Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Permeabilität der Hirngefäße bei Mäusen mit fluoreszenzmarkierten Tracern zu bewerten, um die Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke in Tiermodellen zu beurteilen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Blut-Hirn-Schranke zu beantworten, die sich auf die neurovaskuläre Permeabilität bei Krankheiten und deren Wiederherstellung nach der Therapie beziehen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie einfach und quantitativ ist.

Es bietet die Möglichkeit der gleichzeitigen Beurteilung der Permeabilität durch Fluorometrie, die quantitativ ist, sowie Fluoreszenzmikroskopie für regionale Abwehrmechanismen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose und Therapie verschiedener neurologischer Erkrankungen, einschließlich Hirntumoren, Schlaganfall und Alzheimer, da diese Krankheiten mit lebensbedrohlichen Hirnödemen und einer Verbesserung der MHD-Funktion als wichtiges therapeutisches Ziel verbunden sind. Einen Teil des Verfahrens wird Frau Jadranka Macas, eine Beauftragte für wissenschaftliche Technologie am Institut, demonstrieren.

Intraperitoneal injizieren Sie Mäusen 100 Mikroliter zwei-millimolare Tracerlösung. Wählen Sie lysinfixierbare Tracer, wie z. B. Dextrane, die mit FITC und TMR markiert sind, mit unterschiedlichen Anregungsemissionsspektren für minimale Interferenzen zwischen den Farbstoffen. Wenn Sie Tracer kombinieren, injizieren Sie 200 Mikroliter kombinierte Tracerlösung intraperitoneal.

Fügen Sie reine Fahrzeuginjektionen hinzu, die als Scheinkontrollen für die Autofluoreszenz-Hintergrundsubtraktion dienen. Warten Sie nach jeder Injektion fünf Minuten, bevor Sie die Mäuse gemäß den genehmigten institutionellen Protokollen tief anästhesieren. Bereiten Sie die Tiere 10 Minuten nach der Verabreichung des Anästhetikums auf die Herzperfusion vor.

Überprüfen Sie, ob die Pfote nicht zuckt, um sicherzustellen, dass die Maus eine chirurgische Anästhesieebene erreicht hat. Legen Sie die zu perfundierende Maus auf den Rücken und tragen Sie 80%iges Ethanol auf die Haut des Bauchbereichs auf. Nachdem Sie mit einer kleinen Schere einen zwei Zentimeter großen Schnitt in die Bauchdecke gesetzt haben, trennen Sie die Leber vom Zwerchfell und schneiden Sie dann langsam durch das Zwerchfell, wodurch die Mehrzahl der Höhle freigelegt wird.

Schneiden Sie den Brustkorb beidseitig auf und fixieren Sie das geschnittene Brustbein, um die linke Herzkammer freizulegen. Führen Sie eine 21-Gauge-Butterfly-Nadel, die mit einem peristaltischen Perfusionssystem verbunden ist, in den hinteren Teil des linken Ventrikels ein. Punktieren Sie den rechten Vorhof und verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze, bei der das Ende abgeschnitten ist, um die 200 bis 300 Mikroliter freigesetztes Blut schnell zu sammeln und in ein Serumsammelröhrchen zu übertragen.

Bewahren Sie das gesammelte Blut auf Eis auf. Sobald das Blut entnommen ist, schalten Sie das Perfusionssystem ein und perfundieren Sie das Tier drei Minuten lang mit zimmerwarmem Calcium- und Magnesiumionen-freiem PBS. Beurteilen Sie die Perfusionsqualität, indem Sie die Farbe der Leber und der Nieren notieren, die nach der Perfusion blass erscheinen.

Stellen Sie nach der Entnahme des Gehirns sicher, dass in den Gefäßen der Hirnhäute kein Blut sichtbar ist. Die Probe sollte von der Permeabilitätsanalyse ausgeschlossen werden, wenn die Perfusionsqualität schlecht ist. Verwende ein Skalpell, um das Gehirn in zwei Halbhirne zu teilen.

Präparieren Sie dann das Kleinhirn und den Riechlappen von einem Hemihirn und übertragen Sie das Hemi-Großhirn in eine Zwei-Milliliter-Röhre. Legen Sie eine entnommene Niere in ein anderes Zwei-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie die Proben sofort auf Trockeneis.

Betten Sie die verbleibende Niere und das Hemihirn mit intaktem Kleinhirn und Riechlappen nativ in die TissueTech-Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur ein und legen Sie sie auf Trockeneis. Nachdem Sie die Blutproben 10 Minuten lang bei 10.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, werden die Serumüberstände in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und in den Trockeneisbehälter gegeben. Übertragen Sie die Proben in den Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius, da die Homogenisierungseffizienz nach dem Gefrierauftauen zunimmt.

Legen Sie die Hemi-Großhirn- und Nierenproben zum Auftauen auf Eis und wiegen Sie dann die Röhrchen mit den Organen. Von diesen Gewichten subtrahieren Sie den Mittelwert von ca. 20 leeren Röhrchen, um das Gewebegewicht zu erhalten. Geben Sie 300 Mikroliter kaltes PBS in das Röhrchen mit der Niere und 200 Mikroliter in das Röhrchen mit dem Halbhirn.

Homogenisieren Sie jede Probe im Original-Mikrofugenröhrchen mit einem PTFE-Stößel, der an einem elektrischen Überkopfrührer befestigt ist, mit etwa 15 Hüben. Lagern Sie die homogenisierten Proben auf Eis und vor Licht geschützt. Spülen Sie den Stößel zwischen den Proben mit PBS ab und wischen Sie ihn trocken, bevor Sie mit der nächsten Probe fortfahren.

Wenn alle Proben homogenisiert sind, zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei 15.000 g und vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation werden die Überstände in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis überführt, bevor mit der Fluoreszenzmessung und -quantifizierung fortgefahren wird. Übertragen Sie den Überstand auf eine 384-Well-Platte und setzen Sie die Platte in das Fluoreszenz-Reader ein.

Stellen Sie sicher, dass die richtigen Anregungs- und Emissionswellenlängen für den Tracer enthalten sind, und stellen Sie die Verstärkung auf Optimal ein. Starten Sie die Messung und exportieren Sie die Daten als Tabelle, um die Berechnungen wie im Protokoll beschrieben durchzuführen. Tauen Sie am Tag der Färbung 10-Mikron-Kryostatenschnitte, die auf Objektträgern montiert sind, 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf.

Fixieren Sie dann die Abschnitte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd und waschen Sie sie anschließend schnell in PBS. Permeabilisieren und blockieren Sie die unspezifische Bindung in den Schnitten, indem Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur in sterilem PBS mit 1 % PSA und 0,5 % Triton X-100 inkubieren. Nach der Blockierung inkubieren Sie die Objektträger mit einer Verdünnung von 1 zu 100 CD31-Primärantikörper für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur.

Nach dreimaligem Waschen mit PBS für jeweils fünf Minuten ist eine einstündige Sekundärantikörperinkubation bei Raumtemperatur mit speziesspezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern durchzuführen. Montieren Sie die gefärbten Abschnitte mit Aqua-Poly/Mount und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln polymerisieren. Nehmen Sie schließlich Bilder mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopsystem mit spektraler Bildgebung auf.

Um die Tracer-Zirkulationszeit für den Permeabilitätsassay zu ermitteln, wird eine lange Zirkulationszeit von zwei Stunden mit einer kurzen Zirkulationszeit von 15 Minuten nach der Tracer-Injektion verglichen. Die längere Zirkulationszeit von zwei Stunden führt zu einer geringen Akkumulation von Tracern in der Niere im Vergleich zu einer kurzen Zirkulationszeit von 15 Minuten, die möglicherweise auf eine hohe Clearance zurückzuführen ist, die in Grün dargestelltes FITC-Dextran aus dem Gefäßkompartiment darstellt. Im Gehirn ist dieser Effekt aufgrund der angespannten Blut-Hirn-Schranke noch dramatischer.

Die CD31-Färbung im roten Kanal bestätigte das Vorhandensein von Gefäßen in der Niere zu beiden untersuchten Zeitpunkten und im Gehirn. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie innerhalb von fünf bis sechs Stunden an 10 Mäusen durchgeführt werden, wobei zwei Wissenschaftler im Tandem arbeiten. Beim Versuch dieser Technik ist es wichtig, daran zu denken, Tracer mit dem richtigen Molekulargewicht, Diagramm und Fluoreszenzeigenschaften zu verwenden, um die Fragen zur Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu beantworten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie für MHD und Populationsfaktoren durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Schweregrad und Lokalisation der Krankheitsstelle zu beantworten.