Name: Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Protokoll zur Isolierung von Pankreas-Inseln aus Mäusen mit direkter Kollagenase-Injektion. Diese Methode liefert 250–350 hochwertige Inseln pro Maus und vereinfacht die Gradientenreinigung erheblich.

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Wir sind Frau Jennifer Munguia sehr dankbar für ihre künstlerische Darstellung des Schemas. Wir danken Herrn Michael R. Honig von Houstons Community Public Radio Station KPFT für seine redaktionelle Unterstützung. Diese Studie wurde von der American Diabetes Association #1-15-BS-177 (YS) und NIH R56DK1118334/R01DK118334 (YS) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch vom USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1010840 (YS) und R01 DK095118 (SG) unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Animal Care and Use Committee (ACUC) der Texas A&M University genehmigt. Der Bedarf an chirurgischen Werkzeugen ist in Abbildung 1 und das schematische Diagramm des Verfahrens in Abbildung 2dargestellt.
1. Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) vor, indem Sie 100 ml 10X HBSS (ab Lager) zu 900 ml destilliertem Wasser hinzufügen, um 1 L HBSS (1X) herzustellen.</li>
	<li>Bereiten Stop-Lösung (muss frisch gemacht werden und sollte innerhalb von 1 h verwendet werden) durch Zugabe von 50 ml 100X fetales Rinderserum (FBS) zu 450 ml eiskalte 1X HBSS; dies macht 500 ml STOP-Lösung. Halten Sie die STOP-Lösung bei 4 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie Kollagenase P Lösung (muss innerhalb von 1 h nach der Verwendung frisch gemacht werden) durch Zugabe von 1 mg/ml Kollagenase P zu eiskalten 1X HBSS; 6 ml/Maus verwenden.<ol>
<li>Fügen Sie 0,05% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) zur Kollagenase P-Lösung hinzu (dies liefert Nährstoffe für die isolierten Inselchen). Verwenden Sie beispielsweise 3 mg BSA in 6 ml Kollagennase P-Lösung. Auf Eisbleiben.</li>
		<li>Berechnen und bereiten Sie die Menge an Kollagenase P für alle Mäuse in einem 50 ml Rohr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie komplette sRPMI 1640 medium durch Hinzufügen von 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin, INS-1-Zellergänzung (10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol) bis 500 ml RPMI 1640 Medien mit 5,5 mM Glucose für Nachtkultur und Inkubation.</li>
</ol>2. Vorbereitung
<ol><li>Füllen Sie drei 50 ml Rohre mit 25 ml RNase-Hemmlösung,70% Ethanol oder destilliert H2 O. Diese Lösungen werden für die Reinigung von chirurgischen Werkzeugen vor und während des Eingriffs verwendet.</li>
	<li>Einweichen Sie die Spitzen der Werkzeuge in RNase Hemmlösung für 30 min vor dem Start des Protokolls; Dadurch werden alle potenziellen RNase auf den Werkzeugen eliminiert.</li>
	<li>Vorgeschnittene saugfähige Pads bis 6 in x 6 Größe für den Einsatz während der Operation.</li>
	<li>Bereiten Sie die 1X HBSS-Lösung im Voraus vor und lagern Sie sie bei 4 °C. Bereiten Sie DIE STOP-Lösung vor der Operation vor. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie Kollagenase P Lösung unmittelbar vor der Operation und auf Eis lagern. HINWEIS: Dies sollte innerhalb von 2 h nach der Zubereitung verwendet werden.</li>
	<li>Etikett 50 ml Rohre für die Verdauung und Reinigung; bereiten 2 Rohre für jede Maus, eine für die Verdauung und die andere für die Inselreinigung. Stellen Sie sicher, dass sich die Tier-ID auf beiden Rohren befindet.</li>
	<li>Fügen Sie 3 ml Kollagennase P-Lösung in das erste 50 ml-Rohr ein. Die restlichen 3 ml Kollagenase P werden injiziert.</li>
	<li>Ziehen Sie die restlichen 3 ml Kollagenaselösung in eine 3 ml Spritze, die mit 30 G 1/2 in der Nadel montiert ist. Legen Sie die Spritze auf Eis.</li>
</ol>3. Verfahren
<ol><li>Entfernen Sie alle Werkzeuge aus rNase Hemmlösung, dann tauchen Sie sie zuerst in das Rohrmit 70% Ethanol, dann in die Röhre mit destilliertem H2 O, dann lufttrocken auf sauberem Papiertuch.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in eine Kammer mit 0,5 ml Isofluran, bis die Maus tief anästhesiert ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus aus der Kammer und überprüfen Sie den Zustand der Anästhesie, indem Sie ein Fußpolster mit Zangen kneifen. Die tiefen Anästhesisierung basiert auf der Beobachtung, dass die Atmung stetig langsam wird und die Maus unreaktiv zum Kneifen der Füße ist. Nach der Bestätigung, dass die Maus tief anästhesiert ist, einschläfern Sie die Maus mit Zervixdislokation, und legen Sie die Maus dann auf das saugfähige Pad.<ol>
<li>Legen Sie die anästhesierte Maus auf den Bauch, setzen Sie Druck auf den Hals und verschieben Sie die Wirbelsäule aus dem Gehirn, indem Sie den Schwanz ziehen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verkleben Sie die Gliedmaßen der Maus in Supine-Position auf das saugfähige Pad, sprühen Sie den Körper mit 70% Ethanol, und wischen Sie überschüssiges Ethanol ab.</li>
	<li>Verwenden Sie Abdeckung Glaszange und gekrümmte chirurgische Schere, um Schnitte zu machen. Zuerst einen horizontalen Schnitt auf der Haut des Bauchbereichs machen (ca. 3 cm), ziehen Sie die Haut weit auf, um die Bauchwand freizulegen. Dann machen Sie einen vertikalen Schnitt (ca. 3–4cm) auf dem Bauchperitoneum, um die Bauchspeicheldrüse in der Bauchhöhle vollständig freizulegen (Abbildung 3).</li>
	<li>Drücken Sie die Lappen der Leber überlegen, um den Gallengang zu belichten, wird es als blassrosa Röhre erscheinen (Abbildung 3).</li>
	<li>Bewegen Sie den Darm vorsichtig aus dem rechten Lenden-/Iliasbereich der Bauchhöhle nach rechts, indem Sie den Gallengang und die Leberarterie freisetzen (Abbildung 3).</li>
	<li>Den gemeinsamen Gallengang vorsichtig mit den Schwartz Micro Serrefines (Abbildung 1) so nah wie möglich an der Leber zu klemmen.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Ampulla von Vater, die sich an der Zwölffingerdarmpapille befindet, die durch die Vereinigung des Bauchspeicheldrüsenkanals und des gemeinsamen Gallengangs gebildet wird. Die Ampulla von Vater erscheint geschwollen, wenn sie unter einem Seziermikroskop betrachtet wird, das der Einstiegspunkt zum gemeinsamen Gallengang ist (Abbildung 4). HINWEIS: Das Anpassen der Lichtintensität/des Lichtwinkels des Seziermikroskops kann das Anortiieren erleichtern.</li>
	<li>Setzen Sie die Spritze mit 3 ml der Kollagenase-P-Lösung in die Ampulla von Vater ein. Drücken Sie die Nadel in den Kanal für etwa 1/4 der Länge des gemeinsamen Gallengangs (Ampulla führt in den Kanal), wie in Abbildung 5dargestellt.</li>
	<li>Sobald sich die Nadel in der Ampulla befindet, stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung der Nadel so ist, dass sie parallel zum Kanal ist.</li>
	<li>Stabilisieren Sie die Nadel durch Einklemmen mit Micro Adson Zangen, um zu verhindern, dass sie den Kanal durchkreuzt (Abbildung 5).</li>
	<li>Langsam und stetig 3 ml der Kollagenase P-Lösung aus der Spritze in den gemeinsamen Gallengang (genug, um Widerstand zu spüren) wie in Abbildung 6dargestellt. Das Ziel ist es, Rückflussdruck zu erzeugen, um die Kollagenase zu zwingen, in den Bauchspeicheldrüsenkanal einzutreten. Die Injektion gilt als erfolgreich, wenn der Kopf-, Nacken-, Körper- und Schwanzbereich der Bauchspeicheldrüse vollständig aufgeblasen ist. HINWEIS: Die Islet-Ausbeute ist gering, wenn entweder die Bauchspeicheldrüse nicht vollständig aufgeblasen ist oder die Splenic-Fläche nicht vollständig aufgeblasen ist. Der Splenic-Bereich enthält die höchste Anzahl von Inselchen6. Die Inflation kann durch das Auftreten von offenen Räumen zwischen Bauchspeicheldrüsengewebe bestätigt werden, die mit Lösung gefüllt sind.</li>
	<li>Sezieren Sie die aufgeblasene Bauchspeicheldrüse vorsichtig aus und legen Sie sie in ein 50 ml Verdauungsrohr mit 3 ml eiskalter Kollagenase P-Lösung.<ol>
<li>Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse mit 2 Zangen (gekrümmt und Micro Adson; Siehe Abbildung 1): (ab der Milz, ziehen Sie die Bauchspeicheldrüse weg von der Milz und weiter aus dem Magen und entlang des Zwölffingerdarms entfernen. HINWEIS: Keine Schnitte erforderlich.</li>
		<li>Bauchspeicheldrüse für 3-5 s im Verdauungsrohr mit 3 ml eiskalter Kollagenase P-Lösung mit feiner chirurgischer Schere hacken (Abbildung 7A).</li>
	</ol></li>
	<li>Sichern Sie das Rohr an einem Rack in 37 °C Wasserbad und schütteln Sie bei 100–120 U/min für ca. 12-13 min.</li>
	<li>Nach der Inkubation die Schläuche vorsichtig von Hand schütteln, um das Gewebe zu stören, bis die Kollagenase P Verdauungslösung homogen wird (Abbildung 7B). Homogenität wird durch ein sandartiges Aussehen feiner Pankreaspartikel bestätigt. Etwa 30 s sanftes Händeschütteln reichen in der Regel aus. Halten Sie die Röhre bis zum Licht, um zu untersuchen, ob das Gewebe gut homogenisiert ist; bei Bedarf für weitere 15 s schütteln.</li>
	<li>Nach dem Digestieren die Schläuche sofort auf Eis legen und 40 ml eiskalte STOP-Lösung hinzufügen, um die enzymatische Verdauung zu beenden. HINWEIS: An dieser Stelle können Verdauungsröhren bis zu 2 h auf Eis gelassen werden, wenn sie an mehreren Mäusen arbeiten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr in einer Schwing-Schaufel-Zentrifuge bei 300 x g für 30 s (die Temperatur der Zentrifuge ist flexibel). HINWEIS: Verwenden Sie eine Schwenk-Eimer-Zentrifuge, so dass das Gewebepellet an der Unterseite des 50 ml Rohrs und nicht an der Wand des Rohres gebildet wird; dies ist entscheidend für eine bessere Islet-Ausbeute.</li>
	<li>Dekantieren und wiederholen Sie die Zentrifugation mit STOP-Lösung 2 weitere Male, dekantieren Sie die Lösung nach jeder Drehung. Verwenden Sie 20 ml STOP-Lösung für jede nachfolgende Wäsche.<ol>
<li>Vor jeder Drehung das Pellet durch sanftes Schütteln des Gewebepellets im 50 ml-Rohr in 20 ml STOP-Lösung stören.</li>
	</ol></li>
	<li>Das Gewebepellet mit 40 ml eiskaltem HBSS und Zentrifuge bei 300 x g für 30 s wieder aufhängen.</li>
	<li>Dekantieren und wiederholen Sie die Zentrifugation mit einer Schwing-Bock-Zentrifuge mit HBSS-Lösung zwei weitere Male, wodurch die Lösung nach jeder Drehung dekantiert wird. Verwenden Sie 20 ml HBSS für jede Wäsche.<ol>
<li>Vor jeder Drehung das Pellet stören, um es von der Unterseite des Rohres zu lösen, indem Sie das Rohr mit 20 ml HBSS-Lösung sanft schütteln.</li>
	</ol></li>
	<li>Entfernen Sie nach der letzten Zentrifugation alle HBSS.</li>
	<li>Fügen Sie dann 5 ml Raumtemperaturgradient in das 50 ml-Rohr, das das Pellet enthält. Wirbel kurz bei niedriger Geschwindigkeit bis zur Homogenisierung.</li>
	<li>Fügen Sie dem 50 ml-Rohr weitere 5 ml des Raumtemperaturgradienten hinzu. Wirbel/Mix nicht. HINWEIS: Es ist wichtig, stabil zu bleiben und trotzdem, um eine bessere Steigung ohne Unterbrechung zu ermöglichen.</li>
	<li>Pipette 10 ml Raumtemperatur HBSS Puffer in das Rohr (mit dem Dichtegradienten), Tropfen für Tropfen sanft und langsam, um einen Gradienten bilden zu lassen. Verwenden Sie eine Pipettenpistole mit einer 10 ml Pipette, um HBSS tropfenweise hinzuzufügen.</li>
	<li>Drehen Sie die Rohre mit einer Schwenk-Bock-Zentrifuge 15 min mit einer Schwenk-Bock-Zentrifuge. Stellen Sie sicher, dass Sie die Geschwindigkeit der Beschleunigung/Verzögerung auf die niedrigste Einstellung ändern, um den Farbverlauf beizubehalten (Abbildung 7C).</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Drehung die Rohre vorsichtig, ohne den Gradienten zu stören. Mit einer Pipette-Pistole, die mit kaltem HBSS (Pipette HBSS nach oben und unten) vorbenetzt ist, wird die zwischen dem Dichtegradienten und HBSS gebildete Inselschicht (5–10 ml) in das neue 50-ml-Inselsammelrohr ausgepipettet. HINWEIS: Es ist hilfreich, die Pipette mit kaltem HBSS zu befeuchten, bevor die Inselchen pipetiert werden, um zu verhindern, dass die Inselchen an den Innenwänden der Pipette kleben.<ol>
<li>Falls die Trennung unvollständig ist, wären Inselchen in der Dichtegradientenschicht sichtbar, pipette die gesamte 10 ml des Dichtegradienten (untere Schicht) zusammen mit der an der Schnittstelle gebildeten Inselschicht (nur um etwa 8–10 ml der HBSS-Oberschicht hinter sich zu lassen). HINWEIS: Das Sammeln sowohl der Islet-Schicht als auch der Dichtegradientenschicht (untere Schicht) kann zu einer Sammlung von Schmutz führen, was die Kommissionierzeit der Islet verlängern kann, aber keine anderen Schritte werden geändert. Das Sammeln dieser beiden Schichten ist nicht erforderlich, wenn die Isletschicht gut ausgebildet ist.</li>
	</ol></li>
	<li>20 ml eiskalteHBSS in das neue 50 ml-Rohr mit Inselchen geben, dann zentrifugieren bei 350 x g für 3 min in einer Schwing-Eimer-Zentrifuge.</li>
	<li>Nach dem Drehen, sorgfältig Pipette (nichtdekantieren) aus dem Überstand (lassen Sie 3 ml an der Unterseite), ohne das Pellet mit den Inseln an der Unterseite stören. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Waschen und Zentrieren mindestens 3 Mal wiederholen. Fügen Sie jedes Mal 20 ml HBSS hinzu, und stellen Sie sicher, dass Sie das Pellet vor jeder Drehung anhalten.</li>
	<li>Erwärmen Sie die komplette Medienflasche RPMI-1640 im Wasserbad bei 37 °C. Nach der letzten Zentrifugation entfernen Sie alle HBSS und fügen Sie 4 ml zuvor vorbereiteter vollständiger RPMI-1640-Medien (mit FBS, INS-1-Zellergänzung und Penicillin/Streptomycin) in das Pellet ein.</li>
	<li>Lösen Sie das Pellet, indem Sie das Rohr sanft wirbeln und gießen Sie das RPMI-1640 Medium sofort in eine 100 mm Petrischale. Fügen Sie weitere 5 ml RPMI-1640-Medien in das Rohr und wirbeln Sie es vorsichtig, um alle verbleibenden Inselchen abzuwaschen, dann gießen Sie die Medien auch in die gleiche Petrischale.<ol>
<li>Wählen Sie unter einem Seziermikroskop gesunde Inselchen aus der Petrischale mit einer 20-L-Pipette aus und legen Sie sie in eine neue Petrischale mit 10 ml kompletten RPMI 1640-Medien. Unter einem Seziermikroskop betrachtet, sollten Inselchen sphärisch/länisch und goldbraun mit einer glatten Oberfläche im Vergleich zum relativ transparenten, wispy exokrinen Gewebe erscheinen. HINWEIS: Die Vergrößerung des Seziermikroskops wird in der Regel auf 12,5–16x eingestellt. Die Islet-Ausbeute variiert je nach verschiedenen Faktoren wie Stamm, Alter und Geschlecht der Maus. Dieses Protokoll ergibt in der Regel 250–350 gesunde Inselchen aus gesunden C57BL/6J Maus alter 4–10 Monate alt.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubieren Sie die Inseln in einem sterilen Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2-Infusion und 95% befeuchteter Luft über Nacht für Experimente am nächsten Tag, oder frieren Sie die Inseln für die gewünschte Analyse zu einem späteren Zeitpunkt ein.<ol>
<li>Sobald Inselchen eingefroren sind, können sie nicht mehr für Sekretionstests verwendet werden, sondern nur für die RNA- oder Proteinquantifizierung. Um Zellen zum Einfrieren zu sammeln, legen Sie sie in den HBSS-Puffer, sammeln Sie alle Inselchen in 200–500 l Puffer, übertragen Sie in 1,5 ml Rohr, Zentrifuge 350 x g für 1-2 min, entfernen Sie den Überstand verlassen nicht mehr als 30–40 l Lösung, legen Sie in -20 °C für kurzfristige Lagerung ( mehrere Tage) oder -80 °C für die Langzeitlagerung.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li>
<li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lepr%28db%29+mouse+model+of+type+2+diabetes%3A+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632(2015).</li>
<li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374(2014).</li>
<li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374(1987).</li>
<li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+filtration%3A+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li>
<li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li>
<li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979(2017).</li>
<li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll umfasst Kollagenase-Perfusion und Verdauung, gefolgt von der Reinigung von Inselchen. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die effektive Injektion und vollständige Perfusion der Bauchspeicheldrüse1,4,7. Die Abgabemethode dieses Protokolls ermöglicht es dem Enzym, die anatomischen Wege zu durchqueren, um das Exokringewebe, das die Inselchen umgibt, besser zu verdauen1. Darüber h...

Es gibt zwei gängige Methoden in der Literatur für die Pankreas-Islet-Isolierung. Man erfordert, die Bauchspeicheldrüse auszugraben und mit einer chirurgischen Schere in kleine Stücke zu zersieben und sie dann in einer Kollagenaselösung1,2,3zu verdauen. Eine weitere genauere Methode ist die Verwendung des In-Kanal-Netzwerks in der Bauchspeicheldrüse zur Einführung von Verdauungsenzymen. Folgende Stellen wurden für die Injektion von Verdauungsenzymen verwendet: die Verbindung des Gallen- und Cystkanals, die Gallenblase in den gemeinsamen Gallengang oder der gemeinsame Gallengang selbst1,4,5. Es ist bekannt, dass Inselchen nicht gleichmäßig in der Bauchspeicheldrüse verteilt sind; der Splenic-Bereich enthält die meisten Inselchen6. Während die zweite Methode, die anatomische Wege zur Lieferung von Verdauungsenzymen verwendet, eine vollständigere Durchblutung der Bauchspeicheldrüse, einschließlich der Milzregion, ermöglicht, erfordert dieses Verfahren oft das Spannen oder DasNusn der Ampulla von Vater, die technisch schwierig. In Bezug auf die Inselreinigung wurden mehrfachdichte Gradienten sowie Zellsiebe und magnetischer Rückzug verwendet, um die Inselchen zu reinigen3,7. Die Nutzung dieser Steigungen kann zeitaufwändig sein und die Ficoll-Gradienten können zu toxischen Schäden an Inselchen8führen.
Das aktuelle Protokoll basiert auf der von Li et al.7beschriebenen Methode, wobei zusätzliche Modifikationen hinzugefügt werden, die auf der Erfahrung von uns und anderen basieren1,4. Die kritischsten Schritte unseres Protokolls sind das Spannen des gemeinsamen Gallengangs in der Nähe des Leberendes, das Injizieren der Kollagenase P über die Ampulla von Vater, um das Exokringewebe zu verdauen, und dann mit einem schütteren Wasserbad, um die Verdauung mechanisch zu beschleunigen1, 4,7. Anschließend wird eine "STOP"-Lösung angewendet, um die weitere Verdauung der Inselchen zu hemmen; HBSS wird verwendet, um die verbleibende Kollagenase P und STOP Lösung abzuwaschen. Wenn die Ficoll-Methode verwendet wurde, um menschliche Inselchen zu reinigen, wurde berichtet, dass die Ausbeute doppelt so hoch war wie die Inseln mit größerer Funktioneller Fähigkeit (z. B. Insulinsekretion) im Vergleich zur Verwendung von Percoll-Gradienten9. Studien haben jedoch die Verwendung von Ficoll Gradienten aufgrund seiner toxischen Wirkung auf die Inseln1,10in Frage gestellt. Es wurde berichtet, dass der Histopaque Gradient eine optimale Reinigungskinetik für die Isolierung von Mausinseln bietet, was eine gute Ausbeute an hochwertigen Inselchen mit einfacheren Schritten und niedrigerenKosten1 erzeugt. In unserem Protokoll wird Histopaque-1077 verwendet, um Inselchen aus anderen Restgeweben zu reinigen8,11. Die geernteten Inseln können in kompletten RPMI-1640-Medien kultiviert oder direkt in der RNA/Protein-Quantitation verwendet werden.
Unser Protokoll, das eine Kombination aus Kollagenase P-Verdauung und einem einzigen Gradientenreinigungsschritt verwendet, ist einfacher als andere veröffentlichte Protokolle. Unsere Methode erfordert keine anspruchsvollen chirurgischen Eingriffe und hat nur wenige einfache Schritte. Noch wichtiger ist, dass dieses Protokoll konsequent eine gute Ausbeute an hochwertigen funktionstüchtigen Inseln (250-350/Maus) erzeugt, wie berichtet12.

<table><tbody><tr><td>3 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Hoding Kollagenase P</td></tr><tr><td>Deckglaszange</td><td>VWR</td><td>82027-396</td><td>Halten der Haut einer Maus zur Unterstützung des Inzisionsverfahrens</td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168696</td><td>Halten von Geweben während der Entfernung der Bauchspeicheldrüse</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal</td><td>B13B16A</td><td>Zur Betäubung von Mäusen vor der Operation</td></tr><tr><td>100 mm Petrischalen</td><td>VWR</td><td>30-2041</td><td>Wird für Inselkulturen</td></tr><tr><td>30 G. &frac12; Zoll Nadel</td><td>BD</td><td>305106</td><td>Für die Penetration von Ampulla von vater zur Abgabe von Kollagenase P - diese Probe wird verwendet, da sie gut in die meisten CBDs passt</td></tr><tr><td>50ml Tube</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>Hält verdautes Bauchspeicheldrüsengewebe, Kollagenase P und gereinigte Inselzellen</td></tr><tr><td>Absorbierende Pads mit wasserdichter Feuchtigkeitsbarriere</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td>Zur Aufnahme von Blut aus syurgischen Verfahren</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810R mit Schwenkschaufel und Verzögerungsfähigkeit</td><td>Eppendorf</td><td>5811FJ478114</td><td>Zur Pelletierung von Geweben wird das Pellet am Boden des konischen Rohrs gebildet - eine Schwenkschaufelzentrifuge wird benötigt. Auch die Abbremsfunktion ist wichtig, um die Verlaufsschichten zu bilden.</td></tr><tr><td>Kollagenase P- 1g</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11249002001</td><td>Für die Verdauung der exokrinen Bauchspeicheldrüse</td></tr><tr><td>Gebogene chirurgische Schere</td><td>Fisher-Scientific</td><td>13-804-21</td><td>Zum Aufschneiden des Bauches von Mäusen</td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Wird zur Identifizierung wichtiger anatomischer Strukturen verwendet, um Kollagenase genau in die Bauchspeicheldrüse zu bringen</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution 10x</td><td>Corning</td><td>20-023-CV</td><td>Waschzellen</td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>RNBF5100</td><td>Für die Gradientenbildung</td></tr><tr><td>Lichtquelle</td><td>Leeds</td><td>LR92240</td><td>Verbesserung der Sichtbarkeit des Mikroskops</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Fisher-Scientific</td><td>AM9780</td><td>Zum Entfernen von RNase</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medien ohne L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td>Kultivierung von Inseln</td></tr><tr><td>Schwartz-Mikroserraffinerie (Mikrovaskuläre Klemme)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-01</td><td>Klemmung des Gallengangs und der Leberarterie</td></tr><tr><td>Schüttelwasserbad</td><td>Boekel/</td><td>Grant 8R0534008</td><td>Wichtig für die mechanische Verdauung von exokrinem Gewebe</td></tr><tr><td>Kleine chirurgische Schere</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>Cuttitng-Gewebe, das an der Bauchspeicheldrüse anhaftet</td></tr></tbody></table>

ein einfaches hocheffizienzprotokoll für die isolierung von pankreas-isleten von mäusen

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pankreasinseln, auch Die Inselchen langerhans genannt, sind ein Cluster von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulation und andere wichtige biologische Funktionen produziert. Die Inselchen bestehen in erster Linie aus fünf Arten von hormonsekretierenden Zellen: Zellen sekrete Glucagon, Zellen sezernieren Insulin, Zellen sezernieren Somatostatin, Zellen sezernieren Ghrelin und PP-Zellen sezernieren Pankreaspolypeptid. Sechzig bis 80% der Zellen in den Inselchen sind Zellen, die die wichtigste Zellpopulation sind, um die Insulinsekretion zu untersuchen. Pankreasinseln sind ein entscheidendes Modellsystem zur Untersuchung der Ex-vivo-Insulinsekretion. Der Erwerb hochwertiger Inselchen ist für die Diabetesforschung von großer Bedeutung. Die meisten Isolierungsverfahren auf Der Iseutiniten erfordern technisch schwierigen Zugriff auf die Stelle der Kollagenaseinjektion, harte und komplexe Verdauungsverfahren und Schritte zur Reinigung von Mehrfachdichtegradienten. Dieses Papier verfügt über eine einfache High-Yield-Maus-Insel-Isolationsmethode mit detaillierten Beschreibungen und realistischen Demonstrationen, die die folgenden spezifischen Schritte zeigt: 1) Injektion der Kollagenase P an der Ampulla von Vater, ein kleiner Bereich, der den Pankreaskanal verbindet und der gemeinsame Gallengang, 2) enzymatische Verdauung und mechanische Trennung der exokrinen Bauchspeicheldrüse und 3) ein einziger Gradientenreinigungsschritt. Die Vorteile dieser Methode sind die Injektion des Verdauungsenzyms mit der leichter zugänglichen Ampulla von Vater, eine vollständigere Verdauung mit Kombination enzymatischer und mechanischer Ansätze und ein einfacherer Einzelgradientenreinigungsschritt. Dieses Protokoll erzeugt ca. 250–350 Inselchen pro Maus; und Inselchen eignen sich für verschiedene Ex-vivo-Studien. Mögliche Vorbehalte dieses Verfahrens sind potenziell geschädigte Inseln aufgrund enzymatischer Verdauung und/oder längerer Gradienteninkubation, die alle durch sorgfältige Ad-Begründung der Inkubationszeit weitgehend vermieden werden können.

Der ordnungsgemäße Abschluss dieses Verfahrens erfordert ein gewisses Verständnis der Mausanatomie in der Bauchhöhle. Dies ermöglicht eine ordnungsgemäße Identifizierung der Ampulla von Vater und das Spannen des gemeinsamen Gallengangs. Die gesamte Prozedur dauert normalerweise 1-2 h. Es ist effizienter, Inselchen von 4–6 Mäusen gleichzeitig zu isolieren, so dass mehrere Proben zusammen zentrifugiert werden können. Die Zeit für die Pflückerung variiert je nach Anzahl der Inselchen und der Effizienz der Verdauung; Es kann...

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Dieses Protokoll erfordert die Verwendung eines einzigen Dichtegradienten, der es im Vergleich zu komplexeren konventionellen Islet-Isolationsmethoden deutlich arbeitsintensiver und kostengünstiger macht. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist, dass das Enzym direkt an die Bauchspeicheldrüse abgegeben wird, was zu einer verbesserten Gewebeverdauung und einer erhöhten Islet-Ausbeute führt. Beginnen Sie, indem Sie die Gliedmaßen der Maus in der Supine-Position kleben und den Körper mit 70% Ethanol besprühen.Mit CoverglassZangen und gekrümmten chirurgischen Scheren, machen Sie einen etwa drei Zentimeter horizontalen Bauchhautschnitt und ziehen Sie die Haut auf, um die Bauchwand freizulegen. Machen Sie einen vertikalen Schnitt von drei bis vier Zentimetern am Bauchperitoneum, um die Bauchspeicheldrüse vollständig freizulegen und die Maus unter ein Sezierendes Mikroskop zu stellen. Drücken Sie den Leberlappen überlegen, um den Gallengang freizulegen, der als blassrosa Röhre erscheint, und bewegen Sie den Darm sanft von der rechten Lenden- und Iliasregion nach rechts von der Bauchhöhle, um den Gallengang und die Leberarterie freizulegen.Verwenden Sie Schwartz micro serrefines, um den gem

a-simple-high-efficiency-protocol-for-pancreatic-islet-isolation-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.

Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Pankreatischen inselversetzung ist eine Möglichkeit, Normoglycemia bei Diabetes Typ 1 zu erreichen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Transplantation-Technik durch die intraportal Route weiterhin normale Blutzuckerwerte bei diabetischen Mäusen.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Endothelzellen der Maus aus der gesamten Bauchspeicheldrüse.

Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Lernen Sie ein optimiertes Protokoll zur Isolierung von Pankreas-Inseln aus Mäusen mit direkter Kollagenase-Injektion. Diese Methode liefert 250–350 hochwertige Inseln pro Maus und vereinfacht die Gradientenreinigung erheblich.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

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