Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, monosynaptische Verbindungen elektrophysiologisch in Drosophila unter Verwendung von Tetrodotoxin-resistenten Natriumkanälen zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie unkompliziert ist und die chemische Natur der Synapsen aufdecken kann. Es eignet sich auch für die Untersuchung des Volumens oder der Massenübertragung.

Im Allgemeinen haben wir bei Videos, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit der Schwierigkeit des Sezierens. Durch das einfache Verständnis der Methode lässt sich die Logik jedoch leicht auf andere Modellsysteme, wie z.B. Mäuse, übertragen. Für die Aufnahmen haben Sie Patch-Pipetten für den Widerstand nahe sieben Megaohm.

Lassen Sie außerdem externe Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,3 oder weniger kontinuierlich mit Carbogen belüften, der 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid enthält. Für die Probanden halten Sie einen Fliegenstock bereit, der csChrimson exprimiert und sich auf Nahrung vermehrt, die 0,2 Millimolar aller trans-Retinal enthält. Wählen Sie für die Aufnahmen ein bis drei Tage alte Erwachsene aus.

Laden Sie sie in ein Szintillationsfläschchen aus Glas und immobilisieren Sie es eine Minute lang unter eiskalten Bedingungen. Senken Sie dann die Lichtstärke am Präparierfernrohr und an der groben Pinzette, um eine betäubte Fliege in die speziell angefertigte Aufnahmekammer zu laden. Befestigen Sie die Fliege an der Kammer, indem Sie sie mit Wachs oder UV-härtendem Epoxidharz umgeben.

Positionieren Sie es mit der Rückenseite nach oben, wobei das Blatt etwa auf halber Höhe des Brustkorbs liegt. Der Schlüssel zu einer guten Vorbereitung besteht darin, das Loch in die Folie genau in die richtige Größe zu schneiden, damit die Fliege nicht gequetscht wird oder durchfallen kann. Beleuchten Sie die Zubereitung von beiden Seiten mit Lichtwellenleitern und halten Sie sie so dunkel wie möglich.

Bedecken Sie das Präparat anschließend mit vier bis sechs Tropfen Kochsalzlösung. Als nächstes schärfst du den Wolframdraht oder das Filament für die Dissektion. Legen Sie etwa 20 Volt Wechselstrom an eine mit Kaliumnitrat gesättigte Lösung an und tauchen Sie die Spitze des Drahtes wiederholt sehr schnell in die Lösung.

Nach 20 Dips ist die Spitze scharf. Stellen Sie nun die Lichter so ein, dass sie gerade genug Sicht bieten, um mit dem geschärften Draht das Gehirn freizulegen, indem Sie die Nagelhaut entfernen, gefolgt von der Luftröhre und den Fettkörpern. Um an die Antennenkeulen zu gelangen, verwenden Sie einen gebogenen Wolframdraht, um die Antenne vorsichtig unter den Folienschirm zu stecken.

Reißen Sie dann mit einer scharfen Pinzette vorsichtig die Gliahülle ab, die den interessierenden Bereich bedeckt. Übertragen Sie nun die Vorbereitung auf das Elektrophysiologie-Rig, um Aufnahmen zu machen. Beginnen Sie am Bohrgerät sofort mit der Perfusion des Präparats mit Aufnahmesalzlösung, die mit Carbogen gesprudelt ist.

Verwenden Sie ein durch Schwerkraft gespeistes Reservoir für Kochsalzlösung, das über dem Mikroskoptisch platziert wird. Um die Kochsalzlösung aufzufangen, verwenden Sie eine Vakuumleitung und einen 2-Liter-Kolben. Beladen Sie anschließend die Patch-Pipette mit 4 Mikrolitern interner Aufzeichnungslösung und befestigen Sie die Pipette an einem Mikromanipulator.

Sie dann den Offset des Verstärkers auf Null und stellen Sie den Verstärker so ein, dass er Testimpulse liefert. Passen Sie dann die IR-Schrägbeleuchtung an, um eine klare Sicht auf das Gehirn zu erhalten. Üben Sie nun Überdruck auf die Pipette aus und nähern Sie sich der Zelle mit der Pipette.

Wenn der Kontakt mit der Zelle hergestellt wird, lassen Sie den Überdruck ab, um die Pipette mit der Membran abzudichten. Stellen Sie dann das Haltepotential der Membran auf minus 60 Millivolt ein. Und die Pipette sollte eine Gigaohm-Dichtung mit der Zellmembran bilden.

Der Haltestrom sollte auf einen möglichst niedrigen Sub-Picoampere-Pegel absinken. Um konstante Gigaohm-Dichtungen zu erhalten, stellen Sie sicher, dass Sie Ihre Pipette sauber halten, indem Sie Überdruck halten und vermeiden, auf das Gewebe zu treffen oder sich Ihren Zellen zu nähern. Um fortzufahren, stellen Sie den Verstärker so ein, dass er Prüfimpulse von minus 50 bis minus 60 Millivolt liefert.

Die Testimpulse zeigen einen großen kapazitiven Transienten, der den Strom darstellt, der zum Laden der Patch-Pipette erforderlich ist. Um die kapazitive Vergänglichkeit zu entfernen, stellen Sie die Kapazitätsausgleichsknöpfe am Verstärker ein. Wenden Sie nun kurze Impulse von Unterdruck an, um die Zellmembran aufzubrechen und die gesamte Zellkonfiguration zu erhalten.

Eine starke Zunahme der kapazitativen Vergänglichkeit deutet auf Erfolg hin. Auch ein geringer Anstieg des Haltestroms ist zu beobachten. Stellen Sie dann den Verstärker auf den Stromzangenmodus ein.

Und stellen Sie das Potential der Zelle auf minus 50 bis minus 60 Millivolt ein. Konfigurieren Sie zur Vorbereitung das Datenerfassungssystem wie im Protokoll des Technikers angegeben. Das System erfordert eine leistungsstarke rote LED, die unter der Präparation positioniert ist und die Fliege mit 0,238 Milliwatt pro Quadratmillimeter beleuchtet.

Aktivieren Sie nun die präsynaptischen Neuronen optogenetisch mit gepulstem rotem Licht bei der csChrimson-Expression. Es können auch andere Methoden verwendet werden. Vor der Anwendung von Tetrodotoxin sollte eine synaptische Verbindung als Reaktion auf einen 40 Millisekunden langen Lichtimpuls sichtbar sein.

Keine Antwort bedeutet, dass eine Verbindung unwahrscheinlich ist. Das Haltepotential kann entsprechend angepasst werden, um die erregenden oder hemmenden Verbindungen zu betonen. Sobald eine Verbindung verifiziert ist, richten Sie die Kochsalzlösung für die Rezirkulation an der Kochsalzlösung ein.

Stellen Sie die Pumpe so ein, dass der Salzgehalt in der Badewanne stabil bleibt. Geben Sie dann genügend Tetrodotoxin in das System für eine Endkonzentration von einem Mikromolaren. Dies sollte die Spike-Aktivität des gepatchten Neurons stoppen.

Wenn nicht, fügen Sie dem System mehr Tetrodotoxin hinzu. Wenden Sie nun kurze Impulse von rotem Licht an, um das zu aktivieren, was wahrscheinlich eine monosynaptische Verbindung ist. Fahren Sie dann mit der Zugabe von pharmakologischen Antagonisten zur rezirkulierenden Kochsalzlösung fort, um die chemische Natur der synaptischen Verbindungen zu testen.

Die transgene Expression des Tetrodotoxins in empfindlichen Natriumkanälen rettet die Erregbarkeit in Neuronen und führt zu einem großen Plateaupotential. Interneurone im Antennenlappen reagieren auf Gerüche. Exzitatorische postsynaptische Ströme lassen sich jedoch am Soma nicht leicht auflösen.

Ergeben sich die Reaktionen also direkt aus dem Input der Geruchsrezeptor-Neuronen? Die Verwendung von tERPs zeigt, dass die olfaktorischen Rezeptorneuronen direkte Verbindungen zu den lokalen Interneuronen herstellen. Die Stimulation der serotonergen Neuronen im Antennenlappen führt zu einer Mischung aus Erregung und Hemmung in lokalen Interneuronen.

Die Applikation von Methysergid, einem breiten 5HT-Rezeptor-Antagonisten, blockierte eine langsame Hyperpolarisation, hatte aber keinen Einfluss auf die Depolarisation, während Mecamylamin die schnelle Depolarisation blockierte. Dies deutet darauf hin, dass die Stimulation cholinerg ist. tERPs wurden verwendet, um die extrasynaptische Volumenübertragung aufzulösen, die entweder mit GABA oder Neuromodulatoren auftritt.

In einem Beispiel unterdrückte die Anwendung von Tetrodotoxin ein hemmendes Signal im lokalen Interneuron nicht. Diese Hemmung wurde mit dem Serotoninantagonisten Methysergid blockiert, was auf ein direktes Signal von einem spezifischen serotonergen Neuron hindeutet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ganzzellaufzeichnungen von Drosophila-Neuronen erhalten und ihre Leitfähigkeit mit tERPs beurteilen können.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, geduldig zu sein und die schwierige Dissektion wiederholt zu üben. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Pharmakologie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Art der chemischen Synapse zu beantworten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tetrodotoxin äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieser Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten mit kleinen Mengen.