Kinetische Analyse der Vaskulogenese quantifiziert Dynamik der Vaskulogenese und Angiogenese In-vitro-

Das übergeordnete Ziel dieser experimentellen Methode ist es, den dynamischen Prozess der Vaskulogenese über die Zeit sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Angiogenese und Vaskulogenese über die Raten der Gefäßbildung und die Unterschiede zwischen den gebildeten Netzwerkstrukturmustern zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Quantifizierung einer großen Anzahl von Zeitpunkten der Vaskulogenese ermöglicht und damit die Möglichkeit bietet, die Kinetik des vaskulogenen Prozesses zu beurteilen.

Diese Methode kann auf jede Zellpopulation oder jeden pathologischen Zustand angewendet werden, der die Prozesse der Vaskulogenese oder Angiogenese beeinflusst, um einzelne Zellpopulationen oder Co-Kultursysteme zu untersuchen. Etwa ein bis zwei Stunden vor Beginn des Experiments heizen Sie einen Mikroskoptisch-Top-Inkubator auf 37 Grad Celsius vor und stellen Sie das Kohlendioxid auf 5 % und die Luftfeuchtigkeit auf 85 % ein. Füllen Sie den Feuchtigkeitsbehälter des Inkubators, wenn er leer ist. Setzen Sie die Lebendzellkammer auf das Mikroskop und platzieren Sie dann einen leeren Objektträger in einer der beiden offenen Positionen in der Lebendzellkammer.

Füllen Sie den Objektträger mit destilliertem Wasser und stellen Sie ein zweites Gebläse auf 39 bis 42 Grad Celsius ein, um die Objektträger von unten zu erwärmen und die Kondensation zu minimieren. Die Aufrechterhaltung der richtigen Temperatur und Luftfeuchtigkeit in der Bildgebungskammer für lebende Zellen ist entscheidend für den Erfolg des Experiments. Fügen Sie eine zweite Folie als Leerzeichen hinzu, bis die experimentelle Folie hinzugefügt werden kann.

Geben Sie dann Wasser in die Reservoirs, die die Brunnen auf dem zweiten Objektträger umgeben, um die Bedingungen während des Bildgebungsexperiments nachzuahmen. Um den Objektträger der Experimentierkammer mit Basalmembranmatrix zu bestücken, bestücken Sie zuerst eine 20-Mikroliter-Pipette mit einer kalten 20-Mikroliter-Pipettenspitze und schneiden Sie mit einer Schere etwa einen Zentimeter vom Ende der Spitze ab. Stellen Sie das Pipettenvolumen auf etwas mehr als 10 Mikroliter ein und saugen Sie die Matrize langsam in die modifizierte Pipettenspitze an.

Platzieren Sie die Pipettenspitze sofort in der Mitte einer Vertiefung des Objektträgers, berühren Sie die Spitze vorsichtig mit dem Boden der Vertiefung und drücken Sie den Kolben langsam zusammen, um die Matrize herauszudrücken. Nachdem Sie die Matrix zu allen 15 Vertiefungen hinzugefügt haben, schieben Sie den Deckel ganz auf den Objektträger. Das genaue und konsistente Pipettieren der Matrigel-Volumina in jede Vertiefung ist entscheidend für die Erzielung qualitativ hochwertiger Phasenkontrastbilder.

Legen Sie dann den Objektträger bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten neben eine konische 50-Milliliter-Röhrchenkappe, die mit zwei bis drei Millilitern PBS gefüllt ist, um die Dehydrierung der Matrix zu reduzieren. Wenn sich die Matrix verfestigt hat, entfernen Sie den Überstand aus einer über Nacht kultivierten endothelialen koloniebildenden Zellkultur und waschen Sie die Zellen mit sieben Millilitern PBS. Aspirieren Sie die PBS-Wäsche und lösen Sie die Zellen mit zwei bis drei Millilitern Trypsin bei 37 Grad Celsius für zwei bis fünf Minuten.

Dann resuspendieren Sie die dissoziierten Zellen in drei Millilitern Endothelial Growth Medium-2, um alle Zellklumpen aufzubrechen, und übertragen Sie die resultierende Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Nachdem alle endothelialen koloniebildenden Zellproben resuspendiert wurden, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in ein bis zwei Millilitern frischem endothelialem Wachstumsmedium. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in jeder Probe und geben Sie genügend endotheliale koloniebildende Zellen in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, um eine Verdünnung der Zellen auf 1,4 mal 10 bis 4 Zellen pro 175 Mikroliter mittlerer Konzentration zu ermöglichen.

Mischen Sie dann jeden Mastermix durch sanftes Pipettieren. Entfernen Sie den Objektdeckel und geben Sie 50 Mikroliter jedes Mastermixes pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung auf den Objektträger. Um die Zellen abzubilden, ersetzen Sie den leeren Objektträger durch einen experimentellen Objektträger und fügen Sie Wasser zu den Reservoirs hinzu, die die Zellen auf dem Objektträger umgeben.

Durchlaufen Sie jede Tischposition, und vergewissern Sie sich, dass die Mitte der ersten Vertiefung ausgewählt ist. Fokussieren Sie sich auf die Zellen, die in der Vertiefung plattiert sind, und legen Sie die Z-Position des Tisches fest. Wenn die Einstellungen korrekt sind, schalten Sie die Lichter aus, um das Bildgebungsexperiment zu starten.

Wenn das Imaging abgeschlossen ist, skalieren und exportieren Sie die Bildstapeldateien in der Image Capture-Software, und speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien zur Analyse. Um die Bilder zu analysieren, ziehen Sie die Datei "Kinetische Analyse der Vaskulogenese" aus ihrem Ordner in die graue Leiste am unteren Rand des Softwarefensters, um die Software zu öffnen, und klicken Sie auf "Speichern", um die Software zur Liste hinzuzufügen. Klicken Sie auf Datei und Öffnen, um die zu öffnende Bilddatei auszuwählen, oder ziehen Sie die Bilddatei in die graue Leiste in der Software.

Klicken Sie auf Bild, Anpassen und Helligkeit/Kontrast, um das Fenster Helligkeit/Kontrast zu öffnen. Klicken Sie im Fenster Helligkeit/Kontrast auf Zurücksetzen, um das Bild zu visualisieren. Klicken Sie dann auf Bild, Typ und 8-Bit, um die Bilder in 8-Bit zu konvertieren.

Wählen Sie Tools und Manager für Interessenbereich aus, und verwenden Sie ein entsprechend geformtes Auswahlwerkzeug, um einen neuen Interessenbereich zu erstellen. Klicken Sie auf Hinzufügen, um das Shape "Interessenbereich" zum Fenster "Interessenregion-Manager" hinzuzufügen, und klicken Sie im Interessenbereichs-Manager auf die Beschriftung "Interessenbereich", um den Bereich auf dem Bild anzuzeigen. Passen Sie den Interessenbereich nach Bedarf an.

Wenn der Bereich an seinem Platz ist, klicken Sie auf Bild und dann auf Zuschneiden, um das Bild zuzuschneiden. Öffnen Sie dann das Menü "Bearbeiten" und wählen Sie "Außenseite löschen", um die Bilddaten außerhalb des Interessenbereichs für jedes Bild im Stapel zu löschen. Öffnen Sie als Nächstes das Menü Plugins und wählen Sie das Plugin Analyze Network aus.

Verwenden Sie den Dropdown-Pfeil im Popup-Fenster, um die Schwellenwertmethode zu ändern, und klicken Sie auf OK, um die Softwareverarbeitung zu starten. Am Ende der Analyse werden eine Datentabelle und ein Stapel verschmolzener Bilder geöffnet, die Skelett- und Maskendarstellungen darstellen. Klicken Sie auf Datei und Speichern unter, um die numerischen Werte in eine Tabelle zu übertragen, und speichern Sie die Tabelle mit den Rohdatenwerten.

Klicken Sie auf das verschmolzene Skelett- und Maskenbild und speichern Sie den verschmolzenen Skelettmasken-Bildstapel und den zugeschnittenen Phasenkontrast-Bildstapel als TIFF-Dateien. Klicken Sie dann auf das Fenster "Region of Interest Manager", wählen Sie den Interessenbereich aus, der zum Zuschneiden der Bilder verwendet wurde, und klicken Sie auf Mehr und Speichern, um den Interessenbereich für die zukünftige Verwendung zu speichern. Endotheliale koloniebildende Zellnetzwerke, die durch die kinetische Analyse der Vaskulogenese identifiziert wurden, werden bildhaft als Skelett- und Maskendarstellungen dargestellt, um die Strukturen zu veranschaulichen, die von der Software zur Quantifizierung verwendet werden.

Wenn die Qualität der Phasenkontrastbilder hoch ist und ein ausreichender Kontrast erreicht wird, identifiziert die kinetische Analyse der Vaskulogenese endotheliale koloniebildende Zellnetzwerke genau, wie die beobachteten Ähnlichkeiten zwischen dem Phasenkontrastbild und der kinetischen Analyse der durch Vaskulogenese erzeugten Skelett- und Maskendarstellungen zeigen. Wenn Phasenkontrastbilder keinen hohen Kontrast aufweisen oder wenn Bildgebungsartefakte wie Gridding auftreten, wird die Genauigkeit der Netzwerkerkennung verringert und die Ergebnisse werden mehrdeutig. Verschiedene Schwellenwertmethoden, wie z. B. Mittelwert und Otsu, die hier gezeigt werden, können jedoch vor der Analyse im Dropdown-Menü der Software ausgewählt werden, um Unterschiede in der Bildqualität auszugleichen.

Die Verwendung der kinetischen Analyse der Vaskulogenese, um festzustellen, ob gestationsdiabetes mellitus exponierte endotheliale koloniebildende Zellen eine veränderte Kinetik der Netzwerkbildung aufweisen, zeigt eine heterogen veränderte Netzwerkstrukturbildung in gestationären Diabetes mellitus-Kulturen im Vergleich zu endothelialen koloniebildenden Zellkulturen aus einer unkomplizierten Schwangerschaft. In der Tat bilden unkomplizierte Schwangerschaftsproben in der Regel eine größere Anzahl geschlossener Netzwerke als Proben von Schwangerschaftsdiabetes mellitus. Alle endothelialen koloniebildenden Zellproben zeigen jedoch insgesamt ein biphasisches Muster der Netzwerkbildung, obwohl die Bildungsraten und die maximale Anzahl der erreichten Netzwerke zwischen den Proben variieren.

Nach diesem Verfahren können die durch die kinetische Analyse der Vaskulogenese generierten Datenwerte grafisch dargestellt und analysiert werden, um festzustellen, ob die von den verschiedenen Proben gebildeten Netzwerkstrukturen statistisch unterschiedlich sind und wenn ja, zu welchen Zeitpunkten. Die kinetische Analyse der Vaskulogenese ermöglicht die effiziente Verarbeitung von Zeitrafferexperimenten mit einer großen Anzahl von Bildern. Nach der Beherrschung können die Bilderfassung, Nachbearbeitung und Analyse in zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn alle Systeme ordnungsgemäß funktionieren.