Name: Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Untersuchung monosynaptischer Verbindungen in Drosophila mit tetrodotoxin-resistenten Natriumkanälen. Diese Methode nutzt Patch-Clamp-Elektrophysiologie und optogenetische Stimulation zur Analyse synaptischer Übertragung.

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Wir möchten danken Joshua Singer, Jonathan Schenk sowie durchdachte Rezensenten für Kommentare auf das Manuskript. Wir möchten auch Danke Ben White und Harold Zakon für Diskussionen über die Technik. Jonathan Schenk lieferten die Daten für die Abbildung 3A. Diese Arbeit wurde durch ein Whitehall Foundation Grant und einem NIH-R21, QG unterstützt.

1. bereiten Sie fliegen und identifizieren GAL4-Promotor-Linien
<ol><li>Wählen Sie eine GAL4-Promotor-Linie und überqueren sie mit fliegen, die Durchführung des Transgens UAS-NaChBac und ein optogenetische Transgen für die Aktivierung. Hinweis: FH-CsChrimson11 aufgrund seiner hohen Leitfähigkeit und die Leichtigkeit, mit der NaChBac-vermittelten Aktionspotentialen aktiviert, ausgewählt ist. FH-NaChBac und FH-CsChrimson sind aus dem Bloomington Bestände Repository verfügbar.</li>
	<li>Bereiten Sie All-Trans Retinal als eine Stammlösung in Ethanol (35 mM) und speichern Sie die Lösung im Gefrierschrank bei-20 ° C.</li>
	<li>Mix-28 µL von diesem Bestand in etwa 5 mL konzentrierter Kartoffel Essen blättert nicht ab und fügen Sie diese Mischung an die Spitze der ein Fläschchen mit konventionellen Drosophila -Medium.</li>
	<li>Fliegen mit dem Ausdruck CsChrimson auf Lebensmittel, die 0,2 mM All-Trans-Retinal für 1 – 3 Tage11zu erhöhen.</li>
</ol>2. bereiten Sie TTX Lager
<ol><li>Erstellen Sie eine Stammlösung 1 mm TTX in destilliertem oder entionisiertem Wasser. Diese Lösung für mehrere Monate im Labor Kühlschrank aufbewahren. Überprüfen Sie die Institutionen Richtlinien in Bezug auf die Speicherung von TTX, wie viele Institutionen TTX als gefährlich oder kontrollierte Substanz einzustufen.</li>
</ol>3. bereiten Sie fliegen für Elektrophysiologie
<ol><li>Sammeln Sie 1 – 3 Tage alten Erwachsenen fliegen, die ausgelöst werden, auf das Essen mit All-Trans-Retinal. Hinweis: Siehe Murthy und Turner im Jahr 2013 für eine detaillierte Beschreibung der Patch spannen Drosophila Neuronen12,13.</li>
	<li>Legen Sie die fliegen in eine Glasflasche funkeln. Legen Sie das Fläschchen auf Eis für 1 min um die fliegen zu immobilisieren.</li>
	<li>Verwenden Sie grobe Zange um eine Fliege in eine maßgeschneiderte Aufnahme Kammer einzufügen. Die Kammer besteht aus einem 3 ½" Kreis Laser Schnitt von 1/16" Acryl. Schnitt ein Loch ¾" ist in der Mitte, wo eine benutzerdefinierte Folie mit 2-Komponenten-Epoxy befestigt ist. Die Folie enthält eine dreieckige geformte Hoffnung, die die Fliege eingefügt ist.</li>
	<li>Wenden Sie Wachs oder UV heilbar Epoxy rund um das Tier, um es innerhalb der Aufnahme Kammer zu befestigen an.</li>
	<li>Die Vorbereitung mit einem Schwanenhals-Lichtleiter für Visualisierung unter einem Stereomikroskop zu beleuchten. Legen Sie die Schwanenhals-Fasern für Schrägbeleuchtung sie so angepasst, dass sie fliegen direkt von der Seite beleuchten.</li>
	<li>Passen Sie die Lichtintensität auf die niedrigste mögliche Einstellung, noch klare Visualisierung der Fliege ermöglicht. Diese Lichtintensität variiert in einzelnen Experimente. Hinweis: Dieses Protokoll kann angepasst werden durch eine in Situ Gehirn explant Methode14.</li>
	<li>Rufen Sie externe Aufnahme Kochsalzlösung. Die Kochsalzlösung enthält in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-Tris (Hydroxymethyl)-Methyl-2-Aminoethane-Sulfo-Säure, 8 Trehalose, 10 Glukose, 26 Nahco33, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2und 4 MgCl2 (eingestellt auf mΩ 270-275). Die Kochsalzlösung wird mit 95 % O25 % CO2 (Carbogen) übergeben und hat ein pH-Wert 7,315angepasst.</li>
	<li>Platzieren Sie 4-6 Tropfen von extrazellulären Aufnahme Kochsalzlösung über die Fliege Vorbereitung. An diesem Punkt erhöhen Sie die Beleuchtungsstärke am Dissektion Mikroskop für bessere Sichtbarkeit.</li>
	<li>Ein Wolframdraht mit Elektrolyse zu schärfen. Um den Draht zu machen, Vorbereiten einer gesättigten Lösung von KNO3 und ca. 20 V AC Strom nicht anzuwenden, wenn die Spitze des Drahtes in die Lösung 20 Mal für 100 ms eintauchen, bis die Spitze geschärft ist. Verwenden Sie die geschärften Wolframdraht, entfernen die Nagelhaut auf den Kopf der Fliege und damit das Gehirn aussetzen.</li>
	<li>Weiter aussetzen des Gehirns durch Entfernen von Luftröhre und Fett stellen, die sie umgeben. Wenn die Riechzentrum Lappen zugreifen, verwenden Sie eine gebogene Wolframdraht oder ähnliches Werkzeug, sanft tuck Antennen unter der Folie Aufnahme Kammer um die Sichtbarkeit zu erhöhen. Verwenden Sie scharfe Pinzette sanft losreißen der Glia Ummantelung mit einer Fläche von Interesse, wo Aufnahmen gemacht werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Aufnahme-Kammer auf die Elektrophysiologie-Rig. Sofort sprudelte Start Perfusion mit externen Aufnahme Kochsalzlösung mit Carbogen, das Gehirn zu bewahren. Die Kochsalzlösung Reservoir wird über den Mikroskoptisch gesetzt und ist Schwerkraft-gefütterten zur Vorbereitung. Verwenden einer Vakuumleitung und eine 2 L-Erlenmeyerkolben, um die Abfälle Kochsalzlösung zu sammeln.</li>
</ol>4. erhalten Sie Whole-Cell Aufnahme
<ol><li>Ziehen Sie Patch Pipetten auf einem kommerziellen Pipette Abzieher. Konsultieren Sie das Handbuch für Einstellungen, um einen geeigneten Pipette mit einem Tipp-Widerstand in der Nähe von 7 mΩ zu erreichen.</li>
	<li>Fügen Sie 4 µL interne Aufnahme-Lösung in einer Patch-Pipette. Die interne Kochsalzlösung besteht aus 140 Kalium Aspartat-, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA und 1 KCl in mM.</li>
	<li>Patch Clamp Verstärker für die gesamte Zelle Aufnahme eingerichtet. Des Verstärkers Offset Null und legen Sie den Verstärker Testimpulse liefern. Hier wird AM Systeme Patch Clamp Verstärkers 2.400 verwendet.</li>
	<li>Positiver Druck durch die Pipette und nähern sich die Zelle. Verwenden Sie einen Mikromanipulator leiten die Pipette und wenden Sie sich an die Zelle. Entlasten Sie positiven Druck. Satz der Holding-Potenzial der Membran zu-60 mV. Die Pipette sollte eine Gigaohm Dichtung mit der Zellmembran wie durch eine niedrige Sub-Picoamp Haltestrom zu bilden. Hinweis: Wenn mit GFP Zelle Ausrichtung geleitet, versuchen Sie, Einsatz von Epifluorescent Licht auf ChR2 Aktivierung und potenzielle synaptische Depression verhindern zu minimieren. Auch für ein paar Minuten vor dem Auftragen Schritt 5 warten.</li>
	<li>Festlegen den Verstärker liefern Testimpulse von-50 mV bis-60 mV. Diese Einstellung ist standardmäßig in Patch-Clamp-Verstärker. Prüfimpulse zeigen eine große kapazitative transiente repräsentieren die aktuellen notwendig, laden Sie die Patch-Pipette. Entfernen Sie kapazitative Transienten durch Anpassung der Kapazität Entschädigung Knöpfe auf der AM 2400 oder ähnlichen Verstärker.</li>
	<li>Wenden Sie kurze Impulse von Unterdruck, Ruptur der Zellmembran und erhalten ganz-Zell Konfiguration an. Hinweis: Eine ganze Zelle Konfiguration wird beobachtet, wenn gibt es eine große Zunahme der kapazitative Transienten zeigt die Kapazität des Neurons. Eine geringe Erhöhung der Haltestrom (Baseline) wird wahrscheinlich auch beobachtet werden. Den Verstärker zu aktuellen Klemme Modus einstellen und anpassen der Zelle Potential,-50 bis-60 mV.</li>
</ol>5. Testen Sie die synaptischen Konnektivität
<ol><li>Konfigurieren Sie das Datenerfassungssystem (DAQ) um einen LED-Treiber um die Lichtimpulse erzeugen auszulösen. Hier wird eine nationale Instrumente DAQ-System mit Matlab verwendet, um ein analoges Signal auf einen LED-Treiber liefern. Die LED-Intensität wird über das analoge Signal an den Fahrer angepasst. Die LED ist ein 620-630 nm Wellenlänge LED.</li>
	<li>Positionieren Sie die High-Power LED direkt unterhalb der Vorbereitung. Passen Sie die Intensität des Lichts, sodass 0.238 mW/mm2 im Handumdrehen erreicht.</li>
	<li>Aktivieren Sie die präsynaptischen Neuronen während der Aufnahme aus der postsynaptischen Zelle von Interesse. Zelle Aktivierung Optogenetically, Pharmacogentically, zu erreichen oder über Nervenstimulation. Hier sind CsChrimson und kurze Impulse von rotem Licht angewendet. Hinweis: Synaptische Verbindungen können entweder in Stromzange als EPSPs oder Spannung Klemme als EPSCs überwacht werden. Eine synaptische Verbindung sollte sichtbar sein, bevor Sie in Reaktion auf einen Lichtpuls 40 ms TTX anwenden. Wenn keine Verbindung zu beobachten ist, ist es unwahrscheinlich, dass die Nervenzellen synaptisch verbunden entweder Mono- oder polysynaptically. Im Betrieb möglichen kann angepasst werden, um erregenden oder hemmenden Anschlüsse entsprechend zu betonen.</li>
	<li>Wenn eine Verbindung in normalen Kochsalzlösung beobachtet wird die Perfusion System, eine Endkonzentration von 1 zu erreichen TTX hinzufügen verwenden µM eine Umwälzpumpe zu erfassen und Wiederverwenden von Kochsalzlösung um TTX zu sparen. Die peristaltische Pumpe wird Salzlösung aus dem Bad zu ziehen und an der saline Reservoir zurück.</li>
	<li>Passen Sie die Pumpe Geschwindigkeit um ein starkes Vakuum konstant bereitzustellen, das nicht, dass Kochsalzlösung Ebene in der Badewanne zulässt zu steigen und fallen. Hinweis: Die Anwendung der TTX sollte die Einstellung der Spick Aktivität in der Nervenzelle, die ganze Zelle überwacht wird führen. Dies bestätigt, dass die Kochsalzlösung genug TTX hinzugefügt wurde.</li>
	<li>Kurze Impulse von rotem Licht (40 ms bei jedem Impuls) erneut anwenden. An dieser Stelle synaptische Verbindung, die bleibt ist wahrscheinlich monosynaptischen. Die umlaufenden Kochsalzlösung testen die chemische Natur der synaptischen Verbindungen, die bleiben in TTX fügen Sie pharmakologische Antagonisten hinzu. Hinweis: Bei der Kombination von Optogenetik und fluoreszierende Ausrichtung der Neuronen kann es wichtig, nicht zu anhaltend aktivieren die präsynaptischen Bevölkerung der Neuronen bei dem Versuch, eine Aufnahme zu erhalten sein. Dies kann zu synaptische Depression führen und erschwert es, Verbindungen zu sehen. Da CsChrimson eine lange Erregung Band, die weitgehend in den Bereich des grün fluoreszierenden Proteins erstreckt hat, kann eine rote Fluorophor verwendet werden, um Neuronen und channel2rhodopsin visualisieren (Ch2R) kann verwendet werden, um Zellpopulationen zu begeistern. Dies erfordert spezielle Genetik und einen benutzerdefinierten Filter-Cube. Um geeignete fliegen zu erzeugen, machen Sie fliegen, die die rote Fluorophor (RFP oder mCherry) ausdrücken unter die LexA oder Q-System binärer Ausdruck Systeme. Diese müssen mit der Fliege Gal4 Förderer und FH-Ch2R und FH-NaChBac-Effektor-Gene auszudrücken überquert werden. Der optimale Filter-Cube für Epifluoreszenz haben eine Reihe von schmalen Erregung zu begeistern die rote Fluorophor, aber nicht begeistern Ch2R. zusätzlich, die Filter-Set sollte einen langen Pass Emission Filter, um möglichst viel emittierte Licht zu sammeln. Wir verwendeten einen benutzerdefinierten Filter set von Chroma, die Teil-Nummern et580/25 X und t600lpxr (aus dem 49306 Satz), enthalten aber mit einem et610lp Barriere/Emission Filter.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Terpen Analyse ergänzt aktuelle Techniken zur Schaltung Rissbildung durch ermöglicht die Erkennung von Synapsen zwischen bestimmten Nervenzellen verwendet. Insbesondere offenbart der Ansatz monosynaptische Verbindungen im großen und ganzen Aktionspotentiale mit TTX-Stummschaltung während der Wiederherstellung Erregbarkeit in einer ausgewählten Population von Neuronen mit dem TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac. Synaptischen Freisetzung wird durch optogenetische Stimulation ausgelöst, während postsynaptischen Veranst...

Ein wesentliches Ziel der Neurowissenschaften ist, ordnen Sie die Verbindungen zwischen den Neuronen zu verstehen, wie Informationen über Schaltkreise fließt. Zahlreiche Ansätze und Ressourcen haben, um funktionelle Verknüpfung zwischen den Neuronen in einer Reihe von Modell-Systeme1,2Testen verfügbar. Um die genauesten Schaltpläne mit Elektrophysiologie zu erzeugen, ist es wichtig, zu lösen, ob beobachtete Verbindungen zwischen zwei Zellen direkt und monosynaptischen versus indirekte und polysynaptische sind. Ein Gold-Standard für die Herstellung dieser Unterscheidung in Säugetier-Neuronen ist die Wartezeit zwischen den einzelnen Action potentials in den präsynaptischen Zellen und dem Beginn der exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) in der zweiten Nervenzelle messen. Monosynaptische Verbindungen sollten kurze Wartezeiten von ein paar Millisekunden und geringe Variabilität3haben. Dieser Ansatz kann in Wirbellosen Neuronen kompliziert sein, denn Synapsen in ihre Dendriten weit von der somatische Aufnahme Website, was zu Verzögerungen in der Erkennung durch lange electrotonic Abstände zwischen postsynaptischen maßgearbeitet und der Aufnahme auftreten können Elektrode. Solche Verzögerungen können Unklarheiten bezüglich Poly-im Vergleich zu monosynaptischen Beiträge vorstellen. Darüber hinaus kleine synaptische Ereignisse kann vor Erreichen der somatischen Aufnahmen Website zerfallen, und fahren stärker präsynaptischen Aktivität wird voraussichtlich polysynaptische Veranstaltungen zu rekrutieren.
Verschiedene Techniken sind entwickelt worden, um für monosynaptischen Verbindungen bei Wirbellosen zu testen. Ein Ansatz setzt hohe zweiwertigen kationen (Hi-Di) mit überschüssigem Mg++ und Ca++. Diese Lösung blockiert polysynaptische Verbindungen durch reduzierende Release Wahrscheinlichkeit und zunehmende Aktionspotential Schwelle, Erkennung von monosynaptischen Eingang4,5zu bevorzugen. Bestimmung der genauen Verhältnis von Mg++ bis ca.++ erforderlich, jedoch ist nicht trivial und polysynaptische Beiträge können selbst bescheidene Stimulation6anhalten. Ein alternativer Ansatz namens GFP Rekonstitution über Synaptic Partner (GRASP) nutzt die Nähe zwischen Prä- und postsynaptischen Membranen gefunden an den Synapsen, einem monosynaptischen Verbindung 7abzuleiten. Hier eine Komponente des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) äußert sich in einer Nervenzelle und der ergänzenden Fragment des Moleküls drückt sich in einem vermeintlichen postsynaptischen Partner. Das Vorhandensein der Fluoreszenz zeigt, dass die zwei Neuronen sind in der Nähe genug, Rekonstitution des GFP-Moleküls zu gestatten und setzt die Existenz einer Synapse. Griff kann Synapsen falsch, jedoch melden, wenn zwei Zellen eng Membranen, wie in einem Nerv oder Faszikel apposed haben. Varianten von GRASP beseitigen solche Fehlalarme durch begrenzen der präsynaptischen Fragments der GLP direkt an Synaptobrevin, wodurch Rekonstitution nur bei aktiven Synapsen8. Während Griff und seine Varianten Bestimmung funktionelle Verknüpfung bei der Drosophila CNS beigetragen haben, können einige Verbindungen nicht sichtbar gemacht werden durch Verständnis wenn die Abstände zwischen Prä- und postsynaptischen Partner ist relativ groß. Dies ist besonders relevant bei der Bewertung der Lautstärke Übertragung Neuromodulation9 oder GABAergen Hemmung10zugeordnet.
Hier zeigt sich eine ergänzende und neuartige Technik zum Testen monosynaptischen Direktverbindungen in Drosophila CNS. Diese Methode, genannt Tetrodotoxin entwickelt Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN), funktioniert durch Co Ausdruck von Tetrodotoxin (TTX)-resistenten Natrium-Kanal, NaChBac und Aktivator optogenetische in einer präsynaptischen Zelle während der Aufnahme von vermeintlichen postsynaptischen Partner9. In Anwesenheit von TTX wird alle Aktionspotential-vermittelte Aktivität in den Zellen als die mit dem Ausdruck NaChBac unterdrückt. Der NaChBac-Kanal wird selektiv Erregbarkeit in die gezielte präsynaptischen Zellen bei schönem Licht-evozierten synaptische Übertragung wiederhergestellt. Diese Methode ermöglicht starke Aktivierung der präsynaptischen Neuronen, so dass Verbindungen postsynaptically durch somatische Aufnahme und reduziert die Wahrscheinlichkeit von recruiting polysynaptische Schaltungen gelöst werden können. Wichtig ist, diese Technik erlaubt die Untersuchung der Volumen-Übertragung und zeigt die Verbreitung des Senders aus ein einzelnes Neuron in einer Schaltung entlassen. Darüber hinaus können Terpen die chemische Natur der Verbindung durch konventionelle Pharmakologie offenbaren. Terpen eignet sich für den Einsatz in jedem Modellsystem, das die transgenen Ausdruck der TTX-unempfindliche Natriumkanäle ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Wird als neuronaler Aktivator verwendet</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Resotores Erregbarkeit in Zellen in TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tochris</td><td>1078</td> Für <td>den Kauf von TTX kann eine Sondergenehmigung erforderlich sein, da es sich um eine kontrollierte Substanz</td></tr><tr><td>handelt.</td><td> trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Co-Faktor für Kanalrhodopsin</td></tr><tr><td>schweißbarer Edelstahl 321 erforderlich&nbsp; Blatt,&nbsp; 0.002"&nbsp; Dick,&nbsp; 10" &nbsp; Wide</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Wird verwendet, um benutzerdefinierte Fliegenhalter herzustellen. Benutzerdefinierte Folie kann bei pololu.com aus der bereitgestellten PDF-Datei lasergeschnitten werden</td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Wird zum Sezieren der</td></tr><tr><td>Vorbereitung verwendet Waxer</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Wird während der Dissektion verwendet, um die Fliege in der Folie zu sichern</td></tr><tr><td>Paraffinwachs</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>Wird mit Waxer</td></tr><tr><td>Number 5 Pinzette Fine</td><td>Science Tools</td> verwendet<td>#5CO</td><td>Wird zum Sezieren und Enthüllen</td></tr><tr><td>verwendet Dissektionsschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>Wird verwendet, um Teile der Nagelhaut während der Dissektion zu entfernen</td></tr><tr><td>Wolframdraht</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Verwendung mit Elektrolyse zur Herstellung von geschärften Nadeln für die Dissektion</td></tr><tr><td>Umlaufpumpe Peristaltic Pump</td><td>Simply Pumps (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>für die Umwälzung TTX</td></tr><tr><td>Speed Controller für Peristaltische Pumpe</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM Dimmsteuerung für LED-Leuchten oder Bänder, 12 Volt 8 Ampere, einstellbare Helligkeit Lichtschalter Dimmer Controller DC12V 8A 96W für LED-Streifenlicht B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&nbsp; Präzisions-Druckluftregler</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>Zum Anlegen von Überdruck beim Patchen</td></tr><tr><td>Glaskapilare</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>Für Patch-Pipetten</td></tr><tr><td>Mehrzweck-Manometer</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Manometer für Druckregler</td></tr><tr><td>Elektrophysiologie Kamera</td><td>Dage MTI&nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>Jede Kamera, die im IR-Bereich (850 nm) arbeitet, funktioniert. Sie möchten keine rote Beleuchtung verwenden, da dies csChrimson</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs aktivieren kann&nbsp;</td><td>M850F2</td><td>Für schräge Beleuchtungsfaseroptik</td></tr><tr><td>für IR-LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Kopplung an IR-LED-Objektiv</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>Dies kann auf den meisten Mikroskopen verwendet werden und eignet sich gut zur Visualisierung von Fliegenneuronen.</td></tr><tr><td>Amber LED</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>Zur Visualisierung von RFP und mCherry</td></tr><tr><td>Blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>M470L3d</td><td>Zur Visualisierung von GFP</td></tr><tr><td>GFP Filterset</td><td>Chroma</td><td>49011</td><td>Zur Visualisierung von GFP oder zur Stimulation von channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Custom mCherry Filter Set</td><td>Chroma</td><td>&nbsp; et580/25x und t600lpxr (aus dem 49306-Set), jedoch mit einer et610lp Barriere-/Emissionsoptik</td><td>Verwenden Sie diese Option nur, wenn Sie identifizierte Neuronen mit channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic patchen möchten, um bernsteinfarbene und blaue LED-Thorlabs zu kombinieren</td><td></td><td>. DMLP550R</td><td>Verwenden Sie nur das Pflaster unter mCherry und regen Sie channel2rhodopsin mit blauem Licht an.</td></tr><tr><td>Rote</td><td>LED-LEDSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Zur Ansteuerung des csChrimson</td></tr><tr><td>LED-Treibers</td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Zur Ansteuerung von LEDs für die optogenetische</td></tr><tr><td>Stimulation Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Zur Positionierung der Pipette während der Aufnahme</td></tr><tr><td>Patchclamp Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Modell 2400</td><td>Ein gleichwertiger Verstärker ist geeignet</td></tr><tr><td>Bessel Filter</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Hilfsfilter zum Filtern der Stromspur zum Oszilloskop während des Patchens.</td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 781044-01</td><td>Zum Aufzeichnen von Daten vom Verstärker zum Computer</td></tr><tr><td>Anschlussblock - BNC-Anschluss BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Zum Anschließen des Verstärkers an die Datenerfassungskarte.</td></tr><tr><td>Stahlfolie&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Stahlfolie für kundenspezifische Aufnahmekammer</td></tr><tr><td>Magnete</td><td>K& J Magnetics</td><td>D42</td><td>Zum Befestigen der Aufnahmekammer am Ringständer</td></tr><tr><td>1/16" Zelle Gegossenes Acryl Klar</td><td>Pololu</td><td></td><td>Wird verwendet, um eine benutzerdefinierte Aufnahmekammer herzustellen. Acryl kann bei pololu.com aus der bereitgestellten PDF-Datei lasergeschnitten werden</td></tr></tbody></table>

prüfung der monosynaptische verbindungen in drosophila mit tetrodotoxin resistente natriumkanäle

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Hier ist eine neue Technik, genannt Tetrotoxin (TTX) Engineered Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN) angewendet, um monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen Ziel zu testen. Die Methode beruht auf Co Ausdruck einer transgenen Aktivator mit dem Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac, in ein bestimmtes präsynaptischen Neuron. Verbindungen mit vermeintlichen postsynaptischen Partner richten sich nach ganzen Zelle Aufnahmen im Beisein von TTX, die elektrischen Aktivität in Nervenzellen blockiert, die nicht NaChBac ausdrücken. Dieser Ansatz kann geändert werden, um mit Aktivator oder Kalzium Imaging als Reporter der Verbindungen arbeiten. Terpen verleiht den wachsenden Satz von Werkzeugen für die Bestimmung der Konnektivität innerhalb von Netzwerken zur Verfügung. WARFTEN ist jedoch eindeutig, dass es auch zuverlässig Masse oder Volumen Übertragung und Spillover Übertragung meldet.

Terpen dient zur Unterscheidung zwischen Mono- und polysynaptische Beiträge in synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen. Während schwache Stimulation einer Zelle verwendet werden, um direkte Verbindungen zu testen, Rekruten fahren größeren präsynaptischen Aktivität oft polysynaptische Verbindungen (Abbildung 1A). Terpen funktioniert durch die TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac und Aktivator optogenetische Co zum Ausdruck zu bringen, und testen Ve...

Dieser Artikel bietet eine Methode, um die monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen durch Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac testen.

Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, monosynaptische Verbindungen elektrophysiologisch in Drosophila unter Verwendung von Tetrodotoxin-resistenten Natriumkanälen zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie unkompliziert ist und die chemische Natur der Synapsen aufdecken kann. Es eignet sich auch für die Untersuchung des Volumens oder der Massenübertragung.Im Allgemeinen haben wir bei Videos, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit der Schwierigkeit des Sezierens. Durch das einfache Verständnis der Methode lässt sich die Logik jedoch leicht auf andere Modellsysteme, wie z.B. Mäuse, übertragen. Für die Aufnahmen haben Sie Patch-Pipetten für den Widerstand nahe sieben Megaohm.Lassen Sie außerdem externe Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,3 oder weniger kontinuierlich mit Carbogen belüften, der 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid enthält. Für die Probanden halten Sie einen Fliegenstock bereit, der csChrimson exprimiert und sich auf Nahrung vermehrt, die 0,2 Millimolar aller trans-Retinal enthält. Wählen Sie für die Aufnahmen ein bis drei Tage alte Erwachsene aus.Laden Sie sie in ein Szintillationsfläschchen aus Glas und immobilisieren Sie es eine Minute lang unter eiskalten Bedingungen. Senken Sie dann die Lichtstärke am Präparierfernrohr und an der groben Pinzette, um eine betäubte Fliege in die speziell angefertigte Aufnahmekammer zu laden. Befestigen Sie die Fliege an der Kammer, indem Sie sie mit Wachs oder UV-härtendem Epoxidharz umgeben.Positionieren Sie es mit der Rückenseite nach oben, wobei das Blatt etwa auf halber Höhe des Brustkorbs liegt. Der Schlüssel zu einer guten Vorbereitung besteht darin, das Loch in die Folie genau in die richtige Größe zu schneiden, damit die Fliege nicht gequetscht wird oder durchfallen kann. Beleuchten Sie die Zubereitung von beiden Seiten mit Lichtwellenleitern und halten Sie sie so dunkel wie möglich.Bedecken Sie das Präparat anschließend mit vier bis sechs Tropfen Kochsalzlösung. Als nächstes schärfst du den Wolframdraht oder das Filament für die Dissektion. Legen Sie etwa 20 Volt Wechselstrom an eine mit Kaliumnitrat gesättigte Lösung an und tauchen Sie die Spitze des Drahtes wiederholt sehr schnell in die Lösung.Nach 20 Dips ist die Spitze scharf. Stellen Sie nun die Lichter so ein, dass sie gerade genug Sicht bieten, um mit dem geschärften Draht das Gehirn freizulegen, indem Sie die Nagelhaut entfernen, gefolgt von der Luftröhre und den Fettkörpern. Um an die Antennenkeulen zu gelangen, verwenden Sie einen gebogenen Wolframdraht, um die Antenne vorsichtig unter den Folienschirm zu stecken.Reißen Sie dann mit einer scharfen Pinzette vorsichtig die Gliahülle ab, die den interessierenden Bereich bedeckt. Übertragen Sie nun die Vorbereitung auf das Elektrophysiologie-Rig, um Aufnahmen zu machen. Beginnen Sie am Bohrgerät sofort mit der Perfusion des Präparats mit Aufnahmesalzlösung, die mit Carbogen gesprudelt ist.Verwenden Sie ein durch Schwerkraft gespeistes Reservoir für Kochsalzlösung, das über dem Mikroskoptisch platziert wird. Um die Kochsalzlösung aufzufangen, verwenden Sie eine Vakuumleitung und einen 2-Liter-Kolben. Beladen Sie anschließend die Patch-Pipette mit 4 Mikrolitern interner Aufzeichnungslösung und befestigen Sie die Pipette an einem Mikromanipulator.Stellen Sie dann den Offset des Verstärkers auf Null und stellen Sie den Verstärker so ein, dass er Testimpulse liefert. Passen Sie dann die IR-Schrägbeleuchtung an, um eine klare Sicht auf das Gehirn zu erhalten. Üben Sie nun Überdruck auf die Pipette aus und nähern Sie sich der Zelle mit der Pipette.Wenn der Kontakt mit der Zelle hergestellt wird, lassen Sie den Überdruck ab, um die Pipette mit der Membran abzudichten. Stellen Sie dann das Haltepotential der Membran auf minus 60 Millivolt ein. Und die Pipette sollte eine Gigaohm-Dichtung mit der Zellmembran bilden.Der Haltestrom sollte auf einen möglichst niedrigen Sub-Picoampere-Pegel absinken. Um konstante Gigaohm-Dichtungen zu erhalten, stellen Sie sicher, dass Sie Ihre Pipette sauber halten, indem Sie Überdruck halten und vermeiden, auf das Gewebe zu treffen oder sich Ihren Zellen zu nähern. Um fortzufahren, stellen Sie den Verstärker so ein, dass er Prüfimpulse von minus 50 bis minus 60 Millivolt liefert.Die Testimpulse zeigen einen großen kapazitiven Transienten, der den Strom darstellt, der zum Laden der Patch-Pipette erforderlich ist. Um die kapazitive Vergänglichkeit zu entfernen, stellen Sie die Kapazitätsausgleichsknöpfe am Verstärker ein. Wenden Sie nun kurze Impulse von Unterdruck an, um die Zellmembran aufzubrechen und die gesamte Zellkonfiguration zu erhalten.Eine starke Zunahme der kapazitativen Vergänglichkeit deutet auf Erfolg hin. Auch ein geringer Anstieg des Haltestroms ist zu beobachten. Stellen Sie dann den Verstärker auf den Stromzangenmodus ein.Und stellen Sie das Potential der Zelle auf minus 50 bis minus 60 Millivolt ein. Konfigurieren Sie zur Vorbereitung das Datenerfassungssystem wie im Protokoll des Technikers angegeben. Das System erfordert eine leistungsstarke rote LED, die unter der Präparation positioniert ist und die Fliege mit 0,238 Milliwatt pro Quadratmillimeter beleuchtet.Aktivieren Sie nun die präsynaptischen Neuronen optogenetisch mit gepulstem rotem Licht bei der csChrimson-Expression. Es können auch andere Methoden verwendet werden. Vor der Anwendung von Tetrodotoxin sollte eine synaptische Verbindung als Reaktion auf einen 40 Millisekunden langen Lichtimpuls sichtbar sein.Keine Antwort bedeutet, dass eine Verbindung unwahrscheinlich ist. Das Haltepotential kann entsprechend angepasst werden, um die erregenden oder hemmenden Verbindungen zu betonen. Sobald eine Verbindung verifiziert ist, richten Sie die Kochsalzlösung für die Rezirkulation an der Kochsalzlösung ein.Stellen Sie die Pumpe so ein, dass der Salzgehalt in der Badewanne stabil bleibt. Geben Sie dann genügend Tetrodotoxin in das System für eine Endkonzentration von einem Mikromolaren. Dies sollte die Spike-Aktivität des gepatchten Neurons stoppen.Wenn nicht, fügen Sie dem System mehr Tetrodotoxin hinzu. Wenden Sie nun kurze Impulse von rotem Licht an, um das zu aktivieren, was wahrscheinlich eine monosynaptische Verbindung ist. Fahren Sie dann mit der Zugabe von pharmakologischen Antagonisten zur rezirkulierenden Kochsalzlösung fort, um die chemische Natur der synaptischen Verbindungen zu testen.Die transgene Expression des Tetrodotoxins in empfindlichen Natriumkanälen rettet die Erregbarkeit in Neuronen und führt zu einem großen Plateaupotential. Interneurone im Antennenlappen reagieren auf Gerüche. Exzitatorische postsynaptische Ströme lassen sich jedoch am Soma nicht leicht auflösen.Ergeben sich die Reaktionen also direkt aus dem Input der Geruchsrezeptor-Neuronen? Die Verwendung von tERPs zeigt, dass die olfaktorischen Rezeptorneuronen direkte Verbindungen zu den lokalen Interneuronen herstellen. Die Stimulation der serotonergen Neuronen im Antennenlappen führt zu einer Mischung aus Erregung und Hemmung in lokalen Interneuronen.Die Applikation von Methysergid, einem breiten 5HT-Rezeptor-Antagonisten, blockierte eine langsame Hyperpolarisation, hatte aber keinen Einfluss auf die Depolarisation, während Mecamylamin die schnelle Depolarisation blockierte. Dies deutet darauf hin, dass die Stimulation cholinerg ist. tERPs wurden verwendet, um die extrasynaptische Volumenübertragung aufzulösen, die entweder mit GABA oder Neuromodulatoren auftritt.In einem Beispiel unterdrückte die Anwendung von Tetrodotoxin ein hemmendes Signal im lokalen Interneuron nicht. Diese Hemmung wurde mit dem Serotoninantagonisten Methysergid blockiert, was auf ein direktes Signal von einem spezifischen serotonergen Neuron hindeutet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ganzzellaufzeichnungen von Drosophila-Neuronen erhalten und ihre Leitfähigkeit mit tERPs beurteilen können.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, geduldig zu sein und die schwierige Dissektion wiederholt zu üben. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Pharmakologie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Art der chemischen Synapse zu beantworten.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tetrodotoxin äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieser Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten mit kleinen Mengen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

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