Name: Kinetische Analyse der Vaskulogenese quantifiziert Dynamik der Vaskulogenese und Angiogenese In-vitro- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Lernen Sie die kinetische Analyse der Vaskulogenese für quantitative Bewertung von Gefäßbildung in vitro. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Endothelzellen und verschiedenen experimentellen Bedingungen.

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Die Autoren erkennen Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Munder, Matthew Repass und Emily Sims (Angio BioCore an der Indiana University Simon Cancer Center) für ausgezeichnete technische Unterstützung bei der Ableitung ECFC Proben. Die Autoren erkennen auch DRS. Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder und Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) wissenschaftlichen Diskussion sowie Janice Wände (Indiana University School of Medicine) für administrative Unterstützung. Alle Bildgebung wurde an der Indiana-Zentrum für biologische Mikroskopie, Indiana University School of Medicine durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 und U10-HD063094) und der Riley Children Foundation unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Publikation mit teilweiser Unterstützung vom National Heart, Lung und Blut-Institut von der National Institutes of Health unter Award # T32 HL007910 möglich.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

KAV ermöglicht Auswertung großer Datenmengen mit mehreren Zeitpunkten Traditionell bestand Quantifizierung der Vaskulogenese in Vitro eine Single oder ein paar Mal Punktmessungen. Diese statische Methode ist schlicht ungenügend für die Erfassung und Quantifizierung einen dynamischen und komplexeren Prozess. Daher wurde diese neuartige Methode entwickelt, um effiziente Analysen des Netzwerk Bildung Kinetik Einblick in mögliche molekularen Mechanismen des dynamischen Prozesses der Vaskulogenese zu ermöglichen. Effizienz und Automatisierung sind wichtige Bestandteile bei der Entwicklung neuer Techniken zur Erzeugung und Analyse von großen Mengen an Bilddaten. KAV wurde entwickelt, speziell um großes Bild Stapel bestehend aus Hunderten von Bildern, die Zeit und Arbeitsaufwand biologisch sinnvolle Schlussfolgerungen aus Zeitraffer Datensätzen ableiten senken zu analysieren. Vor allem KAV führt Bildverarbeitung und Datengenerierung in einer Angelegenheit von Sekunden für kleine (weniger als 100 Bilder) image-Stacks und Minuten für größere (mehr als 100 Bilder) Bild-Stapel, beispiellose Effizienz führt. Darüber hinaus ermöglicht die Organisation der Daten in Tabellenkalkulationen von Zeit und gemessenen Parameter schnelle Erzeugung von grafische Darstellung und statistische Analyse.
Herausforderungen bei der erfolgreichen Anwendung dieses Ansatzes Obwohl dieser Assay Verbesserungen zur Bildaufnahme und Analyse enthalten sind, können einige Herausforderungen erfolgreiche Umsetzung behindern. Die vier Haupthindernisse sind Luftfeuchtigkeit Stabilität, Timing Präzision von Beschichtung zur Bildaufnahme, Software und Hardwarezuverlässigkeit und Verwaltung großer Datenmengen erzeugt für jedes Experiment. Stabil live Cell Imaging über mehrere Stunden kann schwierig sein. Insbesondere ist angemessen und konsequent Befeuchtung für die Bildgebung Kammern erforderlich. In diesem Assay, eignen sich für Matrix-basierte Angiogenese-Assays parallelisieren Angiogenese Folien eingesetzt. Ihre geringe Volumen, ca. 50 µL macht Verdampfung und Kondensation wichtige Überlegungen zur erweiterten Kulturbedingungen. Um dieses experimentelle Problem zu bekämpfen, ist es notwendig, einen Inkubator zu verwenden, der Feuchtigkeit reguliert. Allerdings kann es auch sein erforderlich, um diese Verordnung zu erweitern, wenn übermäßiges Trocknen der bildgebenden Kammer im Laufe der Zeit auftritt. Wir fanden, dass die einfachste Methode zur Erhöhung der Luftfeuchtigkeit ist Wasserfläche in der Kammer zu erhöhen. Um dieses Ziel zu erreichen, schlägt unser Protokoll die folgenden drei Wasserquellen: eine zweite Kammern Folie gefüllt mit Wasser, die auch bei die Brutkasten Temperatur gemessen wird, Wasser in der Gegend um den Brunnen auf den Folien und benetzte Filterpapier oder wischt. Umgekehrt tritt Kondensation, wenn die Lufttemperatur im Raum unten auf die Folie kühlt und die Feuchtigkeit im Inneren der Kammer auf den Folien und den Brunnen kondensiert. Diese Komplikation kann führen zu einer Verwässerung der Zelle Medien und ein Linseneffekt, die mit dem Phasenkontrast stört. In diesen Studien wurde durch Anwendung der erwärmten Luft (39-42 ° C) auf die Unterseite der Folie Kondenswasser minimiert.
Ein entscheidendes Kriterium für eine Zeitraffer-Studie ist die Konsistenz zwischen Experiment Einleitung und Bildgebung. Das Timing der Bildgebung beim Starten ist entscheidend für Interpretation der nachgeschalteten Ereignisse. Um die Präzision Timing des Assays zu gewährleisten, sollte die Zeit zwischen den ersten Beschichtungs- und der erste Zeitpunkt der abgebildeten streng kontrolliert werden. In der Praxis dieses "Totzeit" minimiert werden, aber noch wichtiger ist, es muss konsequent, Experimente an verschiedenen Tagen verglichen werden können. Zum Beispiel erwarten wir in diesem Protokoll eine Totzeit von etwa 30 Minuten. Dies kann durch die Nähe der experimentellen Vorbereitung und imaging-Einrichtungen erleichtert werden.
Was mag wie banalen Details auf den ersten Blick für Software, Hardware-Stabilität und Datenmanagement wichtig sind. Software und zugehörige Hardware-Treiber, Netzwerk-Umgebung und automatisierte Software-updates alle beeinflussen die Stabilität der Software. Es lohnt sich dieses Testprotokoll in ein "Dry Run" zu identifizieren Sie Engpässe und mögliche Ursachen für Probleme in der Bildaufnahme; zum Beispiel für unzuverlässig live Zelle Setup, Bühne, Auslöser und Kamera Zuverlässigkeit und institutionellen Informationspolitik Technologie auf automatisierte Betriebssystem und Software-Updates überprüfen.
Datenmanagement ist ein ständiges Anliegen jedes imaging Experiment, das Hunderte oder Tausende von Bildern erzeugt. Zum Glück sucht kommerzieller Software oft verfügbaren Platz vor dem Start ein imaging Experiment. Dieser Test umfasst aber auch Post-Capture-Bildverarbeitung und Analyse, die die Festplatte Platz Last hinzufügen und stören mit imaging-Experimente, wenn der verfügbare Speicherplatz begrenzt ist. Darüber hinaus können die Sicherheit und Stabilität des Computers, auch mit Hardware-Lösungen wie z. B. eine redundante Festplattenarray identisch garantiert werden. Somit ist eine Daten-Management-Strategie darauf Platz auf den Festplatten für laufende Experimente und eine robuste Fernbedienung Archivierung, zum Beispiel mit einer institutionellen Archivierung Ressource erforderlich.
Strategien zur Maximierung der Bildqualität Obwohl die Fähigkeit des KAV, genau ECFCs aus dem Matrix Hintergrund erkennen robust ist, richtet sich die Empfindlichkeit des Tests auf die Bildqualität. Hat das Bild geringen Kontrast, wird die Software beispielsweise Zelle Netzwerke mit geringerer Genauigkeit (Abbildung 2B) erkennen. Die Qualität der Phasenkontrast wird von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Einstellungen des Mikroskops zur Bildaufnahme, beeinflusst von der Matrix und die Zelle Aussetzung Medien während der Assay-Erstellung und Pflege von medialen Ebenen innerhalb der Brunnen laden in der gesamten Bildgebung. Zur Optimierung der Phasenkontrast für diese Assays wurden kleinere Anpassungen an Ring Phasenanpassung im Mikroskop Kontrast zu verbessern. Darüber hinaus wurde Probenvorbereitung rigoros getestet, um gleich und konsequente Medien laden zu gewährleisten. Wenn der Betrag der Matrix und/oder Druckmedien in die Vertiefungen unterhalb oder oberhalb des optimalen Bereichs ist, kann ein Meniskus führt zu veränderten Phasenkontrast bilden. Schließlich ist es aufgrund des geringen Volumens der Flüssigkeit in den Vertiefungen, entscheidend für Medien Niveau zu halten, durch die Minimierung der Verdampfung und Kondensation, wie oben erwähnt. Insgesamt ist Assay Optimierung kritischer Kontrast Bilder in hoher Qualität für die Analyse zu generieren.
Neben der Phase Kontrast Qualität können andere Faktoren auch Assay-Ergebnisse einschließlich der Medien Verunreinigung, Mängel in der Matrix, und Partikel oder Schmutz in die Matrix oder Medien auswirken. Kontamination ist eine Gefährdung des Assays, denn es geht um live Cell Imaging über mehrere Stunden in einer Mikroskopie-Kammer. Um das Risiko einer Kontamination zu reduzieren, sind die Matrix und Zelle Aufhebungen auf der Folie in eine sterile Haube geladen. Darüber hinaus ist jede Probe in der Regel doppelt oder dreifach für ein Experiment zur Minimierung des Risikos von Datenverlust aufgrund von unvorhergesehenen Problemen wie Schmutz oder Partikel Störfaktoren die Analyse plattiert.
Probe Heterogenität Laufwerke müssen für erhöhte Assay Empfindlichkeit Heterogenität beobachtet und berichtet in früheren Studien von ECFCs, GDM13ausgesetzt. Ein hohes Maß an Heterogenität in der Zelle Funktion in diesen Proben beobachtet wird spekuliert, um darauf zurückzuführen sein, mehrere Faktoren, die Schwere der mütterlichen Erkrankung, Dauer der Krankheit und Management-Stil verwendet, um den Blutzuckerspiegel zu regulieren. Wichtig ist, fängt dieser analytischen Ansatz der dynamischen Bereich ECFC Vaskulogenese, so dass es möglich ist, phänotypische Unterschiede aufgrund der funktionalen Heterogenität in Proben von GDM Schwangerschaften zu identifizieren. Insgesamt kann die Verwendung von primären Patientenproben, wie Sie in diesen Studien, größere Variabilität im Vergleich zu einer Zelllinie einführen. Als stärker auf translationale Studien mit mehreren primären tierischen oder menschlichen Proben mit funktionellen Variabilität gelegt wird, unbedingt Assay Sensitivität für die Erkennung und Ableitung von biologisch sinnvolle Messungen und Schlussfolgerungen. Aus diesem Grund generiert Entwicklung von Ansätzen wie KAV die Quantität und Qualität der Daten verbessert werden durch in-vitro- Vaskulogenese und Angiogenese Assays damit robuster Beobachtungen und Schlussfolgerungen. Außerdem erleichtert diese Daten zukünftige Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die zu veränderten ECFC Vaskulogenese nach intrauteriner GDM-Exposition beitragen.
Zukünftige Anwendungen dieses Ansatzes Obwohl diese Methode angewendet wurde, um fetale ECFC Vaskulogenese in Vitro in diesen Studien zu bewerten, sind die Einsatzmöglichkeiten dieses Ansatzes zahlreich. Diese Technik kann leicht implementiert werden, um jede Zellpopulation zu studieren, die in den Prozessen der Vaskulogenese oder Angiogenese beteiligt ist. Speziell, es kann verwendet werden, um einzelne Zellpopulationen zu studieren, wie in dieser Studie zeigte, aber es könnte auch zu Kokultur Systeme angewendet werden. In Zukunft wäre es vorteilhaft, diesen Ansatz über die zweidimensionale in Vitro Assay dreidimensionale (3D) Modelle beurteilen zu erweitern. Obwohl die aktuelle Version von KAV für Quantifizierung 3D Bilddaten nicht ausreichen würden, wäre ein ähnlich gestaltete Zeitraffer, multiparametrischen analytische Ansatz speziell für 3D oder in Vivo Modelle informieren, wenn in zwei Dimensionen Beobachtungen in Vitro sind Vertreter der Zellfunktion in eine mehr biologisch relevante Einstellung.

Die Fähigkeit der endothelialen Vorläuferzellen, Vaskulogenese, oder de Novo Schiff Bildung zu unterziehen ist kritisch embryonalen Gefäßsystem zu etablieren, während der Entwicklung1. Darüber hinaus ist weitere Schiff Bildung und Reifung der bereits vorhandenen Schiffe, die als Angiogenese bezeichnet wird, auch ein Schlüsselprozess in Entwicklung und postnatale Leben, Durchblutung und Homöostase im gesamten Körper2zu erhalten. Jedes Organ im Körper ist das Gefäßsystem für die Lieferung von Sauerstoff und Nährstoffen und für die Beseitigung von Abfall3abhängig. Vaskuläre Homöostase ist nicht gepflegt, so dass Blutgefäß-Bildung und Reparatur entweder unzureichend oder im Übermaß sind, können Gefäßerkrankungen4führen. Daher werden vaskulären Bildung und Anpassung häufig untersucht, wie sie unerlässlich bei der Aufrechterhaltung der Organgesundheit sind und sind in die Entwicklung der zahlreichen pathologische Staaten involviert.
Wegen einem besseren Verständnis der Beteiligung des Gefäßsystems in Entwicklung, sowie bei Manifestation der Krankheit und dem Fortschreiten entwickelten Assays Modell Vaskulogenese und Angiogenese in Vitro und in Vivo5 ,6,7. Modellieren Schiff Bildung umfasst das Plattieren vaskulärer Zellen, wie Endothelzellen in Basalmembran-Matrix, die Zelle Organisation und Bildung von Schiff Netze8,9,10fördert. In der Regel folgende Übernachtung Inkubation, Bilder der Zelle, die Netze zu einem einzigen Zeitpunkt, führt eine kleine Anzahl von Bildern zur Analyse11,12,13erfasst werden. Daher wurden für einzelne Zeitpunkt Bewertungen10,14analytische Ansätze weitgehend entwickelt und optimiert. Jedoch statische Analysen sind einfach nicht ausreichend zur Erfassung des dynamischen Prozesses der Gefäß-Bildung und begrenzten Einblick in mögliche Mechanismen beteiligt. Obwohl immer häufiger bildgebende wahrscheinlich die notwendigen Daten zur Bildung Kinetik zu erkennen geben würde, wäre Anwendung der zuvor entwickelten Analytics zu einem Multi-Zeit Punkt imaging Ansatz ineffizient und arbeitsintensiv intensive14. Darüber hinaus macht trotz Entwicklung der kommerziell verfügbaren Analysen, eine Gebühr zahlen pro Bild diese Option für kinetische Untersuchungen, in denen Tausende von Bildern erzeugt15sind, kostspielig. Deshalb müssen in das Feld für einen schlanken und effizienten Ansatz zu erfassen und zu quantifizieren, Vaskulogenese in Vitro, einschließlich der Fähigkeit, große Bildsätze erzeugte Zeitraffer live Zelle Mikroskopie zu analysieren.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein neues Konzept entwickelt, mit dem Ziel der Erweiterung einzigen Zeitpunkt Bildgebung ermöglichen dynamische Beurteilung der Vaskulogenese mit Bilder alle 15 min16erworben. Durch die Erfassung von mehreren Zeitpunkten über mehrere Stunden, stellt dieser Ansatz eine detailliertere Darstellung des Prozesses der Vaskulogenese, sowie einen Einblick in mögliche Mechanismen, die einen Beitrag zur Bildung und Erhaltung des Schiffes Netzwerke. Dieser Ansatz beinhaltet neben der Verbesserung der Häufigkeit und Qualität der Bildaufnahme, neuartige Software in Form von einem Open-Source-Plug-in17. Die Software, bezeichnet als kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV), ist eine optimierte Anwendung, die Bildverarbeitung und Analyse speziell für großes Bild-Sets aus mehreren Zeit-Punkt Akquisitionen generiert enthält. KAV analysiert Phase kontrastreiche Bilder durch Bild Segmentierung gefolgt von Skelettierung18. Zehn Parameter der Netzwerkstruktur durch KAV quantifiziert sind unter anderem: Zweige, geschlossene Netze, Knoten, Netzbereiche, Netzwerkstrukturen, dreifach verzweigten Knoten, Quad verzweigte Knoten, total Astlänge, durchschnittliche Astlänge und Ortsverbandes Knoten-Verhältnis (siehe schematisch in Abbildung 1)16. Anwendung des KAV-Konzepts enthält einen neuartigen, berechnete Phänotyp von in-vitro- Vaskulogenese, als der Zweig Knoten-Verhältnis bezeichnet. Unsere aktuelle Arbeiten gezeigt, dass dieses Verhältnis bezeichnend für Netzwerk-Konnektivität ist und andere zelluläre Prozesse, Netzwerkbildung, z. B. Motilität16zugeordnet werden.
Obwohl fetalen Endothelzellen koloniebildenden Zellen (ECFC) Vaskulogenese in diesen Studien beurteilt wurde, kann dieses Bild-Erfassung und Analyse-Ansatz ohne weiteres angewendet werden, um alle Zelltypen zu bewerten, die Vaskulogenese oder Angiogenese zu unterziehen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verwendet werden, um veränderte Gefäßfunktion, die aus einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, wie gestational Diabetes Mellitus zu identifizieren, wie in diesen Studien gezeigt. Darüber hinaus könnte diese Methode bewerten, Netzwerkbildung und Verzweigungen, die wichtig sind für andere biologisch relevante Prozesse angepasst werden. So ist die potenziellen Auswirkungen der Anwendung dieser neuartigen Ansatzes auf einzigartige biologische Systeme noch nicht ermittelt werden.

<table><tbody><tr><td>100 mm Gewebekulturplatten</td><td>Fisher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>1495949B</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenese 15-Well-Mikro-Objektträger</td><td>Ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher (Corning)</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 Medium</td><td>Lonza</td><td>CC3162</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>PSA Antimymyzytär, Antibiotikum</td><td>Fisher MT30004C1</td><td></td><td>Zugabe von 5 ml pro 500 ml Flasche EGM2-Medium.</td></tr><tr><td>0,5 % Trypsin/0,53 nM EDTA in HBSS</td><td>Fisher (Corning)</td><td>MT25052CI</td><td></td></tr><tr><td>Typ 1 Kollagen</td><td>Fisher (Corning)</td><td>354226</td><td>100 mg Flüssigkeit, Konzentrationsbereich 3-4 mg/ml. In 20 nM Essigsäure in ddH2O verdünnen, um es bei einer Endkonzentration von 0,05 mg/ml zu verwenden.</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td>Wird in Kollagenlösung Typ 1 in einer Endkonzentration von 20 nM verwendet.</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger mit Kammer</td><td>Ibidi</td><td>80296</td><td>Dieser Objektträger kann mit destilliertem Wasser gefüllt werden, um die Feuchtigkeit in der Bildgebungskammer aufrechtzuerhalten.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Fisher</td> <td>(Gibco)</td><td>20012027</td><td>1x Lösung, pH 7,2</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53100 und MEF55030</td><td>Motorisiertes TiE inklusive Ph1-Phasenring für Phasenkontrast mit</td></tr><tr><td>Objektivtisch</td><td>Prior Instruments</td><td>ProScan II</td><td>Andere OKOlab und Nikon Elements AR-kompatible Tische können verwendet werden</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Nikon Instruments</td><td>93178</td><td>CFI Plan Fluor DL 10X</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U</td><td>ORCA Flash 4.0LT</td></tr><tr><td>Tischgebläse</td><td>Präzisionssteuerungen</td><td>N/A</td><td>Dieser Artikel wurde nicht mehr hergestellt, Alternativen sind Smart Air-Therm Heizung (AIRTHERM-SMT-1W) von World Precision Instruments</td></tr><tr><td>Stage-top Inkubator&nbsp;</td><td>OKOLabs</td><td>H301</td><td>BoldLine mit einem Computer</td></tr><tr><td></td><td>Hewlett-Packard</td><td>Z620 mit zwei Positionen oder einem gleichwertigen</td><td>4-Kern-Intel Xeon-Prozessor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro Grafikkarte&nbsp;</td></tr><tr><td>Nikon Elements Software</td><td>Nikon Instruments</td><td>AR v 4.20</td><td>ND Acquisition ist ein mehrdimensionales Setup-Tool, das zur Konfiguration der Elements-Software verwendet wird.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ) Software</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kostenlose, quelloffene Software, die unter folgender URL online heruntergeladen werden kann: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td></tr><tr><td>KAV Plug-In</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kostenlose, quelloffene Software, die unter folgender URL online heruntergeladen wird: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis</td></tr></tbody></table>

kinetische analyse der vaskulogenese quantifiziert dynamik der vaskulogenese und angiogenese in-vitro-

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vaskulogenese ist ein komplexer Prozess, der durch den Stamm- und Vorläuferzellen Endothelzellen de Novo Schiff Ausbildung unterziehen. Quantitative Bewertung der Vaskulogenese ist eine zentrale Auslesen der endothelialen Vorläuferzellen Zellfunktionalität geworden, und daher wurden mehrere Versuche unternommen, in Vitro und in Vivo Vaskulogenese Modelle zu verbessern. Allerdings sind Standardmethoden, mit statischen Messungen nicht zu viele Aspekte dieses hoch dynamischen Prozesses erfassen eingeschränkt. Daher war das Ziel der Entwicklung dieser neuartigen Protokoll zur Bewertung der Kinetics von in-vitro- Vaskulogenese um quantitate Preise der Netzwerkbildung und Stabilisierung sowie Einblick in mögliche Mechanismen, die vaskuläre Dysfunktion. Anwendung dieses Protokolls wird demonstriert mit fetalen Endothelzellen koloniebildenden Zellen (ECFCs), mütterlichen Diabetes Mellitus. Fetale ECFCs wurden abgeleitet aus Nabelschnurblut nach der Geburt, kultiviert und vergoldet in Folien mit Basalmembran Matrix, wo sie Vaskulogenese unterzogen. Bilder der gesamten Folie Brunnen wurden aufgenommen mit Zeitraffer Phasenkontrastmikroskopie über 15 Stunden. Bilder wurden zur Ableitung von quantitativen Daten mithilfe einer Analysesoftware namens kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV) analysiert. KAV verwendet Bild Segmentierung gefolgt von Skelettierung Netzwerkkomponenten aus Stapeln von Multi-Zeit Punkt Kontrast Phasenbilder abzuleiten zehn Parameter (9 gemessen, 1 berechnet) des Netzwerk einschließlich der Struktur zu analysieren: Netzwerke, Netzbereiche, geschlossen Knoten, Zweige, total Astlänge, durchschnittliche Astlänge, dreifach verzweigten Knoten, Quad verzweigte Knoten, Netzstrukturen und Ortsverbandes Knoten-Verhältnis. Anwendung dieses Protokolls identifiziert verändert Preise der Vaskulogenese in ECFCs von Schwangerschaften, die durch Diabetes Mellitus kompliziert erhalten. Diese Technik hat jedoch große Auswirkungen würde den Rahmen sprengen, hier berichtet. Umsetzung dieses Ansatzes fördert die mechanistische Bewertung und Verbesserung der funktionellen Auslesen Vaskulogenese und anderen biologisch wichtigen Verzweigung Prozesse in zahlreichen Zelltypen oder Krankheitszustände.

KAV erzeugt visuelle Darstellungen der Netzwerkstruktur Der Kontrast zwischen der ECFCs und der Matrix Hintergrund in die Phasenbilder Kontrast ermöglicht KAV, zellspezifische Strukturen zu identifizieren. ECFC Netzwerke von KAV identifiziert vertreten sind bildhaft als Skelett und Maske Darstellungen zur Veranschaulichung von Strukturen, die von der Software zur Quantifizierung (Abb. 2A) verwendet. Wichtig ist, ermöglicht qualitative Bewertung der Skelett und Maske Formatvarianten schnelle Identifizierung von KAV Empfindlichkeit und Genauigkeit, die bei der Bestimmung der optimalen Schwellenwerteinstellungen und Interpretation Analyse-Ergebnisse nützlich sein können. Wenn die Qualität der Bilder Phase Kontrast hoch ist und ausreichender Kontrast erreicht, identifiziert KAV genau ECFC Netzwerke wie durch Ähnlichkeit zwischen der Phase kontrastreiches Bild und die KAV-generierte Skelett und Maske Wiedergaben (Abbildung 2 A und Video 1).
Alternativ, wenn Kontrast Phasenbilder keinen hohen Kontrast und/oder Artefakte von imaging wie Gitterlinien auftreten, Netzwerk Erkennungsgenauigkeit wird reduziert und Ergebnisse werden nicht eindeutig ist (Abbildung 2B). Bildung von Luftblasen innerhalb der Zelle Medien kann darüber hinaus auch Erkennungsgenauigkeit (Abbildung 2) verdecken. Jedoch können Probleme mit der Bildqualität durch Auswahl von verschiedenen Schnittstellenüberwachung Methoden in der KAV-Software enthalten oft überwunden werden. Beispielsweise wurde die Phase Kontrast Bild in Abbildung 2B mit identisches Bild Bearbeitung Einstellungen außer der Schnittstellenüberwachung Methode analysiert. Von Skelett und Maske Formatvarianten ist es offensichtlich, dass die Otsu Schnittstellenüberwachung eine genauere Erkennung der ECFC Netze Phase Kontrast Bild (Abbildung 2B) geführt. Daher ist die Bildqualität entscheidend für genaue und aussagekräftige Ergebnisse in diesem Test. Allerdings ermöglichen unterschiedliche Schwellwerte Methoden in der KAV-Benutzeroberfläche Anpassung der Bildanalyse anhand der Qualität der Bilder.
Time-Lapse Mikroskopie ermittelt qualitative und quantitative Unterschiede in ECFC Vaskulogenese nach intrauteriner gestational Diabetes Mellitus Exposition Vor kurzem wurde der KAV analytische Ansatz angewandt, um fetale ECFC Funktion nach Exposition gegenüber mütterlichen Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM) in Utero16festzusetzen. KAV, veränderte Kinetik der Vaskulogenese wurden identifiziert in fetalen ECFCs T2DM ausgesetzt. Allerdings beeinträchtigt die Exposition, die während der gesamten Schwangerschaft, gestational Diabetes Mellitus (GDM) oder die Entwicklung von Glucose-Intoleranz häufig im dritten Trimester der Schwangerschaft auftritt, neben T2DM auch ECFC Funktion13. Daher wurde KAV angewendet, um festzustellen, ob GDM-exponierten ECFCs auch veränderte Kinetik der ECFC Netzwerkbildung anzeigen. Phase 1 (0-5 h) und Phase 2 (5 + h) wurden anhand Zeit verfallen Mikroskopie gepaart mit KAV Analyse (Abbildung 3). Repräsentative Phasenbilder Kontrast zu Beginn der Bildaufnahme (0,50 h) erworben und in den zeitlichen Verlauf (5,00 bis 10,00 Uhr) zeigen ECFC Netzwerkbildung in der vier Proben von einem experimentellen Tag (Abbildung 3 und Video 1 ). Trotz entsprechenden Zelle laden, wie in der Phase kontrastreiche Bilder 0,50 Stunden beobachtet sind qualitative Unterschiede in der Netzwerkstruktur offensichtlich zu den 5,00 und 10,00-Stunden Zeitpunkten. ECFCs von der unkomplizierten Schwangerschaft (UC) bilden eine komplexe und komplizierte Netzwerk 5 Stunden nach dem Plattieren, ähnlich wie unsere bisher veröffentlichten Daten16. Im Gegensatz dazu probieren ECFCs von GDM 1 (GDM1) Form sehr wenige Strukturen vernetzen, die nicht miteinander verbunden sind. Allerdings spiegelt dieses Muster nicht in alle ECFC Proben aus GDM Schwangerschaften, bezeichnend für Heterogenität zwischen den Proben. GDM2 Proben und GDM3 anzeigen mehr Netzwerkbildung im Vergleich zu GDM1, obwohl die Muster der Konnektivität veränderten im Vergleich zu den UC-Probe erscheinen. Wichtig ist, misst KAV mehrere strukturelle Komponenten ECFC Netzwerke, offensichtliche und subtile Phänotypen zu identifizieren.
Neben der Erzeugung von Skelett und Maske Wiedergaben der Netzwerkstruktur, quantitates KAV 10 Metriken Netzstruktur, einschließlich der Anzahl der individuelle Netzwerkstrukturen, Knoten, dreifach verzweigten Knoten, Knoten vierfach verzweigt, Zweige, total Astlänge, durchschnittliche Astlänge Knoten-Verhältnis, total geschlossen Filialnetze und Netzwerk-Bereich16. KAV kompiliert die Daten für jede Probe in einer einzelnen Tabelle mit Werten für alle Bilder von den zeitlichen Verlauf. Tabelle 1 enthält repräsentative Rohdaten aus einer bildgebenden Studie für eine ECFC Probe. Parameter der Netzwerkstruktur gemessen von KAV gliedern sich in Spalten, und die Daten für die aufeinander folgenden Bildern, die im Laufe der Zeit erworben sind in Zeilen unterteilt. Für Beispiel, in unseren Studien, Bild 1 30 min nach dem Überzug mit nachfolgenden Bildern erworben wurde, wird alle 15 min. Rohwerte erzeugte gesammelt, KAV kann dann grafisch dargestellt oder weiter analysiert mit Hilfe komplexer statistischer Ansätze16.
Fünf Graphen zeigt Mittelwerte der Netzwerkstruktur aus drei separaten Experimente sind für eine unkomplizierte Einzelprobe (UC) und die drei GDM-Proben (Abbildung 4) dargestellt. Die UC-Probe in diesen Experimenten ähnlich zu zuvor analysiert UC Proben16. Zuvor wurde festgestellt, dass ECFC Vaskulogenese in Vitro Bi-phasisch, bestehend aus Phase 1 (0 - 5 h) und Phase 2 (5-10 h)16. Dieses Muster entspricht in aktuellen Studien, wie der Graph Darstellung geschlossenes Netzwerkdaten (Abbildung 4) belegt. Die UC-Probe gebildet eine größere Anzahl von geschlossenen Netzwerken im Vergleich zu allen drei der GDM Proben. Interessanterweise erscheinen drei der vier Proben zu einer ähnlichen Zeit, maximale Anzahl der geschlossenen Netzen, die zwischen 2,5 und 3 Stunden stattfindet. Allerdings war die GDM2 Probe langsamer maximale geschlossene Netze zu erreichen, die 5 Stunden Post-Beschichtung ist aufgetreten. Und trotz der GDM2 Probe weniger maximale Netzwerke im Vergleich zu den UC-Probe zu bilden, die Netzwerke, die es bildet wurden ebenso beibehalten, die UC-Probe im Laufe der Zeit. GDM1 und GDM3, die weniger Netzwerke im Vergleich zu den UC-Probe gebildet, stellte hingegen eine Verringerung Netzwerknummer im Laufe der Zeit. Insgesamt aus dem Diagramm Darstellung geschlossene Netzwerknummer, ist es offensichtlich, dass alle ECFC Proben eine Bi-phasisch Muster der Netzwerkbildung, angezeigt, aber die Bildung und die maximale Anzahl von Netzwerken erreicht über Proben variieren.
Netzwerkbereich stellt den durchschnittlichen Bereich innerhalb der geschlossenen Netze durch die ECFCs gebildet. Deshalb, je größer die geschlossene Netzwerk Nummer, je kleiner der Netzbereiche. Dieses Muster spiegelt sich in den Netzwerk-Bereich Grafiken wo die UC-Probe, die eine größere Anzahl von geschlossene Netzwerke gebildet, kleinere Netzbereiche im Laufe der Zeit im Vergleich zu den drei GDM-Proben (Abbildung 4 hatte). GDM2, die maximale geschlossene Netze langsamer erreicht, stellte hohe Netzwerkbereich zunächst, jedoch stabilisiert das Gebiet über Zeit, und dies um 15 Uhr die UC-Probe am ähnlichsten war. Im Laufe der Zeit stieg die durchschnittliche Netzwerkbereich in allen Proben aufgrund Netzwerk de-Stabilisierung. Einige Beispiele, wie GDM1 und GDM3, stellte jedoch einen rascheren Anstieg der Netzwerkbereich, die verringerte Stabilität im Vergleich zu anderen Proben ausstellen einen allmählichen Anstieg wahrscheinlich ein Indikator ist.
GDM-exponierten ECFCs weisen geringere Netzwerkstabilität Das Verhältnis der Zweige zu Knoten ist eine neuartige Phänotyp von KAV berechnet und in unseren früheren Studien identifiziert, und dies ist bezeichnend für Netzwerk-Konnektivität16. In der aktuellen Studie wies die UC-Probe ein niedriges Verhältnis, das ein hohes Maß an Netzwerkkonnektivität zu vertreten, die im Laufe der Zeit (Abbildung 4) gepflegt wurde. Dagegen hatte die drei Proben, GDM ein höheres Verhältnis von Zweigen, Knoten, vor allem in Phase 2 der Netzwerkbildung. Diese Beobachtung zeigt reduzierten Konnektivität und de-Stabilisierung von Netzwerkstrukturen.
Insgesamt bildeten GDM1 weniger Knoten und Zweige, die im Vergleich zu den anderen Proben mit der Reduktion erhalten im Laufe des Experiments. GDM2 und GDM3 gebildet und eine größere Anzahl von Filialen im Vergleich zu den UC-Probe, vor allem zwischen 5-15 h. Die Anzahl der Knoten in der GDM2 und GDM3 Netzwerke erkannt wurden mehr Ähnlichkeit mit der Anzahl der Knoten in der UC-Probe, vor allem zwischen 10-15 Uhr. Eine größere Anzahl von Filialen, aber eine ähnliche Anzahl von Knoten, könnte die erhöhte AST Knoten-Verhältnis deutlich zu späteren Zeitpunkten in den GDM-Proben entfallen. Wichtig ist, können gleichzeitige Änderungen im Zweig und Knoten schwierig in getrennten Diagrammen zu interpretieren sein. Jedoch bietet die neue Niederlassung Knoten-Verhältnis eine Möglichkeit, bewerten, wie Änderungen, einschließlich schwer zu erkennen, in den einzelnen Diagrammen im Zweig und Knoten, geringfügige Änderungen in veränderten Netzwerkkonnektivität führen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig1.jpg"> Abbildung 1 : Schaltplan skizziert 10 Parameter quantifiziert durch kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV). KAV quantitates zehn verschiedene Parameter der Netzwerkstruktur. Alle Parameter sind farblich gekennzeichnet und beschrieben im Schaltplan numerisch (1-10). Die Parameter umfassen die Anzahl der Filialen (grün 1), geschlossen Netze (blau, 2) und Knoten (rot, 3), durchschnittlich Netzwerkbereich (Orange, 4), die Anzahl der Netzwerkstrukturen (schwarz, 5), dreifach verzweigten Knoten (gelb, 6) und Quad-verzweigte Knoten (lila, 7), sowie Total (9) und (10) Zweig Durchschnittslänge und das Verhältnis der Anzahl der Filialen an die Anzahl der Knoten (10). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig2.jpg"> Abbildung 2 : Kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV) quantitates Netzwerkstruktur. (A) Skelett und Maske Überstellungen von Netzwerkstrukturen von KAV mit Phase bieten kontrastreiche Bilder visuelle Darstellung von Netzwerkstrukturen identifiziert und quantifiziert durch KAV identifiziert. Maßstabsleiste = 500 µm. (B) eine repräsentative Phase Kontrast Bild von ECFC Netzwerke-10 h Post-Beschichtung, die niedrigen Kontrast und Raster hat markiert aus einzelne Bildern zusammenfügen. Unterschiedliche Schwellwerte Methoden, z. B. Mittelwert oder Otsu, wählbar in den KAV-Plug-in, Quantifizierung Genauigkeit zu verbessern, wenn Kontrast Phasenbilder kontrastarmen haben oder Gitterlinien auftritt. Skelett und Maske Wiedergaben der Phase kontrastreiches Bild sind für mittlere und Otsu Schnittstellenüberwachung Methoden gezeigt. Phase kontrastreiche Bilder wurden mit einem 10 X-Objektiv erfasst. Maßstabsleiste = 500 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig3.jpg"> Abbildung 3 : Intrauterine GDM Belichtung verändert ECFC Netzwerkbildung. Bilder der ECFC Netzwerkbildung wurden in 15 Minuten Intervallen für 15 h von Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. Repräsentative Phase kontrastreiche Bilder in 5 h-Schritten, beginnend bei der Beschichtung (0,5 h), sind für die UC und drei GDM Proben gezeigt. Phase kontrastreiche Bilder wurden mit einem 10 X-Objektiv erfasst. Maßstabsleiste = 500 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig4.jpg"> Abbildung 4 : ECFCs, intrauterine GDM Ausstellung verändert Netzwerk Bildung Kinetik ausgesetzt. ECFCs wurden von einer unkomplizierten Schwangerschaft (UC, schwarz) und drei Schwangerschaften kompliziert durch gestational Diabetes Mellitus (GDM 1-3, rot) erhalten. Phase wurden Kontrast Aufnahmen in 15 min. Intervalle für 15 h. kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV) Software quantitated geschlossen Netze, Netzbereiche, Niederlassungen, Knoten und das Verhältnis der Zweige zu Knoten. Illustrierte Darstellung der Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von drei separaten Experimenten für jede Probe. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57044/57044video1.jpg"> Video 1: Intrauterine GDM Belichtung verändert Kinetik der ECFC Netzwerkbildung. Bilder der ECFC Netzwerkbildung wurden in 15 Minuten Intervallen für 15 h von Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. Phasenbilder Kontrast werden für die UC und drei GDM Proben über 15 h ab 0,5 h angezeigt. Die Maßstabsleiste stellt 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57044/Video1.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Bild</td>
			<td>Insgesamt Filialnetze</td>
			<td>Knoten</td>
			<td>Dreibettzimmer</td>
			<td>Viererzimmer</td>
			<td>Filialen</td>
			<td>Insgesamt Zweig Länge *</td>
			<td>AVG-Zweig Länge *</td>
			<td>Filiale Knoten-Verhältnis</td>
			<td>Geschlossene Netze</td>
			<td>Netzwerk-Bereich **</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>382</td>
			<td>290</td>
			<td>278</td>
			<td>11</td>
			<td>943</td>
			<td>47210</td>
			<td>124</td>
			<td>3.25</td>
			<td>9</td>
			<td>480214</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>284</td>
			<td>345</td>
			<td>337</td>
			<td>8</td>
			<td>940</td>
			<td>50699</td>
			<td>179</td>
			<td>2,72</td>
			<td>16</td>
			<td>264469</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>205</td>
			<td>376</td>
			<td>366</td>
			<td>9</td>
			<td>910</td>
			<td>55728</td>
			<td>272</td>
			<td>2.42</td>
			<td>27</td>
			<td>150621</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>162</td>
			<td>422</td>
			<td>407</td>
			<td>15</td>
			<td>947</td>
			<td>59692</td>
			<td>368</td>
			<td>2.24</td>
			<td>40</td>
			<td>98713</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>132</td>
			<td>454</td>
			<td>441</td>
			<td>12</td>
			<td>967</td>
			<td>61923</td>
			<td>469</td>
			<td>2.13</td>
			<td>53</td>
			<td>72951</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>122</td>
			<td>435</td>
			<td>419</td>
			<td>14</td>
			<td>907</td>
			<td>62587</td>
			<td>513</td>
			<td>2.09</td>
			<td>68</td>
			<td>56948</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>88</td>
			<td>429</td>
			<td>411</td>
			<td>17</td>
			<td>852</td>
			<td>63983</td>
			<td>727</td>
			<td>1.99</td>
			<td>74</td>
			<td>51429</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>68</td>
			<td>451</td>
			<td>437</td>
			<td>13</td>
			<td>874</td>
			<td>63960</td>
			<td>941</td>
			<td>1,94</td>
			<td>74</td>
			<td>51780</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>93</td>
			<td>437</td>
			<td>417</td>
			<td>18</td>
			<td>905</td>
			<td>60901</td>
			<td>655</td>
			<td>2.07</td>
			<td>49</td>
			<td>82919</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>126</td>
			<td>511</td>
			<td>487</td>
			<td>24</td>
			<td>1075</td>
			<td>61981</td>
			<td>492</td>
			<td>2.1</td>
			<td>37</td>
			<td>116857</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>49</td>
			<td>397</td>
			<td>384</td>
			<td>12</td>
			<td>737</td>
			<td>61823</td>
			<td>1262</td>
			<td>1.86</td>
			<td>79</td>
			<td>48805</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>81</td>
			<td>376</td>
			<td>364</td>
			<td>10</td>
			<td>751</td>
			<td>56817</td>
			<td>701</td>
			<td>2</td>
			<td>63</td>
			<td>64431</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>98</td>
			<td>509</td>
			<td>482</td>
			<td>26</td>
			<td>1028</td>
			<td>60799</td>
			<td>620</td>
			<td>2.02</td>
			<td>44</td>
			<td>98056</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>93</td>
			<td>449</td>
			<td>416</td>
			<td>31</td>
			<td>909</td>
			<td>58282</td>
			<td>627</td>
			<td>2.02</td>
			<td>45</td>
			<td>94081</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="11">* gerundet zur nächsten Mikron ** gerundet zur nächsten Mikron ^ 2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Repräsentative Rohdaten aus einer Bildgebung zu studieren, für ein ECFC Beispiel.

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für Zeitraffer-Aufnahmen und Analyse der Vaskulogenese Verwendung von in-vitro- phase Kontrast Mikroskopie gekoppelt mit der open-Source-Software, kinetische Analyse der Vaskulogenese. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um das Vasculogenic Potential von zahlreichen Zelltypen oder experimentellen Bedingungen, die arterielle Verschlusskrankheit modellieren quantitativ zu bewerten.

Kinetische Analyse der Vaskulogenese quantifiziert Dynamik der Vaskulogenese und Angiogenese In-vitro-

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

Das übergeordnete Ziel dieser experimentellen Methode ist es, den dynamischen Prozess der Vaskulogenese über die Zeit sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Angiogenese und Vaskulogenese über die Raten der Gefäßbildung und die Unterschiede zwischen den gebildeten Netzwerkstrukturmustern zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Quantifizierung einer großen Anzahl von Zeitpunkten der Vaskulogenese ermöglicht und damit die Möglichkeit bietet, die Kinetik des vaskulogenen Prozesses zu beurteilen.Diese Methode kann auf jede Zellpopulation oder jeden pathologischen Zustand angewendet werden, der die Prozesse der Vaskulogenese oder Angiogenese beeinflusst, um einzelne Zellpopulationen oder Co-Kultursysteme zu untersuchen. Etwa ein bis zwei Stunden vor Beginn des Experiments heizen Sie einen Mikroskoptisch-Top-Inkubator auf 37 Grad Celsius vor und stellen Sie das Kohlendioxid auf 5 % und die Luftfeuchtigkeit auf 85 % ein. Füllen Sie den Feuchtigkeitsbehälter des Inkubators, wenn er leer ist. Setzen Sie die Lebendzellkammer auf das Mikroskop und platzieren Sie dann einen leeren Objektträger in einer der beiden offenen Positionen in der Lebendzellkammer.Füllen Sie den Objektträger mit destilliertem Wasser und stellen Sie ein zweites Gebläse auf 39 bis 42 Grad Celsius ein, um die Objektträger von unten zu erwärmen und die Kondensation zu minimieren. Die Aufrechterhaltung der richtigen Temperatur und Luftfeuchtigkeit in der Bildgebungskammer für lebende Zellen ist entscheidend für den Erfolg des Experiments. Fügen Sie eine zweite Folie als Leerzeichen hinzu, bis die experimentelle Folie hinzugefügt werden kann.Geben Sie dann Wasser in die Reservoirs, die die Brunnen auf dem zweiten Objektträger umgeben, um die Bedingungen während des Bildgebungsexperiments nachzuahmen. Um den Objektträger der Experimentierkammer mit Basalmembranmatrix zu bestücken, bestücken Sie zuerst eine 20-Mikroliter-Pipette mit einer kalten 20-Mikroliter-Pipettenspitze und schneiden Sie mit einer Schere etwa einen Zentimeter vom Ende der Spitze ab. Stellen Sie das Pipettenvolumen auf etwas mehr als 10 Mikroliter ein und saugen Sie die Matrize langsam in die modifizierte Pipettenspitze an.Platzieren Sie die Pipettenspitze sofort in der Mitte einer Vertiefung des Objektträgers, berühren Sie die Spitze vorsichtig mit dem Boden der Vertiefung und drücken Sie den Kolben langsam zusammen, um die Matrize herauszudrücken. Nachdem Sie die Matrix zu allen 15 Vertiefungen hinzugefügt haben, schieben Sie den Deckel ganz auf den Objektträger. Das genaue und konsistente Pipettieren der Matrigel-Volumina in jede Vertiefung ist entscheidend für die Erzielung qualitativ hochwertiger Phasenkontrastbilder.Legen Sie dann den Objektträger bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten neben eine konische 50-Milliliter-Röhrchenkappe, die mit zwei bis drei Millilitern PBS gefüllt ist, um die Dehydrierung der Matrix zu reduzieren. Wenn sich die Matrix verfestigt hat, entfernen Sie den Überstand aus einer über Nacht kultivierten endothelialen koloniebildenden Zellkultur und waschen Sie die Zellen mit sieben Millilitern PBS. Aspirieren Sie die PBS-Wäsche und lösen Sie die Zellen mit zwei bis drei Millilitern Trypsin bei 37 Grad Celsius für zwei bis fünf Minuten.Dann resuspendieren Sie die dissoziierten Zellen in drei Millilitern Endothelial Growth Medium-2, um alle Zellklumpen aufzubrechen, und übertragen Sie die resultierende Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Nachdem alle endothelialen koloniebildenden Zellproben resuspendiert wurden, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in ein bis zwei Millilitern frischem endothelialem Wachstumsmedium. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in jeder Probe und geben Sie genügend endotheliale koloniebildende Zellen in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, um eine Verdünnung der Zellen auf 1,4 mal 10 bis 4 Zellen pro 175 Mikroliter mittlerer Konzentration zu ermöglichen.Mischen Sie dann jeden Mastermix durch sanftes Pipettieren. Entfernen Sie den Objektdeckel und geben Sie 50 Mikroliter jedes Mastermixes pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung auf den Objektträger. Um die Zellen abzubilden, ersetzen Sie den leeren Objektträger durch einen experimentellen Objektträger und fügen Sie Wasser zu den Reservoirs hinzu, die die Zellen auf dem Objektträger umgeben.Durchlaufen Sie jede Tischposition, und vergewissern Sie sich, dass die Mitte der ersten Vertiefung ausgewählt ist. Fokussieren Sie sich auf die Zellen, die in der Vertiefung plattiert sind, und legen Sie die Z-Position des Tisches fest. Wenn die Einstellungen korrekt sind, schalten Sie die Lichter aus, um das Bildgebungsexperiment zu starten.Wenn das Imaging abgeschlossen ist, skalieren und exportieren Sie die Bildstapeldateien in der Image Capture-Software, und speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien zur Analyse. Um die Bilder zu analysieren, ziehen Sie die Datei "Kinetische Analyse der Vaskulogenese" aus ihrem Ordner in die graue Leiste am unteren Rand des Softwarefensters, um die Software zu öffnen, und klicken Sie auf "Speichern", um die Software zur Liste hinzuzufügen. Klicken Sie auf Datei und Öffnen, um die zu öffnende Bilddatei auszuwählen, oder ziehen Sie die Bilddatei in die graue Leiste in der Software.Klicken Sie auf Bild, Anpassen und Helligkeit/Kontrast, um das Fenster Helligkeit/Kontrast zu öffnen. Klicken Sie im Fenster Helligkeit/Kontrast auf Zurücksetzen, um das Bild zu visualisieren. Klicken Sie dann auf Bild, Typ und 8-Bit, um die Bilder in 8-Bit zu konvertieren.Wählen Sie Tools und Manager für Interessenbereich aus, und verwenden Sie ein entsprechend geformtes Auswahlwerkzeug, um einen neuen Interessenbereich zu erstellen. Klicken Sie auf Hinzufügen, um das Shape "Interessenbereich" zum Fenster "Interessenregion-Manager" hinzuzufügen, und klicken Sie im Interessenbereichs-Manager auf die Beschriftung "Interessenbereich", um den Bereich auf dem Bild anzuzeigen. Passen Sie den Interessenbereich nach Bedarf an.Wenn der Bereich an seinem Platz ist, klicken Sie auf Bild und dann auf Zuschneiden, um das Bild zuzuschneiden. Öffnen Sie dann das Menü "Bearbeiten" und wählen Sie "Außenseite löschen", um die Bilddaten außerhalb des Interessenbereichs für jedes Bild im Stapel zu löschen. Öffnen Sie als Nächstes das Menü Plugins und wählen Sie das Plugin Analyze Network aus.Verwenden Sie den Dropdown-Pfeil im Popup-Fenster, um die Schwellenwertmethode zu ändern, und klicken Sie auf OK, um die Softwareverarbeitung zu starten. Am Ende der Analyse werden eine Datentabelle und ein Stapel verschmolzener Bilder geöffnet, die Skelett- und Maskendarstellungen darstellen. Klicken Sie auf Datei und Speichern unter, um die numerischen Werte in eine Tabelle zu übertragen, und speichern Sie die Tabelle mit den Rohdatenwerten.Klicken Sie auf das verschmolzene Skelett- und Maskenbild und speichern Sie den verschmolzenen Skelettmasken-Bildstapel und den zugeschnittenen Phasenkontrast-Bildstapel als TIFF-Dateien. Klicken Sie dann auf das Fenster "Region of Interest Manager", wählen Sie den Interessenbereich aus, der zum Zuschneiden der Bilder verwendet wurde, und klicken Sie auf Mehr und Speichern, um den Interessenbereich für die zukünftige Verwendung zu speichern. Endotheliale koloniebildende Zellnetzwerke, die durch die kinetische Analyse der Vaskulogenese identifiziert wurden, werden bildhaft als Skelett- und Maskendarstellungen dargestellt, um die Strukturen zu veranschaulichen, die von der Software zur Quantifizierung verwendet werden.Wenn die Qualität der Phasenkontrastbilder hoch ist und ein ausreichender Kontrast erreicht wird, identifiziert die kinetische Analyse der Vaskulogenese endotheliale koloniebildende Zellnetzwerke genau, wie die beobachteten Ähnlichkeiten zwischen dem Phasenkontrastbild und der kinetischen Analyse der durch Vaskulogenese erzeugten Skelett- und Maskendarstellungen zeigen. Wenn Phasenkontrastbilder keinen hohen Kontrast aufweisen oder wenn Bildgebungsartefakte wie Gridding auftreten, wird die Genauigkeit der Netzwerkerkennung verringert und die Ergebnisse werden mehrdeutig. Verschiedene Schwellenwertmethoden, wie z. B. Mittelwert und Otsu, die hier gezeigt werden, können jedoch vor der Analyse im Dropdown-Menü der Software ausgewählt werden, um Unterschiede in der Bildqualität auszugleichen.Die Verwendung der kinetischen Analyse der Vaskulogenese, um festzustellen, ob gestationsdiabetes mellitus exponierte endotheliale koloniebildende Zellen eine veränderte Kinetik der Netzwerkbildung aufweisen, zeigt eine heterogen veränderte Netzwerkstrukturbildung in gestationären Diabetes mellitus-Kulturen im Vergleich zu endothelialen koloniebildenden Zellkulturen aus einer unkomplizierten Schwangerschaft. In der Tat bilden unkomplizierte Schwangerschaftsproben in der Regel eine größere Anzahl geschlossener Netzwerke als Proben von Schwangerschaftsdiabetes mellitus. Alle endothelialen koloniebildenden Zellproben zeigen jedoch insgesamt ein biphasisches Muster der Netzwerkbildung, obwohl die Bildungsraten und die maximale Anzahl der erreichten Netzwerke zwischen den Proben variieren.Nach diesem Verfahren können die durch die kinetische Analyse der Vaskulogenese generierten Datenwerte grafisch dargestellt und analysiert werden, um festzustellen, ob die von den verschiedenen Proben gebildeten Netzwerkstrukturen statistisch unterschiedlich sind und wenn ja, zu welchen Zeitpunkten. Die kinetische Analyse der Vaskulogenese ermöglicht die effiziente Verarbeitung von Zeitrafferexperimenten mit einer großen Anzahl von Bildern. Nach der Beherrschung können die Bilderfassung, Nachbearbeitung und Analyse in zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn alle Systeme ordnungsgemäß funktionieren.

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Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Dieser Beitrag stellt ein umfassendes Verfahren zur in Vitro zu bewerten, ob klassische Tumor-Angiogenese im Hämangioblastome (HBs) und ihre Rolle bei der HBs vorhanden ist. Die Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der HB-Neovaskularisation und deuten darauf hin, dass diese Form der Angiogenese nur einen ergänzenden Mechanismus in der HB-Neovaskularisation ist.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay

Endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-EPs) gewonnen werden, haben das Potenzial, Herz-Kreislauf-Behandlungen zu revolutionieren und die Schaffung von originalgetreueren Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu ermöglichen. Dabei werden die Verkapselung von iPSC-EPs in dreidimensionalen (3D) Kollagen-Mikroumgebungen und eine quantitative Analyse des vaskulogenen Potenzials dieser Zellen beschrieben.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.

Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

Die hier vorgestellte Methode kann die Wirkung von Reagenzien auf die Angiogenese oder die Gefäßpermeabilität in vivo ohne Färbung bewerten. Die Methode verwendet die Dextran-FITC-Injektion über die Schwanzvene, um Neogefäße oder Gefäßleckagen sichtbar zu machen.

Modifizierter In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay für Angiogenese-Studien

In dieser Arbeit werden der zweidimensionale (2D) Scratch Wound Migration Assay und der dreidimensionale (3D) Sphäroid-Sphäroide-Assay zusammen mit ihren jeweiligen nachgeschalteten Analysemethoden, einschließlich RNA-Extraktion und Immunzytochemie, als geeignete Assays zur Untersuchung der Angiogenese in vitro vorgestellt.

Untersuchung der Angiogenese auf funktioneller und molekularer Ebene durch Nutzung des Scratch Wound Migration Assay und des Spheroid Sprouting Assay

Die Keimangiogenese, die für Entwicklung und Krankheit von grundlegender Bedeutung ist, umfasst komplexe molekulare und mechanische Prozesse. Wir präsentieren ein vielseitiges 2,5D-ex vivo-Modell , das das zelluläre Keimen aus Schweine-Halsschlagadern analysiert und dabei die steifigkeitsabhängige Angiogenese und die ausgeprägte Leader-Follower-Zellmechanik aufdeckt. Dieses Modell hilft bei der Weiterentwicklung von Tissue-Engineering-Strategien und Krebstherapieansätzen.

2.5D-Modell zur ex vivo mechanischen Charakterisierung der Keimangiogenese in lebendem Gewebe

Lernen Sie die kinetische Analyse der Vaskulogenese für quantitative Bewertung von Gefäßbildung in vitro. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Endothelzellen und verschiedenen experimentellen Bedingungen.

Kinetische Analyse der Vaskulogenese quantifiziert Dynamik der Vaskulogenese und Angiogenese In-vitro-

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