Eine optimierte Evans blau Protokoll vaskulären Leck in der Maus bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Plasmaextravasation oder -leckage in den Organen von Mäusen oder anderen Kleintierarten unter Verwendung einer modifizierten Evans Blue Dye-Methode zu bewerten und relativ zu quantifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im vaskulären Bereich zu beantworten, wie z. B. welche endogenen oder exogenen Faktoren die Plasmaextravasation bei einer bestimmten Spezies oder einem bestimmten Organ von Interesse beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Katheterisierung zwar ein geringes Maß an chirurgischer Kompetenz erfordert, aber einen dauerhaften venösen Zugang bietet und von Maus zu Maus reproduzierbar ist.

Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der bescheidenen chirurgischen Schwierigkeit der Katheterplatzierung Schwierigkeiten haben. Nach dem Wiegen einer 16 bis 20 Wochen alten erwachsenen FVB-NJ-Maus bestätigen Sie eine mangelnde Reaktion auf das Einklemmen der Zehen und rasieren Sie den ventralen Halsbereich des Tieres. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein vorgewärmtes Pad und kleben Sie alle vier Pfoten auf die Operationsfläche.

Tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Machen Sie einen einen Zentimeter langen Schnitt im rechten ventralen Hals über der Halsvene. Tragen Sie ein oder zwei Tropfen 1-2% Lidocain auf den Inzisionsbereich auf, um Schmerzen zu lindern und die Vasodilatation zu fördern.

Isolieren Sie die rechte Vena jugularis interna durch stumpfe Dissektion. Binden Sie die Vene mit einer 4-0-Naht ab und ziehen Sie das rostrale Ende des Gefäßes vorsichtig mit einem Blutstiller zurück. Schneiden Sie mit einer feinen Schere ein Loch etwa drei Millimeter kaudal zur Naht und etwa auf halber Höhe des Venendurchmessers.

Führen Sie anschließend einen PV1-Polyvinylkatheter durch das Loch in die Halsvene ein und führen Sie den Katheter etwa 1,5 Zentimeter in Richtung des kaudalen Endes des Gefäßes ein. Verwenden Sie eine neue 4-0-Naht, um den Katheter sicher im kaudalen Abschnitt des Gefäßes zu binden, und binden Sie den rostralen Teil des Gefäßes mit den losen Enden der Naht, die ursprünglich zum Abbinden der rostralen Halsvene verwendet wurden, an die Außenseite des Katheters. Heften Sie die Haut um den Katheter herum mit einem weiteren Stück 4-0-Naht locker zusammen, um Austrocknung, Verlust von Körperwärme und Austrocknung des Gewebes zu verhindern.

Verbinden Sie dann den Katheter mit einer Spritze mit heparinisierter Kochsalzlösung und spülen Sie den Katheter mit der Kochsalzlösung. Um die Extravasation und Leckage aus dem interessierenden Organ zu beurteilen, injizieren Sie zuerst 50 Mikroliter Evans Blue-Lösung in den Jugularvenenkatheter, gefolgt von einer kleinen Menge heparinisierter Kochsalzlösung, um die Leitung zu spülen. Zwei Minuten später injizieren Sie 100 Mikroliter Substanz P in den Katheter, gefolgt von einer zweiten Spülung mit heparinisierter Kochsalzlösung.

Achtzehn Minuten nach der Injektion von Substanz P öffnen Sie die Brusthöhle des Tieres und durchbluten Sie das Herz und die Blutgefäße durch die Schwerkraft mit 50 Millilitern 50 Millimolar Natriumcitratlösung, um das überschüssige Evans Blue aus den Blutgefäßen zu entfernen. Entnehmen Sie die Organe und Gewebe, die Sie interessieren, und entfernen Sie bei Bedarf alle Restinhalte für jedes Gewebe. Spülen Sie die Organe bei Raumtemperatur PBS ab, tupfen Sie die Organe mit einem Labortuch ab und schneiden Sie jedes Organ in zwei Hälften.

Ermitteln Sie die Nassgewichte jeder Organhälfte auf einer Waage und trocknen Sie 1/2 jedes Organs auf einem Stück Folie in einem Trockenofen bei 150 Grad Celsius für 48 Stunden. Geben Sie dann die andere Hälfte jedes Organs für 48 bis 72 Stunden in ein Mikrofuge-Röhrchen in ein Mikrofuge-Röhrchen, um es mit dem Evans Blue Farbstoff zu extrahieren. Neprilysin-Knockout-Mäuse zeigen im Vergleich zu Wildtyp-Tieren eine erhöhte Substanz-P-induzierte Plasmaextravasation aus der Harnblase, was auf eine Rolle von Neprilysin bei der negativen Regulation der Substanz-P-induzierten Plasmaextravasation aus der Blase hindeutet.

Die Doxycyclin-Behandlung von Mäusen, die transgen für die Überexpression von Neprilysin für eine Woche sind, um die Neprilysin-Überexpression zu aktivieren, deutet auf eine zusätzliche Rolle dieses Enzyms bei der Duodenalextravasation hin, da mit Doxycyclin behandelte transgene Tiere im Vergleich zu allen drei Tiergruppen eine signifikant reduzierte Substanz P-induzierte Plasmaextravasation aus dem Zwölffingerdarm aufweisen, die nach der Doxycyclin-Behandlung von Wildtyp- oder Knockout-Tieren nicht beobachtet wird. Sobald sie gemeistert sind, können die Schritte der Katheterisierung, Injektion und Organisolierung in 45 bis 55 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Rechnen Sie mit weiteren zwei bis drei Tagen für den Rest des Protokolls.

Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal erlernen, ist es wichtig, die Prozedur an mindestens 10-20 Übungstieren zu wiederholen, bevor Sie ein Experiment durchführen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Plasmaextravasation oder -leckage in den Organen von Mäusen oder anderen Kleintierarten mit dieser modifizierten Evans Blue Dye-Methode beurteilen und relativ quantifizieren kann.