Ein Time-Lapse, markierungsfreie, Quantitative Phase bildgebende Untersuchung der ruhenden und aktiven menschlichen Krebszellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, angiogene und nicht-angiogene Phänotypen menschlicher Osteosarkomzellen systematisch zu charakterisieren, indem Analysen der Zellmorphologie, Proliferation und Motilität kombiniert werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in Bezug auf die Entstehung und Progression von Krebs beim Menschen zu beantworten. Insbesondere die Flucht aus der Tumordormanz und der endogene Schalter.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass mit dieser integrierten, hochspreizenden Methode multizelluläre Parameter gleichzeitig analysiert werden können. Dazu gehören Zellfläche, Zelldicke, Zellvolumen, Proliferationsrate, Verdopplungszeit, Motilitätsgeschwindigkeit, Migration und Motilität. Zu Beginn erwärmen Sie das Nährmedium in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius.

Nehmen Sie dann kryogene Fläschchen mit angiogenen und nicht-angiogenen menschlichen Osteosarkomzellen aus dem Flüssigstickstofftank. Tauchen Sie den Boden der Fläschchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und schütteln Sie die Kryofläschchen vorsichtig, um den Auftauprozess zu beschleunigen. Sobald die Zellen aufgetaut sind, besprühen Sie das Fläschchen mit 70%igem Ethanol und wischen Sie das Fläschchen ab, um es zu sterilisieren.

Aspirieren Sie dann sofort die Zellsuspension aus dem Fläschchen und suspendieren Sie sie vorsichtig in 10 Millilitern erwärmtem Kulturmedium. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellsuspensionen fünf Minuten lang, um die Zellen zu pelletieren. Zurück in der Haube entfernen Sie den Überstand und suspendieren das Zellpellet wieder mit 10 Millilitern erwärmtem Kulturmedium.

Übertragen Sie dann die Zellsuspension in einen T75-Kolben. Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Den Kolben in einen Inkubator stellen und die Zellen mindestens 12 Stunden lang anheften lassen.

Wechseln Sie das Kulturmedium alle zwei bis drei Tage. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 100 Prozent erreichen, nehmen Sie das Nährmedium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern sterilem PBS ohne Kalzium und Magnesium. Geben Sie dann einen Milliliter einer 0,25%igen EDTA-Lösung in den Kolben und schwenken Sie den Kolben kurz.

Inkubieren Sie den Kolben zwei bis drei Minuten lang und überprüfen Sie dann die Zellen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen abgerundet und abgelöst sind. Sobald die Zellen abgelöst sind, fügen Sie mit einer Pipette 10 Milliliter Nährmedium hinzu und pipettieren Sie das Medium mehrmals vorsichtig auf und ab, um verbleibende Zellaggregate aufzubrechen. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, säen Sie zwei Millionen von ihnen in einen neuen T75-Kolben

Stellen Sie den Kolben in einen Inkubator und züchten Sie die Zellen auf eine Konfluenz zwischen 80 und 100 Prozent, bevor Sie die Zellen für das quantitative Phasenbildgebungsexperiment aussäen. Ernten Sie Zellen durch Tripson-Verdauung und säen Sie angiogene und nicht-angiogene humane Osteosarkomzellen in sechs Well-Platten mit einer Dichte von 50.000 bis 300.000 Zellen pro Well. Bedecken Sie die Zellen mit insgesamt fünf Millilitern Kulturmedium.

Inkubieren Sie die Platten dann mindestens 12 Stunden lang, damit sich die Zellen anheften können. Ersetzen Sie das Medium vor der Bildgebung durch ein frisches Medium. Reinigen Sie einen Deckglas, indem Sie ihn mehrmals mit fließendem entionisiertem Wasser abspülen.

Tauchen Sie es dann 15 Minuten lang in eine 75%ige Ethanollösung. Legen Sie den sterilisierten Abdeckschub zum Trocknen in eine Laminar-Flow-Haube. Legen Sie dann den Deckglas vorsichtig in eine Sechs-Well-Platte, um offensichtliche Blasen zu vermeiden.

Legen Sie die Platte mindestens 15 Minuten lang in den Inkubator, um sie auszugleichen. Wenn sich Nebel auf dem Deckel der Platte bildet, wischen Sie ihn vor der Bildgebung mit einem sterilen Wattestäbchen sauber. Öffnen Sie die Software für die quantitative Phasenbildgebung und initialisieren Sie das System.

Stellen Sie sicher, dass die Werte bei der Selbstkalibrierung von Belichtungszeit, Musterkontrast und Hologrammrauschen akzeptabel sind. Platzieren Sie dann die Sechs-Well-Platte auf dem Tisch des quantitativen Phasenbildmikroskops. Zurück in der Software klicken Sie auf Live-Aufnahme.

Gehen Sie dann zum Software-Fokusmenü und wählen Sie Manuell. Gehen Sie dann zum Mikroskop-Einstellungsmenü und fokussieren Sie die Phasenbilder der Zellen grob, indem Sie den Arbeitsabstand anpassen, um Umrisse für Zellen in Phasenbildern zu erhalten. Wenn Sie fertig sind, kehren Sie zum Fokusmenü der Software zurück und ändern Sie die Fokuseinstellung auf automatisch.

Klicken Sie nun auf Neues Experiment. Beginnen Sie mit der Auswahl der Bildaufnahmepositionen mit der Maus oder den Pfeiltasten auf dem Ziffernblock. Klicken Sie nach jeder Auswahl auf Speichern.

Nachdem Sie alle Positionen ausgewählt haben, gehen Sie zum Zeitrafferbereich und stellen Sie die Bildgebungsintervalle so ein, dass sie kürzer als fünf Minuten sind und der Gesamtzeitraum 48 Stunden beträgt. Starten Sie das Experiment, indem Sie auf Erfassen klicken. Dadurch werden Bilder automatisch an den ausgewählten Positionen zu jedem Intervallzeitpunkt fokussiert und aufgenommen.

Analysieren Sie nach der Bildaufnahme die Morphologie der Zellen, indem Sie zunächst auf Zellen identifizieren klicken. Passen Sie die numerische Einstellung für den Hintergrundschwellenwert so an, dass die Zellenbereiche gut vom Hintergrundrauschen getrennt sind. Passen Sie als Nächstes die Einstellnummer für die Objektgröße an, um sicherzustellen, dass jede Zelle nur einen Kern hat.

Ändern Sie alle Zellensegmente, die dieser Anforderung nicht entsprechen, manuell, indem Sie manuelle Änderungen verwenden. Verwenden Sie dann die Funktion "Daten analysieren" in der Software, um Zellen zu analysieren. Starten Sie eine neue Datenanalyse, indem Sie auf Neue Analyse klicken.

Ziehen Sie ausgewählte Bilder auf die Registerkarte "Quellbilder" und notieren Sie die Parameter der Zellmorphologie, einschließlich der Zellfläche, der optischen Dicke und des Volumens für jede einzelne Zelle. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie den Streudiagramm- oder Histogrammmodus und exportieren Sie die Daten als Tabellen oder Abbildungen. Wählen Sie mindestens fünf Bilder im Abstand von 12 Stunden aus und notieren Sie die von der Software bereitgestellten Zellennummern.

Schätzen Sie die Proliferationsrate der Zellen, indem Sie mit den ursprünglichen Zellzahlen normalisieren und dann die Zellzahlen darstellen. Schätzen Sie schließlich die Verdopplungszeit, indem Sie die Datenpunkte mit einer exponentiellen Wachstumskurve anpassen. Um die Zellbewegung zu analysieren, verwenden Sie die Funktion "Zellen verfolgen" in der Software.

Klicken Sie zunächst auf Neue Analyse, um eine neue Datenanalyse zu starten. Ziehen Sie dann eine Reihe von Bildern aus dem gewünschten Zeitraum auf die Registerkarte Quell-Frames. Wählen Sie anschließend im Auswahlmodus Zellen hinzufügen nach dem Zufallsprinzip 10 bis 30 Zellen aus, indem Sie darauf klicken.

Überprüfen Sie unbedingt die Nachverfolgung in der Bilderreihe. Für den Fall, dass das System den Überblick über eine Zelle verliert oder die falsche Zelle verfolgt, passen Sie die Tracking-Zelle manuell an, indem Sie auf Identifizieren klicken, um Zellen zu identifizieren, oder indem Sie in den Auswahlmodus wechseln und auf Position ändern klicken, um die Position einer Zelle zu ändern. Wenn Sie fertig sind, gehen Sie zu Plot-Bewegung, und wählen Sie Zeilen Plot der Zellentrajektorien aus, oder gehen Sie zu Plot-Features und Plot für die anderen bewegungsbezogenen Parameter, wie z. B. Motilitätsgeschwindigkeit, Motilität, Migration und Migrationsdirektheit.

Exportieren Sie die Daten in Form von Tabellen oder Abbildungen. In diesem Protokoll werden quantitative Phasenbilder als Hologramme dargestellt. Die hier gezeigten Zellen zeigen die typische Zellmorphologie für angiogene und nicht-angiogene humane Osteosarkomzellen.

Die Zelldicke wird aus dem Brechungsindex und der optischen Weglänge berechnet und hier als Streudiagramm dargestellt. Die beiden unterschiedlichen Zellphänotypen wiesen unterschiedliche Verteilungsmuster auf und deuten darauf hin, dass die angiogenen Zellen kleinere Zellflächen und eine größere Zelldicke aufweisen als die nicht-angiogenen Zellen. Die Zellproliferationsrate der beiden Zelltypen lässt sich aus solchen 2D-Bildern berechnen, die segmentiert wurden und sich über den Zeitraum von zwei Tagen erstrecken.

Für diese spezifischen Zelltypen wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden. Um die Zellbewegungseigenschaften für die Zellen zu bestimmen, müssen einzelne Zellen ausgewählt und über die Zeit verfolgt werden. Hier werden die getrackten Zellen mit unterschiedlichen Farben umrandet.

Jede einzelne Zelle wurde über einen Zeitraum von vier Stunden mit ihrer hier beschriebenen Gesamtpfadbahn verfolgt, wobei der Nullpunkt ihr Startpunkt ist und ihre endgültige Position durch den farbigen Punkt angezeigt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit quantitativer Phasenbildgebung eine Reihe von Zellmorphologie- und Verhaltensparametern quantitativ vergleichen können. In diesem Fall zwischen angiogenen und nicht-angiogenen Zellphänotypen.

Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsforschung, um den Ausweg aus der Tumorruhe und die Rolle der Angiogenese in diesem Prozess zu erforschen. In einer kontinuierlichen und nicht etikettierenden Plattform. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zelllinien äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.