Kombinatorische Behandlung von Trichostatin A und Vitamin C verbessert die Effizienz des Klonens Mäuse durch Kerntransfer somatischer Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Produktionseffizienz von rekonstruierten Embryonen und geklonten Mäusen durch somatischen Zellkerntransfer zu verbessern. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Grundlagenbiologie, Entwicklungsbiologie und Rettung gefährdeter Tiere zu beantworten. Wie zum Beispiel die Embryonalentwicklung, die nukleare Programmierung und die Konservierung der genetischen Forschung.

Der Hauptvorteil dieser Methode und Technik besteht darin, dass es möglich ist, geklonte Mäuse mit einfachen Verfahren mit einem praktischen Maß an Effizienz zu erzeugen. Nach der Vorbereitung des Nährmediums gemäß dem Textprotokoll werden 1,2 Gramm BSA in 10 ml sterilem Wasser mit Raumtemperatur gelöst. Geben Sie etwa 0,12 Gramm gemischte Ionenaustauscherharzkügelchen bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in die BSA-Lösung.

Wenn die Kügelchen ihre Farbe von blaugrün zu gold ändern, verwende eine Pipette, um die überstehende Lösung zu gewinnen, und ersetze die Kügelchen dann durch eine frische Charge. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass sich die frischen Kügelchen nicht verfärben, stellen Sie die Lösung wieder her. Fügen Sie dann 250 Mikroliter 10,5% Natriumbicarbonat hinzu.

Sterilisieren Sie den Überstand mit einem 0,45-Mikron-Filter, kennzeichnen Sie ihn als DBSA-Stammlösung und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius. Nach der Euthanasie an weiblichen Mäusen, die einer Superovulation gemäß dem Textprotokoll unterzogen wurden, wurden Standard-Dissektionstechniken verwendet, um den Bauch zu schneiden, um Zugang zum Fortpflanzungstrakt zu erhalten. Entferne die Eileiter mit einer kleinen geraden Schere und einer Pinzette und übertrage sie auf ein Blatt Filterpapier, um das Blut von der Oberfläche abzuwischen.

Anschließend werden die Eileiter in Mineralöl eingelegt, dann mit Präpariernadeln die Ampulle des Eileiters zerschnitten und die aus der Ampulle kommenden Kumulus-Eizellkomplexe in 200 Mikroliter HCZB-Medium mit 0,1 % Hyaluronidase überführt. Inkubieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang auf einer Warmhalteplatte. Bestätigen Sie unter einem Stereomikroskop, dass die Kumuluszellen aus den Kumulus-Oozytenkomplexen freigesetzt werden, und übertragen Sie dann die Eizellen des zweiten meiotischen oder M2-Metaphasenstadiums mit einigen verbleibenden Kumuluszellen auf ein MKSOM-Medium mit 0,3 % DBSA.

Waschen Sie die Eizellen im M2-Stadium viermal, indem Sie im Medium auf und ab pipettieren, um die verbleibenden Kumuluszellen zu lösen. Dann inkubieren Sie die Eizellen in Medium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bis zur Enukleation. Um die entblößten Eizellen aus den Cumulus-Oozytenkomplexen zu isolieren, wird unter einem Stereomikroskop mit einer Pipette eine kleine Anzahl der verbleibenden Kumuluszellen, die aus den Cumulus-Oozytenkomplexen dispergiert wurden, auf HCZB-Medium mit 6 % DBSA übertragen.

Legen Sie die Kumuluszellen auf die Warmhalteplatte bei 37 Grad Celsius, bis sie für den Kerntransfer der somatischen Zellen oder SCNT benötigt werden. Nach der Herstellung von PVP-Medium und CB-Stammlösungen gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie eine sterilisierte Pipette mit 20 Mikrolitern HCZB-Medium, das fünf Mikrogramm pro Milliliter CB enthält, um die Eizellen im M2-Stadium zu waschen. Nachdem Sie die Wäsche fünfmal wiederholt haben, inkubieren Sie die Eizellen 10 Minuten lang in Enukleationslösung auf der Warmhalteplatte.

Bereiten Sie dann die Enukleationskammer vor und verwenden Sie dann eine Pipette, um die M2-Eizellen in die Kammer zu übertragen. Fügen Sie vier Mikroliter Enukleationslösung hinzu und bedecken Sie die Kammer mit Mineralöl. Identifizieren Sie unter einem Mikroskop bei Raumtemperatur die Spindeln und Chromosomen der Eizelle im M2-Stadium.

Richten Sie dann die Eizelle mit einer Haltepipette und einer Mikropipette mit einem ausgeprägten ersten Polkörper so aus, dass die Positionierung der Spindel und des Chromosoms in der 3:00- oder 9:00-Position ist. Stellen Sie die Intensität des Paizo-Impulses auf drei bis sechs ein und bohren Sie mit einer Mikromanipulationspipette zur Zona pellucida und öffnen Sie ein Loch darin. Dann enukleieren Sie mit einer minimalen Menge an Zytoplasma die Spindeln und Chromosomen vollständig.

Bestätigen Sie unter sichtbarem Licht das Fehlen von Chromosomen im Zytoplasma und waschen Sie dann die enukleierten Eizellen gründlich mit MKSOM-Medium, das 0,3 % DBSA ohne CB enthält. Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bis zur Zellfusion. Zur Herstellung von HBJE werden 260 Mikroliter eiskalte HBJE-Suspensionslösung zu lyophilisiertem HVJ-E gegeben und auf und ab pipettiert, bis es vollständig suspendiert ist.

Bereiten Sie fünf Mikroliter-Aliquots der Lösung vor und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius bis zur Zellfusion. Um die Zellfusion durchzuführen, verwenden Sie 20 Mikroliter Zellfusionspuffer, um fünf Mikroliter HVJ-E-Lösung zu verdünnen. Legen Sie die verdünnte HBJE-Lösung bis zur Verwendung auf Eis.

Nach der Vorbereitung der Zellfusionskammer, wie hier gezeigt, werden die enukleierten Eizellen mit einer Pipette auf das HCZB-Medium in der Kammer übertragen. Fügen Sie vier Mikroliter jeder Lösung wie gezeigt hinzu und verwenden Sie etwa einen Milliliter Mineralöl, um die Kammer abzudecken. Die Kammer mit den enukleierten Eizellen wird bei Raumtemperatur unter einem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung platziert.

Übertragen Sie dann die Spenderzellen mit der Mikromanipulationspipette in die HVJ-E-Suspensionslösung. Aspirieren Sie die Kumuluszellen nacheinander, um sie gleichmäßig voneinander zu trennen und so eine serielle Zellfusion zu ermöglichen. Halten Sie dann mit einer Haltepipette die enukleierten Eizellen in HCZB-Medium und verwenden Sie den Paizo-Impuls mit der Mikromanipulationspipette, um die Zona pellucida zu bohren.

Nach dem Öffnen des Lochs in der Zona pellucida pipettieren Sie eine Kumuluszelle mit etwa dem fünffachen Volumen der HVJ-E-Lösung und stoßen sie fest in die Eizellmembran aus, ohne die Membran zu durchdringen. Nach der Manipulation der Zellfusion werden die Eizellen sofort in ein MKSOM-Medium mit 0,3 % DBSA überführt und eine Stunde lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gebracht. Die Putationsschritte müssen innerhalb von 10 Minuten von der Platzierung der enukleierten Eizellen in HCVB-Medium unter dem Mikroskop bis zur Rückkehr in den Inkubator abgeschlossen sein.

Nach der Zellfusion unter dem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung die rekonstruierten Eizellen auf vorzeitige Chromosomenkondensation prüfen. Übertragen Sie die rekonstruierten Eizellen in ein Aktivierungsmedium, das Trichostatin A oder TSA enthält, und inkubieren Sie sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid an der Luft. Beobachten Sie die Bildung von Vorkernen in den SENT-Embryonen und wenden Sie dann zwei weitere Stunden TSA-Behandlung in MKSOM-Medium mit 0,3 % TBSA an.

Führen Sie die Vitamin-C-Behandlung gemäß dem Textprotokoll durch. Wie in dieser Tabelle zu sehen ist, zeigten die TSA- und Vitamin-C-Behandlung an geklonten Mäuseeizellen eine sehr hohe Rate an Vorkernbildung und entwickelten sich unter allen Bedingungen bis zum Zweizellstadium. Einige geklonte Embryonen, die aus Kumuluszellen gewonnen und bis zum Zweizellstadium entwickelt wurden, wurden in Eileiter von pseudoschwangeren Weibchen übertragen.

Diese Abbildung zeigt sechs geklonte Nachkommen, die sich aus 72 übertragenen Embryonen entwickelten, die von drei trächtigen Weibchen durch die serielle Behandlung von TSA und Vitamin C erzeugt wurden. Schließlich verbesserte die Behandlung mit TSA und VC, wie hier gezeigt, die Effizienz der in vitro Embryonalentwicklung bis zum Blastozystenstadium signifikant. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, dass alle notwendigen Medien und Reagenzien im Voraus vorbereitet werden. Das Verfahren selbst, ein einfach zu befolgendes und gut vorbereitetes Material, stellt sicher, dass die erwarteten Ergebnisse erzielt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man rekonstruierte Eizellen herstellt.