Proliferation und Differenzierung der murinen Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, murine myeloide 32D-G-CSF-R-Zellen genetisch zu verändern, indem das Gen der Wahl überexprimiert oder stillgelegt wird, und die Auswirkungen dieser Veränderungen auf Proliferation und neutrophile Differenzierung der Zelllinie zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hämatologie zu beantworten, beispielsweise welche Rolle das untersuchte Protein bei Wachstum und Differenzierung myeloischer Vorläuferzellen spielt. Der Hauptvorteil dieser Zelllinie liegt in ihrer unbegrenzten Proliferationskapazität, ihrer Anfälligkeit für genetische Manipulationen, den relativ geringen Kosten und der Möglichkeit einer biologischen Vereinfachung, die bei bestimmten experimentellen Ansätzen erforderlich ist. Die Demonstration des Verfahrens übernimmt heute Petr Danek, ein Doktorand in meinem Labor.

Stellen Sie 250 Milliliter RPMI-1640-Medium her, das mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum und 10 Nanogramm pro Milliliter murinem Interleukin-3 ergänzt ist. Bereiten Sie anschließend 50 Milliliter Differenzierungsmedium vor.

In einer 16 cm großen Petrischale eine Einzelzell-Suspension von Bosc23-Zellen in 18 Milliliter DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum, ansäen. Etwa 24 Stunden kultivieren, bis die Konfluenz 80 % erreicht. Anschließend MSCV-Retrovirus-Konstrukt, PCL-eco-Verpackungsvektor, Polyethylenimin und serumarmes Medium ohne Antibiotika miteinander mischen. Dieses Gemisch 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Flowbox inkubieren. Danach das Kulturmedium der Bosc23-Zellen vorsichtig durch 16 Milliliter vorgewärmtes DMEM-Medium, ergänzt mit 2 % fetalem Kälberserum und auf 37 Grad Celsius gehalten, ersetzen. Als Nächstes die Retrovirus-Mischung tropfenweise auf die Bosc23-Zellen geben. Die Kultur anschließend vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach Beendigung der Inkubation das Kulturmedium der Bosc23-Zellen abpipettieren und 18 Milliliter vorgewärmtes DMEM-Medium mit 10 % fetalem Kälberserum hinzufügen. Die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Mit einer 25-Milliliter-Serologischen Pipette das virushaltige Medium der Bosc23-Zellen in ein 50-Milliliter-Konischgefäß überführen. Das Gefäß bei vier Grad Celsius lagern. Anschließend 18 Milliliter vorgewärmtes DMEM-Medium mit 10 % fetalem Kälberserum zu den Bosc23-Zellen geben und die Zellen 24 Stunden lang kultivieren.

Zentrifugieren Sie das virale Überstandsgemisch bei 1.500 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend portionieren Sie das Virus und schockgefrieren es mit flüssigem Stickstoff, um es bei minus 80 Grad Celsius zu lagern.

In jedes Loch einer sechs-Loch-Platte geben Sie NIH/3T3-Zellen in drei Milliliter DMEM-Medium, das mit 10 % fetalem Kälberserum ergänzt ist, um einen Virus zu titrieren. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag verdünnen Sie das Virus mit vorgewärmtem Medium, ohne die viralen Partikel zu wirbeln. Aspirieren Sie das Kulturmedium von den NIH/3T3-Zellen und geben Sie je ein Milliliter verdünntes Virus in jedes Loch. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag aspirieren Sie vorsichtig das verdünnte virale Medium und ersetzen es durch zwei Milliliter DMEM-Medium mit 10 % fetalem Kälberserum und inkubieren erneut über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation aspirieren Sie das alte Medium und ersetzen es durch DMEM-Medium, das zwei Mikrogramm pro Milliliter Puromycin enthält. Kultivieren Sie die Zellen weiter alle drei Tage oder solange, bis das Medium gelb wird, und ergänzen Sie es mit frischem Medium, das Puromycin enthält.

Zwischen dem 10. und 12. Tag nach der Infektion das Medium aus den Vertiefungen abpipettieren und vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen. Anschließend mit einem Milliliter Kristallviolett-Lösung bei Raumtemperatur zwei Minuten lang einfärben. Nach der Färbung vorsichtig zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen. Die Gesamtanzahl der blauen Kolonien in jeder Vertiefung unter dem Mikroskop zählen.

Die 32D-G-CSF-R-Zellen in einer 6-Loch-Platte ansäen. Virus mit einer Multiplizität der Infektion zwischen 10 und 40 hinzufügen. Anschließend Polybrene bis zu einer Endkonzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter zu den Zellen geben und sechs Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen sammeln und bei vier Grad Celsius mit 450 × g fünf Minuten lang zentrifugieren. Die 32D-Zellen können teilweise ihre Differenzierungsfähigkeit verlieren, wenn sie in Konzentrationen über einer Million Zellen pro ml kultiviert werden; daher ist es sehr wichtig, diese Zellen rechtzeitig zu teilen und die Kulturen nicht überwachsen zu lassen.

Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem T25-Kulturfläschchen, das sechs Milliliter RPMI-1640-Medium mit zugesetztem hitzeinaktiviertem 10% fetalem Rinderserum und 10 Nanogramm pro Milliliter murinem Interleukin-3 enthält. Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie die 32D-G-CSF-R-Zellen zweimal mit RPMI-1640-Medium ohne Zytokine. Anschließend impfen Sie die Zellen am Tag null in einem Milliliter Differenzierungsmedium in einer 24-Well-Platte aus und inkubieren sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Die Zellen benötigen sieben bis neun Tage, um sich in reife Granulozyten zu differenzieren. Danach zählen Sie die Zellenanzahl unter Ausschluss toter Zellen mit Trypanblau.

Da IL-3 den Differenzierungsprozess hemmen kann, ist es äußerst wichtig, alle Spuren des Zytokins zu entfernen, bevor die Zellen in GCSF kultiviert werden.

Zentrifugieren Sie die Zellen mit einem Cytospin auf einem Objektträger in einer Zentrifuge mit den erforderlichen Adaptern bei 20 × g für fünf Minuten. Danach fixieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei Raumtemperatur in Methanol und lassen die Zellen trocknen. Färben Sie die Zellen gemäß der Herstelleranleitung mit May-Grünwald-Giemsa-Färbung. Nach der Färbung betrachten Sie die angefärbten Zellen mit einer 40fachen Vergrößerung.

Basierend auf der zellulären Morphologie die Anzahl der Blasten, intermediär differenzierten Zellen und reifen Granulozyten in den gefärbten Zellen quantifizieren.

Hier ist eine grafische Darstellung des Proliferationsverhaltens von 32D-G-CSF-R-Zellen in einem Medium mit Interleukin-3 und granulozytenstimulierendem Faktor (G-CSF) dargestellt. Die x-Achse zeigt die Tage der Behandlung, die y-Achse die Zellanzahl in logarithmischer Skala. Der schwarze Verlauf zeigt die Proliferation, wenn die Zellen in einem Interleukin-3-haltigen Medium kultiviert werden. Der blaue Verlauf zeigt eine verminderte Zellproliferation, wenn die Zellen in einem granulozytenstimulierenden Faktor-haltigen Medium kultiviert werden.

Gezeigt sind repräsentative Kreisdiagramme und May-Grünwald-Giemsa-Färbungen, die den Anteil und die Differenzierungsmorphologie von 32D-G-CSF-R-Zellen in einem Medium mit granulozytenkoloniestimulierendem Faktor darstellen. Die Kreisdiagramme zeigen den Anteil von Blasten, intermediär differenzierten Zellen und Neutrophilen nach Behandlung mit granulozytenkoloniestimulierendem Faktor zu den Zeitpunkten null, zwei, vier und sechs Tage. Giemsa-gefärbte Zellen am Tag null weisen große charakteristische Kerne und dunkles Zytoplasma auf. Am Tag sechs ist die Kerngröße verkleinert und das Zytoplasma vergrößert, jedoch nicht dunkel.

Gezeigt sind repräsentative Kreisdiagramme, die den höheren Anteil an Blastzellen bei Transduktion mit BCR-ABL-Fusionsproteinen im Vergleich zum Kontroll-MSCV-Vektor in Medien mit granulozytenstimulierendem Faktor darstellen. Die Giemsa-Färbung im unteren Panel ist repräsentativ für die Zellen nach Transduktion mit Kontroll- oder BCR-ABL-Fusionsproteinen.

Die Zellen durchliefen am sechsten Tag eine neutrophile Differenzierung, wenn sie mit dem MSCV-Kontrollvektor transduziert wurden, während BCR-ABL-transduzierte Zellen hauptsächlich Blasten aufwiesen und keine reifen Neutrophilen zeigten.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden. Während des Ablaufs dieses Verfahrens ist es wichtig, die 32D-G-CSF-Rezeptorzellen in den angegebenen Konzentrationen zu kultivieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Migrationsassays und Überlebensversuche durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie mit der 32D-G-CSF-Rezeptorzelllinie umgegangen wird, einschließlich genetischer Manipulation durch lentivirale und retrovirale Transduktion, Expansion, Differenzierung sowie Beurteilung von Proliferation und Differenzierung dieser Zellen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Viren gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzbrille stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.