verwendete elektrophysiologische Ansatz, engen Kreuzung Durchlässigkeit, in erster Linie für Na+ und Cl-, basierend auf die Impedanz der Zelle Monolagen zu quantifizieren. Verschiedene Zelltypen, einschließlich intestinale Epithelzellen, pulmonaler Epithelzellen und vaskulären endothelialen Zellen wurden für TER Messungen berichtet. Vorteile dieser Methode sind, dass TER Messungen nicht-invasiv sind und verwendet werden, können um lebende Zellen in Echtzeit zu überwachen. Darüber hinaus eignet sich die TER-Messtechnik für Drogen Toxizität Studien15.
Caco-2BBe menschlichen epithelialen kolorektalen Adenokarzinom Zellen mit einer Struktur und Funktion ähnlich wie die differenzierte kleinen intestinalen Epithelzellen sind: zum Beispiel haben diese Zellen Mikrovilli und Enzyme, die verbunden sind mit kleinen Darm Pinsel Grenze. Daher sind kultivierte Caco-2BBe Monolagen als in-vitro- Modell Barrierefunktion zu Testzwecken genutzt.
Bei Mäusen ist Einweg, intestinale parazellulär Durchlässigkeit zu studieren durch die Messung der Fähigkeit der FITC-Dextran aus dem Lumen ins Blut zu überqueren. Somit kann die intestinale Permeabilität von Gavaging FITC-Dextran direkt in Mäusen und Messung der Fluoreszenz im Blut beurteilt werden. Das folgende Protokoll beschreibt zwei einfache Methoden zur Beurteilung des Darmepithels Durchlässigkeit in Vitro und in Vivo.

<table><tbody><tr><td>22 G Sondennadel</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dextran</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Schwarze 96-Well-Platten für Fluoreszenz</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57/B6 Mäuse</td><td>Nanjing Biomedical Research Institute der Nanjing University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caco-2BBe Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>Dextransulfat-Natrium-MP</td><td>Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>DMED mit hohem Glukose- und Natriumpyruvat-Hyclone-Messgerät</td><td></td><td>SH30243,01B</td><td></td></tr><tr><td>Epithel (Volt/Ohm)</td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm ChemicalReagenz</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Falcon-Röhrchen (15 mL)</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM Glukose&nbsp;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>Modulares Gewebeeinbettungszentrum</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Serum-Entnahmeröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Parraffin</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Membranen (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Druckpumpe</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>Rotationsmikrotomie</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sinopharm ChemikalieReagenz</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro und in vivo ansätze darm epithelzelle durchlässigkeit zu bestimmen

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Die Darmbarriere schützt vor pathogenen Mikroorganismus und mikrobielle Toxin. Seine Funktion unterliegt engen Kreuzung Durchlässigkeit und Epithelzelle Integrität, und Störungen der intestinalen Barrierefunktion trägt zur Weiterentwicklung des Magen-Darm- und systemische Erkrankung. Zwei einfache Methoden werden hier beschrieben, um die Durchlässigkeit des Darmepithels zu messen. In Vitro, Caco-2BBe Zellen sind in Gewebekultur Brunnen als einem monomolekularen Film beschichtet und ttransepitelialen elektrischen Widerstand (TER) kann von einem epithelialen (Volt /) Ohmmeter gemessen werden. Diese Methode überzeugt durch seine einfache Bedienung und Wiederholbarkeit. In-vivo -Mäuse sind gavaged mit 4 kDa Fluorescein erfolgt (FITC)-Dextran und die FITC-Dextran-Konzentrationen werden in gesammelten Serumproben von Mäusen zu bestimmen, die epitheliale Durchlässigkeit gemessen. Orale Magensonde bietet eine genaue Dosierung, und daher die bevorzugte Methode zur Messung der intestinalen Permeabilität in Vivo. Zusammen genommen, diese beiden Methoden können die Durchlässigkeit des Darmepithels in Vitro und in Vivozu messen und daher verwendet werden, um die Verbindung zwischen Krankheiten und Barrierefunktion zu studieren.

In Kultur Caco-2BBe Zellen als eine Monolage wachsen und langsam in Reife absorptive Enterozyten, die Bürste Grenzen unterscheiden. In diesem Protokoll Caco-2BBe Zellen wurden mit einer hohen Dichte an Polycarbonat Membranen vernickelt und Zellen erreicht 100 % Konfluenz eines Tages nach der Aussaat. Zellen sind jedoch in diesem Stadium undifferenzierte: um die Zellen vollständig zu unterscheiden, ist die Medien alle 2-3 Tage für 3 Wochen verändert. Zellen waren voller Flecken, mit Kernen...

Zwei Methoden werden hier vorgestellt, um intestinale Barrierefunktion zu bestimmen. Eine epitheliale Meter (Volt/Ohm) dient zur Messung des elektrischen Widerstands berührt der kultivierten Epithelien direkt in Gewebekultur Brunnen. Bei Mäusen ist die FITC-Dextran-Magensonde-Methode zur Ermittlung der intestinalen Permeabilität in Vivo.

In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Krankheiten zu untersuchen, die durch epitheliale Barrieredysfunktion verursacht werden, indem die Darmepithelzellpermeabilität in vitro und in vivo gemessen wird. Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen im Bereich der Darmbarriere-Funktion zu beantworten, wie diejenigen im Zusammenhang mit der entzündlichen Darmerkrankung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Durchlässigkeit der Darmepithelzellartsowohlin in vitro und in vivo beurteilt werden kann.Die Auswirkungen dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie oder Diagnose von Magen-Darm-Erkrankungen, weil Darmepithel-Barriere Dysfunktion trägt zu diesen Krankheiten. Obwohl diese Methode Einblick in die Darmbarrierefunktion bieten kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. Arzneimitteltoxizitätsstudien und Barriereintegrität anderer Zelltypen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da einige Schritte schwer zu erlernen sind.Eine genaue Funktionsweise dieser Methode kann nun durch eine Textbeschreibung verstanden werden. Zunächst können Caco-2bbe-Zellen in einem T75-Kolben mit Medium wachsen. Füttern Sie die Kolben regelmäßig, abhängig von der Zelldichte.Wenn die Zellen zu 80 % konfluent sind, entfernen Sie das Medium und verwenden Sie 1-2 Milliliter sterilen PBS ohne Kalzium, um sie zu spülen. Fügen Sie 1,5 Milliliter Trypsin-EDTA hinzu und schaukeln Sie den Kolben sanft. Dann legen Sie es in den 37 Grad Celsius Inkubator für 20 Minuten, ohne zu schaukeln.Während die Zellen versuchen, legen Sie Inserts, die poröse Polycarbonatmembranen enthalten, in 24 Brunnenplatten. Dann fügen Sie 1 Milliliter Kulturmedium in die Basalkammer, die den unteren Raum der Membran ist. Fügen Sie 5 Milliliter Medium in den Kolben, und kräftig Pipette die Zellen gegen das Innere des Kolbens 5 bis 10 Mal, um die Kultur in lose einzelne Zellen zu trennen, oder zwei bis drei Zellklumpen.Platte 0,166 Milliliter der Zellen in die apikale Kammer, die den oberen Raum der Membran ist. Dann die Platten bei 37 Grad Celsius für bis zu drei Wochen inkubieren. Füttern Sie die Zellen dreimal wöchentlich, indem Sie eine Druckpumpe verwenden, um das Medium vorsichtig aus dem Basalfach jedes Brunnens zu saugen.Dann tropfen Sie vorsichtig einen Milliliter Medium in die apikale Kammer jedes Einsatzes. Bei Zytokinstudien ersetzen Sie einen Tag vor transepithelialem elektrischen Widerstand oder TER-Messungen das Basalmedium durch medium, das 10 Nanogramm pro Milliliter Interferongamma enthält. Ersetzen Sie das Medium am Tag des Experiments durch HBSS mit 2,5 oder 7,5 Nanogramm pro Milliliter TNF.Um das Messgerät zu korrigieren, legen Sie die Korrekturelektrode in den Eingangsanschluss ein und wählen Sie den Ohm-Modus. Verwenden Sie dann einen Schraubendreher, um die R-Einstellungsschraube einzustellen, bis das Messgerät einen Messwert von 1.000 Ohm anzeigt. Sterilisieren Sie die Elektroden in 70% Ethanol für 15 bis 30 Minuten und lassen Sie sie für 15 Sekunden an der Luft trocknen.Dann spülen Sie die Elektroden in experimentellen Zellkulturmedium. Schalten Sie als Nächstes die Stromversorgung ein und wählen Sie den Ohm-Modus. Während Sie die Elektroden vertikal halten, legen Sie die langen Enden der Elektrodenbrücken vorsichtig in die Basalkammer, um sicherzustellen, dass sie die Schale berühren.Legen Sie dann die kurzen Enden in die apikale Kammer, um sicherzustellen, dass sie unter der Oberfläche des Mediums bleiben, aber über den Gewebekultureinsätzen. Messen Sie den Widerstand der Probe und der rohen Einsätze bei 0, 1, 2, 3 und 4 Stunden nach der Zytokinbehandlung. Dann notieren Sie den Widerstand.Um Konsistenz über verschiedene Plattenformate hinweg zu erreichen, berechnen Sie das Produkt des Widerstands und der effektiven Membranfläche, wie hier gezeigt. Bei 24 Brunneneinsätzen beträgt die effektive Membranfläche 0,33 Quadratzentimeter. Um Kolitis zu induzieren, fügen Sie DSS zu autoklavierten Wasser zu einer Endkonzentration von 3,5% Gewicht pro Volumen hinzu.Dann verwenden Sie die DSS-Lösung, um das Trinkwasser in den Käfigen des 8 Wochen alten männlichen C57 schwarzen sechs Mäuse für insgesamt sieben Tage zu ersetzen. Geben Sie regelmäßiges Trinkwasser ohne DSS, um Mäuse zu kontrollieren. Nach Tag sieben das DSS-Wasser auf normales Trinkwasser umstellen.Wägen Sie jeden Tag die Mäuse ab und bewerten Sie die klinischen Werte, die nach dem Schweregrad der Erkrankung definiert sind, anhand von vier Parametern: rektaler Prolaps, Stuhlkonsistenz, Blutungen und Aktivität. Summieren Sie die Ergebnisse aus diesen Parametern für eine endgültige klinische Punktzahl. Um den histopathologischen Zustand von Dickdarmgeweben sieben Tage nach der DSS-Behandlung zu analysieren, nach der Einschlämung von Mäusen gemäß dem Textprotokoll, isolieren Sie den Dickdarm und das Zecum und messen Sie die Länge des Dickdarms.Schneiden Sie 0,5 Zentimeter Segmente aus dem distalen Dickdarm und fixieren Sie das Gewebe in einem 15 Milliliter Falkenrohr, das 10 Milliliter 10% formalin über Nacht enthält. Waschen Sie die fixen Gewebe mit abgestuftem Ethanol und Xylol. Dann die Gewebe in Paraffin einbetten und sechs Millimeter Schnitte für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung schneiden.Um die Epithelbarrieredurchlässigkeit bei DSS-induzierten Mäusen zu messen, fasten sie sieben Tage nach Beginn der DSS-Verabreichung die Mäuse drei Stunden lang. Autoclave eine Gavage-Nadel, um Sterilität zu gewährleisten, dann verwenden Sie 150 Mikroliter von 80 Milligramm pro Milliliter vier Kilodalton FITC Dextran in sterilem Wasser, um die Mäuse zu gavage, und halten Sie die ungenutzte FITC dextran, um die Standardkurve nach serum Sammlung zu messen. Gewichten Sie als Nächstes die Mäuse für die Permeabilitätsberechnung.Vier Stunden später, nach der Anästhesisierung der Mäuse durch IP-Injektion, bestätigen richtige Anästhesie durch den Mangel an Reflexen und Schnurrbartbewegung. Dann legen Sie die Mäuse für fünf Minuten auf einen Wärmeblock. Schneiden Sie mit einer Schere ein einen Zentimeter großes Stück des Schwanzes ab und sammeln Sie 100 Mikroliter Blut aus dem Schwanz in ein Serum-Sammelrohr.Drehen Sie das gesammelte Blut bei 10.000 mal g und Raumtemperatur für zehn Minuten. Mit Wasser das Serum eins bis vier verdünnen. Um dann eine Standardkurve zu erstellen, verwenden Sie Wasser, um die Verdünnungen des unbenutzten FITC-Dextrans vorzubereiten.Fügen Sie 100 Mikroliter pro Brunnen des Serums und die Standardkurvenproben in 96 Wellplatten ein. Lesen Sie mit hilfe eines Plattenlesers die Fluoreszenz bei einer Anregung von 485 und einer Emission von 528. Berechnen Sie die Permeabilitätswerte basierend auf der Standardkurve, und multiplizieren Sie sie mit vier, um die Verdünnung zu korrigieren.Teilen Sie die Konzentration von FITC dextran durch das Gewicht, um die Werte zu normalisieren. Dies hilft, den Unterschied in der FITC Dextran-Entbindung zu normalisieren, wenn Mäuse krank sind und Gewicht verloren haben. Die hier gezeigten Caco-2bbe-Zellen wurden mit Kernen und F-Actin-Färbungen beschriftet, um den Unterschied zwischen undifferenzierten und differenzierten Zellen zu zeigen.Spannungsfasern sind in undifferenzierten Zellen deutlich zu sehen. Differenzierte Zellen haben ein geringeres Volumen, größere Kerne und weniger Spannungsfasern als undifferenzierte Zellen. TNF ist zentral für den Verlust von Darmbarrieren durch MLCK-abhängige enge Kreuzungsregulierung.Wie in dieser Abbildung gesehen, tNF deutlich verringert die TER der Caco-2bbe Monolayer in einer dosisabhängigen Weise, was darauf hindeutet, dass TNF epitheliale Permeabilität erhöht. Im Vergleich zu ihrem anfänglichen Körpergewicht verlieren mäuse, die mit DSS behandelt werden, eine erhebliche Menge an Gewicht. Die Schwere der Kolitis wird durch rektale Prolaps, Stuhlkonsistenz, Blutungen und Aktivität bewertet.Querschnitte von mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Kolongeweben zeigen kolonische Schleimhautschäden bei DSS-behandelten Mäusen. Darüber hinaus wird die Länge der Doppelpunktkrypta, sowie der Doppelpunkt selbst, bei DSS-behandelten Mäusen verringert. Schließlich gibt es einen etwa doppelten Anstieg der FITC-Dextran-Färbung bei DSS-behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, fehlerbedenkt zu denken, indem Sie operative Verfahren standardisieren und statistische Methoden verwenden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Darmbarrierefunktion den Weg, um Magen-Darm-Erkrankungen sowohl in Modellorganismen als auch in Zelllinien zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Darmepithelpermeabilität bestimmen können, indem Sie den TER messen, FITC-Dextran gavaging und morphologische und histochemische Veränderungen beobachten.

in-vitro-vivo-approaches-to-determine-intestinal-epithelial-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von exzidierten Darmgewebepräparaten oder "Darmsäcken" als ex vivo Modell der Darmbarrierefunktion. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Integrität sowohl der Epithelbarriere als auch der Schleimhautgelschicht an spezifischen Darmstellen in Tiermodellen für Verdauungserkrankungen zu beurteilen.

Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit

Aktuelle Behandlungen von entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zielen darauf ab, die Krankheitssymptome zu lindern, kann aber schwere Nebenwirkungen verursachen. Somit sind alternative Strategien in Tier Colitis-Modellen untersucht. Hier erklären wir, wie die positiven Wirkungen von Nahrungsergänzungsmitteln auf die klinische IBD Zeichen sind in einer solchen ulcerosa Modell analysiert.

Analyse wohltuende Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf Darmepithel Barrierefunktionen Während Experimental ulcerosa

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Der Zugang von Nährstoffen, Mikrobiota Metaboliten und Arzneimitteln für den Verkehr wird durch die Darm-Blut-Schranke (GBB) gesteuert. Wir beschreiben eine direkte Methode zur Messung der GBB Durchlässigkeit in Vivo, die im Gegensatz zu gängigen indirekte Methoden praktisch nicht von Leber und Niere Funktionen betroffen ist.

Eine In Vivo -Methode zur Bewertung der Darm-Blut-Schranke und LEBERSTOFFWECHSEL Mikrobiota Produkte

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung von Enteroiden, einem dreidimensionalen Darmmodell, aus fetalem Darmgewebe. Immunfluoreszierende Bildgebung von epithelialen Biomarkern wurde zur Modellcharakterisierung verwendet. Die apikale Exposition von Lipopolysacchariden, einem bakteriellen Endotoxin, induzierte die epitheliale Permeabilität in einer dosisabhängigen Weise, gemessen durch das Austreten von fluoreszierendem Dextran.

Testen der Epithelpermeabilität in fetalen Gewebe-abgeleiteten Enteroiden

Das vorliegende Protokoll skizziert eine Methode, die Luzifergelb in einem apikalen enteroiden Modell verwendet, um die Darmpermeabilität zu bestimmen. Diese Methode kann verwendet werden, um die parazelluläre Permeabilität in Enteroiden zu bestimmen, die entzündliche Darmerkrankungen wie nekrotisierende Enterokolitis modellieren.

Bestimmung der Darmpermeabilität mit Lucifer Yellow in einem apikalen enteroiden Modell

Hier beschriebenen Protokolle verwendet werden, um den dynamischen Prozess der MG53-vermittelte Zellmembran Reparatur in ganzen Tieren und auf zellulärer Ebene sichtbar machen. Diese Methoden können auf die Zellbiologie der Plasmamembran Wiederverschließen und der regenerativen Medizin untersucht werden.

Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

Lernen Sie Methoden zur Messung der Darmepithelpermeabilität in vitro und in vivo bei Mäusen. Diese Techniken helfen Forschern, Barrieredysfunktionen bei gastrointestinalen Erkrankungen zu untersuchen.

In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen

Weitere Videos entdecken