Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices

Das übergeordnete Ziel dieses dreidimensionalen Modells von menschlichen, präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten ist es, die Zytotoxizität und immunmodulatorische Effekte in einem ex vivo-Modell anhand von menschlichem Gewebe zu bewerten. Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Pharmakologie und Toxikologie zu beantworten, um die Sicherheit zu bewerten und die physiologische Reaktion auf Substanzen in der natürlichen menschlichen Umwelt zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir in der Lage sind, menschliche Atemwegserkrankungen in Bezug auf Zytotoxizität oder immunmodulatorische Wirkungen nachzuahmen, dank der Verwendung von frischem, lebensfähigem menschlichem Gewebe.

Obwohl diese Methode Einblicke in die menschlichen Zell-Zell-Interaktionen, die Physiologie und den Pathomechanismus geben kann, kann sie bei Atemwegserkrankungen auch für andere Anwendungen sowie für andere Spezies eingesetzt werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit der Organisation der Bewertung des menschlichen Gewebes und dem Aufbau einer zuverlässigen Infrastruktur haben. Darüber hinaus erfordert der Abfüllprozess aufgrund der Heterogenität der Lunge viel Training und Erfahrung.

Um diesen Eingriff zu beginnen, kanülieren Sie die Luftröhre, indem Sie den Silikonschlauch einführen und ihn mit einer Klemme parallel zum Schlauch fixieren, so dass die Klemme das Gewebe neben dem Silikonschlauch zusammendrückt, ohne ihn abzuklemmen. Verschließen Sie alle anderen Bronchien, Blutgefäße und Verletzungen mit Klammern, damit während des Füllvorgangs keine Agarose austreten kann. Gute anatomische Fähigkeiten sind erforderlich, um den Hauptbronchus zu kanülieren.

Die Lunge sollte nicht zu stark ausgedehnt werden, da sonst das Gewebe ablenkt, und wenn das Gewebe nicht ausreichend gefüllt ist, ist es unmöglich, PCLS zu machen, da das Gewebe zu weich ist. Dann wird ein äquivalentes Volumen von 3 % schwach gelierender Agarose mit Nährmedium in einem Becherglas gemischt. Träufeln Sie die Mischung mit einer 15-Milliliter-Spritze in die Lunge.

Bevor Sie die Spritze wieder mit Medium befüllen, klemmen Sie den Katheter mit den Fingern oder einer Klemme zu, um Luftblasen und Agarose-Reflux zu vermeiden. Schneiden Sie das Lungengewebe in drei bis fünf Zentimeter große Platten. Füllen Sie den Tissue Slicer mit 400 Millilitern eiskaltem EBSS.

Schneiden Sie sofort die zylindrischen Gewebekerne mit einem halbautomatischen Schraubendreher mit einem Entkernungswerkzeug aus den Lungenplatten heraus. Übertragen Sie anschließend die Gewebekerne in den Gewebehalter des Tissue Slicers. Legen Sie das Gewicht auf den Gewebekern und beginnen Sie, den Gewebekern in PCLS zu schneiden.

Das Medium sollte aus dem Tissue-Slicer in ein Becherglas abgelassen werden, indem die Klemme des Glaszylinders geöffnet wird. Übertragen Sie anschließend die Scheiben aus einem Becherglas in die Petrischale mit Nährmedium. Stellen Sie anschließend die Petrischale in einen Inkubator und lassen Sie das Medium vor den Waschschritten erwärmen.

Übertragen Sie dann die Lungenscheiben vorsichtig in eine 24-Well-Kulturplatte mit mindestens 500 Mikrolitern Kulturmedium für zwei Scheiben pro Well. Um einen Mastermix der Arbeitslösung herzustellen, verdünnen Sie 25 Mikroliter des WST-1-Reagenzes und 225 Mikroliter Medium für jede Vertiefung. Pipettieren Sie anschließend 250 Mikroliter der Mastermix-Arbeitslösung von WST-1 für jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Stellen Sie sicher, dass die PCLS während der Inkubation vollständig mit dem WST-1-Reagenz bedeckt sind. Stellen Sie anschließend die Platte auf einen Orbitalschüttler bei 200 U/min und schütteln Sie sie vorsichtig 30 Sekunden lang, um eine gründliche Durchmischung des WST-1-Reagenzes zu gewährleisten. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter des Überstands aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte in Duplikaten auf eine neue 96-Well-Platte mit flachem Boden.

Messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei 450 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader und subtrahieren Sie die Absorption bei 630 Nanometern von der bei 450 Nanometern. Nach der Inkubation des PCLS mit oder ohne Testmittel werden 50 Mikroliter Überstand in Duplikaten in eine neue 96-Well-Platte überführt. Dadurch werden Duplikate aus jeder behandelten Vertiefung einer 24-Well-Platte erzeugt.

Unmittelbar vor dem Assay wird ein Mastermix der Arbeitslösung aus LDH-freiem Wirkstoff hergestellt, indem 125 Mikroliter Katalysatorlösung mit 6,25 Millilitern Farbstofflösung für eine 96-Well-Platte gründlich gemischt werden. Pipettieren Sie dann 50 Mikroliter der Mastermix-Arbeitslösung in jede Vertiefung, die bereits 50 Mikroliter Überstand enthält. Inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Messen Sie anschließend die Absorption jeder Vertiefung bei 492 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader und subtrahieren Sie die Absorption bei 630 Nanometern Referenz von der bei 492 Nanometern. Führen Sie für die mikroskopische Bewertung mindestens zwei zufällig verteilte Z-Stapel mit dem cLSM durch. Klicken Sie auf die Registerkarte Okular, um ein 10-faches Objektiv auszuwählen.

Klicken Sie auf Online, um das cLSM als Standard-Lichtmikroskop zu verwenden und die Oberfläche von PCLS zu finden. Klicken Sie dann auf Offline, um die Okulareinstellung zu beenden. Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte Erfassung und aktivieren Sie die entsprechenden Laser für die Fluorophore.

Klicken Sie auf der Registerkarte Erfassung auf Lichtpfad und richten Sie die erforderlichen Filter und Spiegel für das Experiment ein. Drücken Sie die Live-Taste, um eine Live-Ansicht der entsprechenden Ebene auf dem Bildschirm anzuzeigen. Bewegen Sie den Fokus nach oben oder unten, um die Oberfläche des PCLS mit einem scharfen Signal zu finden.

Sie anschließend die Lochblende für den roten Ethidium-Homodimer-1-Kanal auf eine Lufteinheit ein, um den besten Kompromiss zwischen der Effizienz der Lichterfassung und der optischen Schnittbildung zu erzielen, und passen Sie den Calcein-Kanal entsprechend an. Erhöhen Sie das erkannte Signal der Verstärkung. Erhöhen oder verringern Sie den digitalen Offset, um den Hintergrund so anzupassen, dass er im Livebild mit aktivierter Kanalfarbsperrtabelle blau angezeigt wird.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Z-Stapel, um die obere und untere Grenze für das mikroskopische Volumen festzulegen. Verschieben Sie den Fokus langsam nach oben oder unten, bis der Bereich von 30 Mikrometern erreicht ist, und drücken Sie zum Speichern auf Letzte einstellen. Klicken Sie dann erneut auf Live, um das Live-Bild zu deaktivieren, und drücken Sie auf Experiment starten, um das Imaging zu starten.

Hier sind die mikroskopischen Viabilitätsbilder von PCLS zu sehen, die die Reaktionsfähigkeit des menschlichen Gewebes auf Detergenzien als wirksame toxische Substanz zeigen. Toxische Wirkungen werden visuell durch Bewertung von Calcein-positivem Gewebe im Vergleich zu Ethdium-Homodimer-1-positiven Zellkernen bewertet. Auch wenn die Lebensfähigkeit des menschlichen Lungengewebes von Spender zu Spender unterschiedlich ist, sollte die Anzahl der toten Zellkerne im Vergleich zu lebensfähigem Gewebe 15 % der Gewebekontrolle nicht überschreiten.

Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Daten für die immunmodulatorische Wirkung von Ammoniumhexachloroplatinat, einem SLS, auf menschliches Lungengewebe. Extrazelluläre und intrazelluläre IL-1 alpha und TNF-alpha wurden mittels ELISA bestimmt und auf den Gesamtproteingehalt normiert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern aus den Bereichen Pharmakologie und Grundlagenforschung den Weg, physiologische Reaktionen in lebensfähigem menschlichem Lungengewebe zu erforschen.

Nach diesem Verfahren können andere Endpunkte wie die Verengung der Atemwege durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. die Wirksamkeit des bronchodilatatorischen Arzneimittels. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes allgemeines Verständnis dafür haben, wie man präzise geschnittene Lungenschnitte für Menschen erzeugt und verarbeitet. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von sechs bis acht Stunden durchgeführt werden, wobei die ersten Ergebnisse innerhalb der ersten 24 Stunden vorliegen, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Vergessen Sie jedoch nicht, dass die Arbeit mit menschlichem, nicht fixiertem Material sehr infektiös sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. Schutzkleidung, getragen werden sollten. Darüber hinaus ist es wichtig, daran zu denken, so weit wie möglich unter sterilen Bedingungen zu arbeiten.