Name: Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Lernen Sie eine quantitative Methode zur Bewertung der Blut-Hirn-Schranke-Permeabilität bei Mäusen mit fluoreszierenden Tracern. Diese Technik ermöglicht Forschern die Untersuchung neurovaskulärer Dysfunktionen.

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Die Autoren möchten Sphingonet Konsortium finanziert von der Leduq-Stiftung für die Unterstützung dieser Arbeit anerkennen. Diese Arbeit wurde auch von den Sonderforschungsbereich "vaskuläre Differenzierung und Umbau" unterstützt (CRC / Transregio23, Projekt C1) und durch die 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc-Programm GO-IN, Nr. 291776 Finanzierung. Wir erkennen weiter Kathleen Sommer für ihre technische Unterstützung mit Mäusen, Handhabung und Genotypisierung.

Alle Tiere wurden mit größter Sorgfalt, die Minimierung von Schmerzen oder Beschwerden während des Verfahrens behandelt. Dieses Verfahren folgt den Richtlinien der Tierbetreuung unserer Institution und die Lokalkomitees (Regierungspräsidium Darmstadt, Zulassungsnummer FK/1044) genehmigt wurde.
Abbildung 1zeigt eine schematische Darstellung der Arbeitsschritte für in Vivo Durchlässigkeit Assay bei Mäusen. Die Details der einzelnen Schritte werden im folgenden beschrieben.
1. Umgang mit Tier
<ol><li>
Erstellung und Verwaltung von Tracer und Anästhetika
	<ol>
<li>Gewebe einbetten mindestens einen Tag vor der Durchlässigkeit Assay bereiten Sie beschrifteten Rohre und Formen vor. Pflegen Sie sterile Bedingungen im gesamten Protokoll durch die Arbeit unter sauberen Abzug und Werkzeugen mit 80 % igem Ethanol gereinigt. Verwenden Sie männlich oder weiblich-Wildtyp (WT) oder Angiopoietin-2 (Ang-2) Gain of Function (GOF) CD1 Mäuse in der reife Erwachsene Altersgruppe von 3 bis 6 Monaten für das aktuelle Protokoll. Durchführen Sie Genotypisierung der Mäuse bereits 10beschrieben. Hinweis: 80 % Alkohol führt nicht sterilen Instrumenten aber minimiert Kontamination der Proben vorbereitet.</li>
		<li>Verdünnen Sie der Tracer in sterilen PBS in 2 mM Aktien zu und speichern Sie die Aliquote lichtgeschützt bei-20 ° C.</li>
		<li>Tracer wie (Tetramethyl Rhodamin) TMR und wählen (Fluorescein erfolgt) FITC mit unterschiedlichen Anregung/Emissionsspektren und das Lysin feststellbar, wodurch minimale Interferenzen zwischen der Farbstoffe durch Fluoreszenz-Mikroskopie (mit der TMR oder FITC filter bzw.) und von Fluorometry in einem Teller-Reader für die Durchlässigkeit Assay. Hinweis: TMR Dextran 3 kD FITC-Dextran 3 kD in der Studie verwendeten beide Lysin fixierbar und sind daher auch genutzt werden für immunhistochemische Analyse nach Fixierung mit Aldehyden um regionale Unterschiede zu untersuchen.</li>
		<li>Behandeln Sie alle Tiere mit größter Sorgfalt nach den Richtlinien der institutionelle Pflege. Injizieren Sie intraperitoneal jede Maus mit 100 µL Tracer-Lösung, die bis zu 200 µL erhöht werden kann, wenn eine zusätzliche Tracer kombiniert wird mit 100 µL jeder Tracer in 1:1 Mischung10,13. Mindestens ein Tier mit PBS anstelle der Tracer als Schein-Steuerung für Autofluoreszenz Hintergrundabzug dienen allein zu injizieren.</li>
		<li>5 min nach der Injektion des Tracers betäuben das Tier mit einer IP-Injektion von Ketamin und Xylazin (100 mg und 5 – 10 mg in 0,9 % Kochsalzlösung pro kg Körpergewicht Gewicht bzw. 150 µL des Cocktails pro 25 g-Maus). Hinweis: Vet Salbe wurde nicht angewendet auf Augen während des Verfahrens als der Zeitraum zwischen tierischen Anästhesie und Perfusion/Opfer kurz war (10 Minuten) wo Trocknung der Augen war nicht zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammlung und Herz-Kreislauf Durchblutung
	<ol>
<li>Bereiten Sie die Tiere für kardiale Perfusion 10 min nach der Narkose Verabreichung. Keine Pfote zucken Antwort zu überprüfen, um sicherzustellen, dass das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht.</li>
		<li>Die Tiere auf den Rücken legen und 80 % igem Ethanol auf die Haut der Bauchbereich auftragen. Mit einer kleinen Schere, eröffnen Sie die Bauchdecke mit einem kleinen Schnitt (2 cm) unterhalb des Brustkorbs. Trennen Sie Leber von der Membran zu und schneiden Sie dann langsam durch das Diaphragma hindurch Freilegung der pleural Raum 15.</li>
		<li>Schneiden Sie den Brustkorb bilateral und beheben Sie geschnittenen Brustbein zu, um die linke Herzkammer freizulegen. Nadel 21-Gauge Schmetterling verbunden zu einem peristaltischen Perfusion System in den hinteren des linken Ventrikels.</li>
		<li>Punktion der rechten Vorhof und schnell (innerhalb von 10 s) 200-300 µL Blut in die Brusthöhle mit 1 mL Pipettenspitzen (mit Ende Cut-off) veröffentlicht im Serum Röhrchen sammeln und speichern es auf dem Eis. Hinweis: Dieses Verfahren Perfusion ist nicht überleben.</li>
		<li>Sobald das Blut gesammelt wird, schalten Sie die Perfusion System (10-12 u/min, 5 mL/min) und durchspülen der Tier 3 min mit warmen (RT) 1 X PBS (frei von Ca2 + /Mg2 + -Ionen). Hinweis:PBS mit Ca 2 +/Mg2 + -Ionen können für bessere Herztätigkeit während der Perfusion genutzt werden. Der Gesamtbetrag der PBS zur Perfusion liegt im Bereich von 15-20 mL.</li>
		<li>Perfusion Qualität zu bewerten, mit der Feststellung, der Farbe der Leber, Nieren, die nach Perfusion weiß/blass erscheinen. Hinweis: Niere oder Leber Perfusion nicht notwendigerweise Brain Perfusion als die Arterien (a. carotis/Wirbelkörper) zu erreichen, die das Gehirn von Aorta während der Vorbereitung in Schritt 3 vor allem während der atrialen Punktion gerissen bekommen könnte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Gewebe Verarbeitung
<ol><li>Orgel-Datenerhebung und-Speicherung
	<ol>
<li>Bestätigen Sie am Ende der Durchblutung Tod des Tieres durch zervikale Dislokation und Ernte Gehirn und Nieren. Überprüfen Sie Gehirn Durchblutung durch die Farbe des Gehirns (ohne sichtbare Blut in Blutgefäßen der Hirnhäute), um die Tiere von der Durchlässigkeit Analyse auszuschließen, wenn Perfusion Qualität nicht gut ist. Trennen Sie das Gehirn in 2 Hemibrains mit einem Skalpell (Abbildung 1).</li>
		<li>Mit einem Skalpell ein Hemibrain frei von olfaktorischen Lappen und Kleinhirn zu sezieren Sie und übertragen Sie der Hemicerebrum auf einen 2-mL-Tube. Speichern Sie Hemi-Kleinhirn in eine Hilfsrohr, ggf. für zerebelläre Durchlässigkeit Bewertung.</li>
		<li>Übertragen Sie eine einzelne Niere auf ein weiteres 2-mL-Tube. Speichern Sie die Proben sofort auf Trockeneis.</li>
		<li>Betten Sie die verbleibende Niere und Hemi-Gehirn (bestehend aus dem Kleinhirn und olfaktorischen Lappen) in Tissue-Tek optimale Arbeitstemperatur (O.C.T) Verbindung auf Trockeneis nativ.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie schlussendlich die Blutproben auf Eis im Serum Röhrchen bei 10 000 g, 10 min bei 4 ° c gelagert Übertragen Sie Serum Überstände auf 1,5 mL Röhrchen und legen Sie sie in der Trockeneis-Container.</li>
		<li>Übertragen Sie alle Proben auf Trockeneis-80 ° C Gefrierschrank bis Weiterverarbeitung gesammelt. Hinweis: Es ist wichtig, die Proben vor der Homogenisierung Schritte als Homogenisierung Effizienzsteigerungen nach Einfrieren als Einfrieren Auftauen.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogenisierung und Zentrifugation
	<ol>
<li>Tauen Sie die Hemi-Großhirn und Niere Proben nach unten bei-80 ° C eingefroren auf Eis auf und wiegen Sie die Rohre mit den Organen. Subtrahieren Sie von diesen Gewichten den Mittelwert aus mehreren leere Rohre (ca. 20), die Gewebe zu bekommen. Fügen Sie 300 µL und 200 µL der Kälte 1 X PBS an den Rohren mit Niere und Hemi-Großhirn, beziehungsweise. Hinweis: für geringere Mengen von Gewebe (wie Hemi-Kleinhirn, unter 100 mg) wiegen die einzelnen Rohre wird empfohlen.</li>
		<li>Jede Probe in der ursprünglichen Eppendorf Tube zu homogenisieren, Polytetrafluorethylen (PTFE) zerstoßen eine elektrische Überkopf-Rührer (1, 000 u/min) mit ca. 15 Hübe ausführen befestigt (1 Hub = 1 nach oben und 1 unten). Spülen Sie der Stößel mit PBS zwischen Proben und trocknen Sie, bevor Sie fortfahren, die nächste Probe. Hinweis: Die Verwendung von Reinigungsmitteln während der Homogenisierung konnte aufgrund möglicher Interferenzen mit Fluorometry vermieden werden. Intrazelluläre Tracer ist jedoch auch in diesem Protokoll erkannt, da das Gewebe gründlich homogenisiert ist, das ist effizienter, nachdem eine Runde Einfrieren Auftauen.</li>
		<li>Speichern Sie die homogenisierten Proben auf Eis geschützt vor Licht und Zentrifuge alle zusammen am Ende 15.000 g, 20 min, 4 ° C in einer Tischplatte Zentrifuge. Übertragen Sie Überstände auf eine neue 1,5 mL-Tuben auf Eis für sofortige Fluorometry oder bei-80 ° C, später analysiert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszenzmessung und Quantifizierung
	<ol>
<li>Wenn am Ende des vorherigen Schrittes eingefroren, auf Eis Auftauen der Überstand und Serum Gewebeproben bei-80 ° c schützt sie vor Licht mit der Folie gelagert.</li>
		<li>Pipette 50 µL verdünnter Serum (30 µL 1 X PBS + 20 µL Serum) oder Gewebe Überstände (wie) in eine schwarze 384-Well-Platte. Gehören Sie mindestens eine Probe von Sham Tier für Serum und Gewebe Überstände um sicherzustellen korrekte Hintergrundabzug dieses Gewebe Homogenat Hintergrund normalerweise höher als die von PBS als das Verdünnungsmittel verwendet wird. Hinweis: Durchschnittlich 3 Schein Tiere Autofluoreszenz einsetzbar obwohl eine sehr wenig Variabilität in Sham Autofluoreszenz Werte (Daten nicht gezeigt) beobachtet wurde. Die Menge des Serums verwendet kann reduziert werden, durch das verdünnen es mit PBS, wodurch auch der Signal-Rausch-Verhältnis für Proben mit geringer Fluoreszenz wie die Gehirn-Muster erhöht werden kann. Bis zu 10 µL Serum wurde getestet mit 40 µL PBS verdünnen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in die Brunnen vorhanden sind.</li>
		<li>Stecken Sie die schwarze 384-Well Platte in der Platte Leser und öffnen Sie ein neues Skript Fluoreszenzmessung auswählen.</li>
		<li>Stellen Sie Gain auf optimale und Erregung / (nm) Emissionswerte von 550/580 oder 490/520 für TMR oder FITC Dyee bzw. und starten Sie die Messung um die rohen Fluoreszenz-Einheiten (Verwendungsempfehlungen) zu erhalten.</li>
		<li>Verwenden Sie roh Fluoreszenz-Einheiten (Verwendungsempfehlungen) aus dem Teller-Leser, um den Durchlässigkeit-Index (PI) nach Abzug der entsprechenden Schein-Werte zu berechnen.<ol>
<li>
* Durchlässigkeit Index (mL/g) = (Gewebe Verwendungsempfehlungen/g Gewebe Gewicht) / (Serum Verwendungsempfehlungen/mL Serum)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Beispielrechnung für Gehirn-Durchlässigkeit-Index (PI) des Tieres GOF1 (Tabelle 1):<ol>
<li>GOF1 des Gehirns Verwendungsempfehlungen - SHAM Gehirn Verwendungsempfehlungen = 154-22,5 = 131,5</li>
			<li>GOF1 Serum Verwendungsempfehlungen - SHAM Serum Verwendungsempfehlungen = 38305-27 = 38278</li>
			<li>Gehirn-Gewicht (g) = 0.195</li>
			<li>Serum-Volumen (ml) = 0,02</li>
			<li>Gehirn-Durchlässigkeit Index (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352 Hinweis: Die Durchlässigkeit Index Berechnungen liefern Werte, die absolute und zwischen Experimenten und Gewebetypen vergleichbar sind. Diese können jedoch als Kennzahlen für einfachen Vergleich zwischen 2 Gruppen 12präsentiert. Dies kann erreicht werden, indem man die PI jedes Tieres in beiden Gruppen mit der mittleren PI der Kontrollgruppe, fahren die Mittel der Kontrolle-Gruppe durch 1 noch halten die Inter-Tier-Variation in der Kontrollgruppe. Diese Transformation stellt Werte für die experimentelle Gruppe (oder Gruppen) im Vergleich zu der Kontrollgruppe auf 1 gesetzt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Immunfluoreszenz-Visualisierung von tracer
	<ol>
<li>Schneiden Sie die Niere/Hemi-Gehirn-Blöcke 10 µm Abschnitte auf einem Kryostat auf-20 ° C eingestellt und übertragen Sie die Abschnitte auf Folien platziert bei Raumtemperatur nativ in Tissue-Tek Verbindung (O.C.T) (Schritt 2.1) integriert. Sobald die Abschnitte (ca. 30 min) getrocknet werden, übertragen Sie Folien auf-80 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung.</li>
		<li>Am Tag der Färbung tauen Sie die Folien bei 37 ° C für 10 min auf, und befestigen Sie die Abschnitte mit 4 % Paraformaladehyde (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur, gefolgt von schnellen waschen mit PBS-Puffer.</li>
		<li>Inkubieren Sie in den Abschnitten Permeabilisierung/blockieren Puffer gemacht von sterilen PBS mit 1 % BSA und 0,5 % Triton x-100 pH 7,5 für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Folien für 1,5 h bei Raumtemperatur mit CD31 Primärantikörper inkubieren (0,5 mg/ml, Klonen MEC 13,3), in 1: 100 im Puffer mit sterilen PBS, 0,5 % BSA, 0,25 % Triton x-100 (pH 7,2) gefolgt von drei 5 min waschen in PBS verdünnt.</li>
		<li>Führen Sie Sekundärantikörper Inkubation in der oben genannten Puffer für 1 h bei Raumtemperatur mit artspezifischen Eindringmittel beschriftet Antikörper verdünnt 1: 500 (2 mg/mL). Für CD31 Ziege Anti-Ratte Alexa 568 oder Alexa 488 bei einer Verdünnung von 1: 500 einsetzbar. DAPI gehören (300 µM) in der Sekundärantikörper mischen (1:1, 000 Verdünnung aus dem Bestand) um für die Kerne färben.</li>
		<li>Montieren Sie die gefärbten Abschnitte mit Aqua Polymount und lasse es über Nacht für die Polymerisation bei Raumtemperatur in Dunkelheit.</li>
		<li>Erwerben Sie Bilder mit eine spektrale Bildgebung konfokale Laser-scanning Mikroskopsystem. Analysieren von Bildern durch NIS-Elemente-Software (Version 4.3). Software wie Photoshop kann zur Erzeugung von Montage Zahlen verwendet werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Funktionsstörung der Blut - Hirn-Schranke ist verbunden mit einer Reihe von neurologischen Erkrankungen, einschließlich primäre und sekundäre Hirntumoren oder Schlaganfall. BBB Aufschlüsselung ist häufig verbunden mit lebensbedrohlichen CNS Ödem. Daher ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die die Öffnung auslösen oder Schließung der BBB therapeutische Bedeutung bei neurologischen Erkrankungen und häufig von Forschern untersucht. BBB Permeabilität in Vivo in der Literatur beschrieben sind Methoden zu u...

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) besteht aus der mikrovaskulären Endothelzellen (ECs) unterstützt durch eng Perizyten (PCs), sind Ensheathed in der Basallamina und Astrozyten (ACs), die die Basalmembran mit den End-Füßen1 umhüllen ,2. ECs mit mehreren Zelltypen, die unterstützen und regulieren die Barrierefunktion, in erster Linie ACs und PCs interagieren und auch Neuronen und Mikroglia, alle zusammen die neurovaskuläre Einheit (NVU bilden). Die NVU ist entscheidend für die Funktion der BBB, was den Transport von Blut übertragene Giftstoffe und Erreger in das Gehirn gelangen begrenzt. Diese Funktion ist ein Ergebnis der engen Kreuzung Moleküle wie occludin, Claudin-5, Zonula Occludens-1, die zwischen ECs und auch durch die Einwirkung von Transportern wie p-Glykoprotein (P-Gp), dass Fluth Moleküle, die das Endothel geben Sie wieder anwesend sind das Gefäß Lumen1,2,3. Die BBB kann jedoch für den Transport von wesentlichen Moleküle wie Nährstoffe (Glukose, Aminosäuren, Eisen) durch spezifische Transporter zum Ausdruck auf den EC Plasmamembranen1,2,3. Die EG-Ebene ist in Bezug auf die Verteilung der verschiedenen Transporter zwischen der luminalen (Blut-Einfassung) und abluminalen (Gehirn gerichteten Membranen), um die spezifischen und vektorielle Transport Funktion4,5 ermöglichen stark polarisiert. . Während die BBB Schutzmaßnahmen in Bezug auf die streng regulieren das CNS-Milieu ist, ist es eine große Herausforderung für CNS Drug-Delivery bei Erkrankungen wie Parkinson mit einem funktionalen BBB. Auch bei neurologischen Erkrankungen mit BBB-Dysfunktion kann nicht davon auszugehen, dass die Gehirn-Drug-Delivery erhöht wird, zumal die Barriere Dysfunktion Schaden an den spezifischen Transporter Zielen wie zum Beispiel bei Alzheimer-Krankheit (AD) beinhalten könnte. N. Chr. mehrere Amyloid Beta-Transporter wie LRP1, RAGE, P-Gp sind bekanntermaßen Dysregulated und somit gezielt diese Transporter möglicherweise vergeblich6,7,8. Die BBB ist in verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie Schlaganfall, AD, Meningitis, Multiple Sklerose, und im Gehirn Tumoren9,10,11beeinträchtigt. Die Wiederherstellung der Barrierefunktion ist ein wesentlicher Bestandteil der therapeutischen Strategie und damit ihre Beurteilung ist entscheidend.
In dieser Arbeit haben wir beschrieben, einen objektiven und quantitativen Protokoll für Durchlässigkeit Assay bei Nagetieren, dass wir erfolgreich, mehrere Mauslinien beide transgene und experimentelle Krankheit Modelle10,12,13 angewendet ,14. Die Methode basiert auf einer einfachen intraperitoneale Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion der Mäuse, die Tracer aus dem vaskulären Fach zu entfernen. Gehirn und andere Organe sind gesammelte Post Perfusion und Durchlässigkeit anhand objektiver und absolute Permeabilität Index anhand der Fluoreszenz-Messungen der Gewebe Homogenates in einem Teller-Reader. Alle rohen Fluoreszenz-Werte werden korrigiert, für den Hintergrund mit Gewebe Homogenates oder Serum von Schein-Tiere, die keiner Tracer erhalten. Reichliche Normierungen sind bei Serum, Serum Fluoreszenz, und das Gewicht des Gewebes, so nachgiebig Durchlässigkeit Index, absoluter und vergleichbare zwischen Experimenten und Gewebetypen ist, im Preis inbegriffen. Für Vergleich zwischen Gruppen zu erleichtern können die absolute Permeabilität Indexwerte leicht Verhältnisse umgewandelt werden, wie wir zuvor12durchgeführt hatte. Gleichzeitig könnten gespeicherte Hemi-Gehirn und Niere für die Tracer Visualisierung durch Fluoreszenz-Mikroskopie10genutzt werden. Die klassischen Fluoreszenzmikroskopie kann wichtige regionale Unterschied in der Durchlässigkeit zu erhalten, wenn auch umständlich durch subjektive Auswahl von Gewebeschnitten und Bilder für eine semi-quantitative Analyse bilden. Die einzelnen Schritte werden im Protokoll vorgestellt und Noten werden bei Bedarf hinzugefügt. Dies bietet die notwendige Informationen für die Durchführung von in Vivo Durchlässigkeit Assay erfolgreich bei Mäusen, die auf andere Kleintiere skaliert werden können. Der Test kann auf viele Arten von Tracern angewendet werden ermöglicht die Ladung und die Größe Durchlässigkeit Bewertung durch eine Kombination von Tracern mit unterschiedlichen Fluoreszenz Spektren gestützt.

<table><tbody><tr><td>Tetramethylrhodamin (TMR) Dextran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanat (FITC) Dextran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketavet)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (Rompun)</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,9% Kochsalzlösung</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T Verbindung</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldhehyde Lösung</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>Herstellen einer 4% igen Lösung</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin, Fraktion V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti CD31 Antikörper, Klon MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratte für Ziegen Alexa 568</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratte für Ziegen Alexa 488</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molekulare Sonden</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Polymount</td><td>Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>21-Gauge-Schmetterlingsnadel</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>Serum Sammelröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>2mL Eppendorf Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Präzisionstücher</td><td>Tissuewischer Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384-Well-Schwarzplatte</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Superfrost plus</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-Stößel</td><td>Wheaton</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>elektrisches Überkopfrührgerät</td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 Spectral Imaging konfokales Laser-Scanning-Mikroskopsystem Nikon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>peristaltisches Perfusionssystem</td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

eine in vivo blut - hirn-schranke permeabilität assay bei mäusen mit gewebekulturen beschriftet tracer

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine spezialisierte Barriere, die das Gehirn Mikroumgebung von Giftstoffen und Krankheitserregern in der Zirkulation schützt und pflegt Gehirn Homöostase. Die wichtigsten Sehenswürdigkeiten der Barriere sind Endothelzellen der Gehirn-Kapillaren ergibt sich deren Barrierefunktion aus enge interzelluläre Verbindungen und Efflux-Transporter über die Plasmamembran zum Ausdruck gebracht. Diese Funktion wird durch Perizyten und Astrozyten, die zusammen die neurovaskuläre Einheit (NVU bilden) geregelt. Verschiedene neurologische Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit (AD), Hirntumoren eine Beeinträchtigung der BBB Funktion zugeordnet sind. Bewertung der BBB Permeabilität ist daher entscheidend bei der Bewertung der Schwere der neurologischen Erkrankung und den Erfolg der Behandlungsstrategien eingesetzt.
Wir präsentieren hier eine einfache, aber robuste Durchlässigkeit Assay, die auf mehrere Maus erfolgreich angewendet wurden sowohl genetische als auch experimentelle Modelle. Die Methode ist höchst quantitative und Objektive im Vergleich zu den Tracer Fluoreszenzanalyse Mikroskopie, die häufig angewendet wird. Bei dieser Methode werden Mäusen intraperitoneal mit einer Mischung aus wässrigen inert Fluoreszenz Tracer gefolgt von betäuben die Mäuse injiziert. Kardiale Perfusion der Tiere erfolgt vor der Ernte, Gehirn, Nieren oder anderen Organen. Organe sind homogenisiert und zentrifugiert, gefolgt von Fluoreszenzmessung von überstand. Blut aus der Herzpunktion kurz vor Perfusion dient zur Normalisierung soll das vaskuläre Fach. Die Gewebe-Fluoreszenz ist normiert auf die nassen Gewicht und Serum Fluoreszenz zu einer quantitativen Tracer Durchlässigkeit Index. Für zusätzliche Bestätigung sowohl der kontralateralen Hemi-Hirn für Immunohistochemistry bewahrt Tracer Fluoreszenz Visualisierung Zwecke einsetzbar.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass Angiopoietin-2 (Ang-2) Gain of Function (GOF) Mäuse höhere Gehirn vaskulären Permeabilität als Kontroll-Mäusen unter gesunden Bedingungen10 haben. Bei Schlaganfall-induzierte Mäusen war es auch zeigt, dass die GOF-Mäuse Infarkt größer und größere Durchlässigkeit als Kontrolle Wurfgeschwistern hatten. Diese Ergebnisse zeigen eine kritische Rolle von Ang-2 in Durchlässigkeit an der BBB. Das Protokoll daher verwendet die GOF-Mäuse und ...

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Permeabilität der Hirngefäße bei Mäusen mit fluoreszenzmarkierten Tracern zu bewerten, um die Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke in Tiermodellen zu beurteilen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Blut-Hirn-Schranke zu beantworten, die sich auf die neurovaskuläre Permeabilität bei Krankheiten und deren Wiederherstellung nach der Therapie beziehen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie einfach und quantitativ ist.Es bietet die Möglichkeit der gleichzeitigen Beurteilung der Permeabilität durch Fluorometrie, die quantitativ ist, sowie Fluoreszenzmikroskopie für regionale Abwehrmechanismen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose und Therapie verschiedener neurologischer Erkrankungen, einschließlich Hirntumoren, Schlaganfall und Alzheimer, da diese Krankheiten mit lebensbedrohlichen Hirnödemen und einer Verbesserung der MHD-Funktion als wichtiges therapeutisches Ziel verbunden sind. Einen Teil des Verfahrens wird Frau Jadranka Macas, eine Beauftragte für wissenschaftliche Technologie am Institut, demonstrieren.Intraperitoneal injizieren Sie Mäusen 100 Mikroliter zwei-millimolare Tracerlösung. Wählen Sie lysinfixierbare Tracer, wie z. B. Dextrane, die mit FITC und TMR markiert sind, mit unterschiedlichen Anregungsemissionsspektren für minimale Interferenzen zwischen den Farbstoffen. Wenn Sie Tracer kombinieren, injizieren Sie 200 Mikroliter kombinierte Tracerlösung intraperitoneal.Fügen Sie reine Fahrzeuginjektionen hinzu, die als Scheinkontrollen für die Autofluoreszenz-Hintergrundsubtraktion dienen. Warten Sie nach jeder Injektion fünf Minuten, bevor Sie die Mäuse gemäß den genehmigten institutionellen Protokollen tief anästhesieren. Bereiten Sie die Tiere 10 Minuten nach der Verabreichung des Anästhetikums auf die Herzperfusion vor.Überprüfen Sie, ob die Pfote nicht zuckt, um sicherzustellen, dass die Maus eine chirurgische Anästhesieebene erreicht hat. Legen Sie die zu perfundierende Maus auf den Rücken und tragen Sie 80%iges Ethanol auf die Haut des Bauchbereichs auf. Nachdem Sie mit einer kleinen Schere einen zwei Zentimeter großen Schnitt in die Bauchdecke gesetzt haben, trennen Sie die Leber vom Zwerchfell und schneiden Sie dann langsam durch das Zwerchfell, wodurch die Mehrzahl der Höhle freigelegt wird.Schneiden Sie den Brustkorb beidseitig auf und fixieren Sie das geschnittene Brustbein, um die linke Herzkammer freizulegen. Führen Sie eine 21-Gauge-Butterfly-Nadel, die mit einem peristaltischen Perfusionssystem verbunden ist, in den hinteren Teil des linken Ventrikels ein. Punktieren Sie den rechten Vorhof und verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze, bei der das Ende abgeschnitten ist, um die 200 bis 300 Mikroliter freigesetztes Blut schnell zu sammeln und in ein Serumsammelröhrchen zu übertragen.Bewahren Sie das gesammelte Blut auf Eis auf. Sobald das Blut entnommen ist, schalten Sie das Perfusionssystem ein und perfundieren Sie das Tier drei Minuten lang mit zimmerwarmem Calcium- und Magnesiumionen-freiem PBS. Beurteilen Sie die Perfusionsqualität, indem Sie die Farbe der Leber und der Nieren notieren, die nach der Perfusion blass erscheinen.Stellen Sie nach der Entnahme des Gehirns sicher, dass in den Gefäßen der Hirnhäute kein Blut sichtbar ist. Die Probe sollte von der Permeabilitätsanalyse ausgeschlossen werden, wenn die Perfusionsqualität schlecht ist. Verwende ein Skalpell, um das Gehirn in zwei Halbhirne zu teilen.Präparieren Sie dann das Kleinhirn und den Riechlappen von einem Hemihirn und übertragen Sie das Hemi-Großhirn in eine Zwei-Milliliter-Röhre. Legen Sie eine entnommene Niere in ein anderes Zwei-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie die Proben sofort auf Trockeneis.Betten Sie die verbleibende Niere und das Hemihirn mit intaktem Kleinhirn und Riechlappen nativ in die TissueTech-Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur ein und legen Sie sie auf Trockeneis. Nachdem Sie die Blutproben 10 Minuten lang bei 10.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, werden die Serumüberstände in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und in den Trockeneisbehälter gegeben. Übertragen Sie die Proben in den Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius, da die Homogenisierungseffizienz nach dem Gefrierauftauen zunimmt.Legen Sie die Hemi-Großhirn- und Nierenproben zum Auftauen auf Eis und wiegen Sie dann die Röhrchen mit den Organen. Von diesen Gewichten subtrahieren Sie den Mittelwert von ca. 20 leeren Röhrchen, um das Gewebegewicht zu erhalten. Geben Sie 300 Mikroliter kaltes PBS in das Röhrchen mit der Niere und 200 Mikroliter in das Röhrchen mit dem Halbhirn.Homogenisieren Sie jede Probe im Original-Mikrofugenröhrchen mit einem PTFE-Stößel, der an einem elektrischen Überkopfrührer befestigt ist, mit etwa 15 Hüben. Lagern Sie die homogenisierten Proben auf Eis und vor Licht geschützt. Spülen Sie den Stößel zwischen den Proben mit PBS ab und wischen Sie ihn trocken, bevor Sie mit der nächsten Probe fortfahren.Wenn alle Proben homogenisiert sind, zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei 15.000 g und vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation werden die Überstände in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis überführt, bevor mit der Fluoreszenzmessung und -quantifizierung fortgefahren wird. Übertragen Sie den Überstand auf eine 384-Well-Platte und setzen Sie die Platte in das Fluoreszenz-Reader ein.Stellen Sie sicher, dass die richtigen Anregungs- und Emissionswellenlängen für den Tracer enthalten sind, und stellen Sie die Verstärkung auf Optimal ein. Starten Sie die Messung und exportieren Sie die Daten als Tabelle, um die Berechnungen wie im Protokoll beschrieben durchzuführen. Tauen Sie am Tag der Färbung 10-Mikron-Kryostatenschnitte, die auf Objektträgern montiert sind, 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf.Fixieren Sie dann die Abschnitte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd und waschen Sie sie anschließend schnell in PBS. Permeabilisieren und blockieren Sie die unspezifische Bindung in den Schnitten, indem Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur in sterilem PBS mit 1 % PSA und 0,5 % Triton X-100 inkubieren. Nach der Blockierung inkubieren Sie die Objektträger mit einer Verdünnung von 1 zu 100 CD31-Primärantikörper für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur.Nach dreimaligem Waschen mit PBS für jeweils fünf Minuten ist eine einstündige Sekundärantikörperinkubation bei Raumtemperatur mit speziesspezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern durchzuführen. Montieren Sie die gefärbten Abschnitte mit Aqua-Poly/Mount und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln polymerisieren. Nehmen Sie schließlich Bilder mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopsystem mit spektraler Bildgebung auf.Um die Tracer-Zirkulationszeit für den Permeabilitätsassay zu ermitteln, wird eine lange Zirkulationszeit von zwei Stunden mit einer kurzen Zirkulationszeit von 15 Minuten nach der Tracer-Injektion verglichen. Die längere Zirkulationszeit von zwei Stunden führt zu einer geringen Akkumulation von Tracern in der Niere im Vergleich zu einer kurzen Zirkulationszeit von 15 Minuten, die möglicherweise auf eine hohe Clearance zurückzuführen ist, die in Grün dargestelltes FITC-Dextran aus dem Gefäßkompartiment darstellt. Im Gehirn ist dieser Effekt aufgrund der angespannten Blut-Hirn-Schranke noch dramatischer.Die CD31-Färbung im roten Kanal bestätigte das Vorhandensein von Gefäßen in der Niere zu beiden untersuchten Zeitpunkten und im Gehirn. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie innerhalb von fünf bis sechs Stunden an 10 Mäusen durchgeführt werden, wobei zwei Wissenschaftler im Tandem arbeiten. Beim Versuch dieser Technik ist es wichtig, daran zu denken, Tracer mit dem richtigen Molekulargewicht, Diagramm und Fluoreszenzeigenschaften zu verwenden, um die Fragen zur Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu beantworten.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie für MHD und Populationsfaktoren durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Schweregrad und Lokalisation der Krankheitsstelle zu beantworten.

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Dieses Video beschreibt einen Permeabilitätsassay zur Bewertung der Permeabilität der in vitro Blut-Hirn-Schranke mit Natriumfluoresceinmolekülen.

Assay zur Nachahmbarkeit der Blut-Hirn-Schranke: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Durchlässigkeit von BHS-Nachahmung gegenüber Tracermolekülen

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Beurteilung der Störung der Blut-Hirn-Schranke in einem EAE-Mausmodell. Fluoreszierende Farbstoffe unterschiedlicher Größe werden retroorbital injiziert und zirkulieren durch die Blutgefäße des Gehirns. Der kleinere Farbstoff dringt durch Lücken in das Hirngewebe ein, während der größere Farbstoff nur dann eintritt, wenn die Störung schwerwiegend ist, was mit dem Ausmaß der Barriereschädigung korreliert.

Bestimmung der Störung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen in einem EAE-Mausmodell

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

Eine Methode zur Etablierung eines in vitro Modells der Blut-Hirn-Schranke, die auf einer Co-Kultur von mikrovaskulären Endothelzellen und Astrozyten des Rattenhirns basiert, wird beschrieben und validiert. Dieses System erwies sich als ein valides Werkzeug, um die Wirkung der Nanoformulierung auf die Transbarriere-Permeation von fluoreszierenden Molekülen zu untersuchen.

In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

In dieser Studie stellen wir eine einfache und effiziente Verfahren zur Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke unter neurodegenerativen Erkrankungen. Um unser Ziel zu erreichen, wir infundiert hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet (FITC)-Albumin in Maus Jugular Ader und die Leckage in der Anwesenheit von Fluoreszenz-Mikroskopie bewertet.

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Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Drug targeting zu Tumoren des zentralen Nervensystems ist eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um eine in-vitro-Mimik der Blut-Hirn-Tumor-Schranke mit murinen und/oder menschlichen Zellen zu produzieren und ihre Relevanz für die Vorhersagbarkeit des zentralen Nervensystems Tumor targeting in vivo zu diskutieren.

Vorhersage In Vivo Nutzlasten Lieferung mit einem Blut-Hirnschranke Tumor in einer Petrischale

Im vorliegenden Protokoll wurde die endotheliale Barrierefunktion der submandibulären Drüse (SMG) durch Injektion verschiedener molekulargewichteter Fluoreszenztracer in die Winkelvenen von Versuchstiermodellen in vivo unter einem Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop bewertet.

Im lebenden Organismus Nachweis der vaskulären Permeabilität in der submandibulären Drüse der Maus

In der vorliegenden Studie wird Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes (FITC) Dextran Mäusen über eine orale Sonde verabreicht, um die Darmpermeabilität sowohl in vivo als auch in Plasma- und Kotproben zu bewerten. Da die Barrierefunktion des Darms bei vielen Krankheitsprozessen beeinträchtigt ist, kann dieser direkte und quantitative Assay in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden.

Beurteilung der Integrität der Darmbarriere bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran

Es wurde eine Methode entwickelt, um die Farbstoffextravasation aufgrund des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke (BHS) sichtbar zu machen, indem Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten zwei Fluoreszenzfarbstoffe verabreicht wurden. Die Verwendung von Glycerin als Kryoprotektivum erleichterte die Immunhistochemie an derselben Probe.

Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Dieses Protokoll stellt eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) im adulten Zebrafischmodell (Danio rerio) unter Verwendung von Evans blaufarbstoffbasierter Bewertung dar, die sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Analyse der neurovaskulären Störung ermöglicht.

Visualisierung des Torwächters: Evans auf blauem Farbstoff basierende Bewertung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke bei erwachsenen Zebrafischen

Lernen Sie eine quantitative Methode zur Bewertung der Blut-Hirn-Schranke-Permeabilität bei Mäusen mit fluoreszierenden Tracern. Diese Technik ermöglicht Forschern die Untersuchung neurovaskulärer Dysfunktionen.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

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