Name: Untersuchung der RNS-Synthese mit 5-Bromouridine Kennzeichnung und Immunopräzipitation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Lernen Sie die Messung der RNA-Synthese durch Bromouridin-Kennzeichnung und Immunopräzipitation in Zellkulturen. Diese Methode ermöglicht Forschern, Veränderungen der RNA-Metabolismus-Dynamik zu untersuchen.

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Die Lundbeck-Stiftung, Universität Aarhus, Dandrite und Lundbeck a/s unterstützt diese Arbeit.

Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben und halten Sie Puffer auf Eis oder in den Kühlschrank stellen (mit Ausnahme von der Elution buffer mit SDS). Das Protokoll ist in 5 Abschnitte unterteilt: Vorbereitung der RNA-Proben; Vorbereitung der Perlen für IP; Bindung von BrU gekennzeichnet RNA zu Perlen; Elutions- und Reinigung des gebundenen BrU gekennzeichnet RNA durch 3 Stufen Phenol-Phenol/Chloroform-Chloroform Extraktion; Analyse der RNA (in diesem Beispiel mit RT-qPCR)
1. Vorbereitung des RNA-Proben
<ol><li>Graf HEK293T Zellen unter Verwendung einer automatisierten Zelle entgegenzuwirken und Saatgut 3.500.000 Zellen in einer 10 cm Petrischale in 10 mL Wachstumsmedien (Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum und 50 µg/mL Penicillin/Streptomycin) um insgesamt zu erhalten > 40 µg RNA bei der Extraktion 48 h später. Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2zu erhalten.</li>
	<li>48 h nach der Aussaat, Aspirieren Wachstumsmedien 8 mL und 2 mL auf die Zellen Austrocknen vermeiden hinterlassen. Fügen Sie 2 mM BrU und jede Behandlung auf die 8 mL aspiriert Wachstumsmedien, und entfernen Sie die restlichen 2 mL aus den Zellen vor erneuten 8 mL enthaltende Wachstumsmedien BrU. Vermeiden Sie den Einsatz von frischen Medien auf Antrag von der BrU an den Zellen, da diese Änderungen in der Genexpression zu induzieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen 1 h mit BrU und Behandlung. Waschen Sie die Zellen in 5 mL Hank Puffer und trypsinize der Zellen unter Verwendung von 2 mL 0,05 % Trypsin. Fügen Sie 8 mL Wachstumsmedien um die Reaktion zu stoppen, die Zellen an eine 15 mL Tube übertragen und spin-down der Zellen für 2 min bei 1.000 x g hinzu.</li>
	<li>Entfernen den überstand und Gesamt-RNS aus der Zelle Pellet mit RNA Isolierung extrahieren kit (siehe Tabelle der Materialien) oder jede andere Methode bevorzugt, und eluieren in RNase-freie H2O. Store die RNA bei-80 ° C bis bereit zu gehen.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Perlen für IP
<ol><li>Die Anzahl der Samples zu untersuchenden plus eins extra abzurechnen Verlust beim pipettieren und wirbeln mischen bereiten Sie Perlen in Chargen vor. Aufschwemmen Sie Anti-Maus IgG magnetische Beads gründlich durch das Mischen von Wirbel und nehmen Sie 20 µL Perlen pro Probe in eine RNase-freie 1,5 mL-Tube. Ort der 1,5 mL Tube in einem Magnetstativ und lassen ca. 20 s für die Perlen auf der Seite zu sammeln.</li>
	<li>Den überstand zu entfernen, nehmen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ und Aufschwemmen in 400 µL 1 X BrU-IP-Puffer durch pipettieren. Drehen Sie das Rohr ganz kurz für 2 s in einer Zentrifuge Tischplatte legen Sie sie zurück in die Magnetstativ und den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die Waschschritt einmal.</li>
	<li>Block unspezifische Bindung an die Perlen mit Heparin. Aufschwemmen der Perlen in 1 mL 1 X BrU-IP + 1 mg/mL Heparin Puffer und drehen für 30 min. waschen die Perlen einmal, wie in Schritt 2.2 verlassen. Hinweis: Heparin ist ein negativ geladenes Polymer, das für die Bindung mit RNAs konkurrieren. tRNA oder andere irrelevant RNAs können auch verwendet werden, wenn die nachgeschaltete Anwendung nicht Sequenzieren ist.</li>
	<li>Aufschwemmen der Perlen in 1 mL 1 x BrU-IP-Puffer und 1,25 µg/Probe Anti-α-Bromodeoxyuridine Antikörper, der erkennt auch BrU hinzufügen. Inkubieren Sie die Perlen für 1 h beim Drehen, oder über Nacht bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen dreimal wie in Schritt 2.2. Aufschwemmen der Perlen in 50 µL/Probe 1 X BrU-IP-Puffer mit 1 mM BrU und lassen drehen für 30 min, die Empfindlichkeit der Antikörper gebunden, die Perlen und hiermit zu senken das Risiko der unspezifischen Bindung UZ ergänzt.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen dreimal wie in Schritt 2.2 und Aufschwemmen in 50 µL/Probe 1xBrU-IP-Puffer.</li>
</ol>3. verbindliche BrU gekennzeichnet RNA, Perlen
<ol><li>RNA-Konzentrationen in der RNA-Auszüge aus Schritt 1.3 Messen mit Ultraviolett-sichtbare Spektrophotometrie, und 40 µg RNA von jeder Probe in RNase-freie H2O auf ein Gesamtvolumen von 200 µL zu verdünnen.</li>
	<li>Erwärmen Sie RNA-Proben für 2 min bei 80 ° C zu denaturieren RNA und Spin kurz in einer Tischplatte Zentrifuge. Fügen Sie 200 µL 2 x BrU-IP + BSA/RNAse-Inhibitor.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Nukleinsäuretablette und Perlen aus Schritt 2.6 zu jeder Probe vorbereitet und rotierenden 1H waschen die Perlen viermal wie in Schritt 2.2 zu verlassen.</li>
</ol>4. Elutions- und Reinigung der RNA durch 3 Stufen Phenol-Phenol/Chloroform-Chloroform Extraktion
<ol><li>
Eluieren Sie RNA und durchführen Phenol Extraktion
	<ol>
<li>Aufschwemmen der Perlen in 200 µL Elution Puffer zu eluieren RNA, und schnell Danach fügen Sie 200 µL Phenol, pH 6,6 (Vorsicht: giftig, siehe Hinweis unten Schritt 4.1.2), nicht-RNA-Moleküle aus der Probe zu entfernen.</li>
		<li>Whirl-Mischung der Probe und Spin 3 min bei 25.000 x g in einer Tischplatte Zentrifuge. Hinweis: Phenol ist giftig und sollte in einer Dampfhaube Verschleißschutz Haut behandelt werden. Die leicht saure pH-Wert sorgt dafür, dass nur RNA und nicht DNA extrahiert. Die RNA wird in der oberen wässrigen Phase aufgrund der hydrophilen Gebühren bleiben. Die hydrophobe Kerne von Proteinen werden Phenol zu binden und die untere Bio Phenol-Phase bewegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Phenol-Chloroform Extraktion durchführen
	<ol>
<li>Aspirieren Sie soviel obere Phase wie möglich (ca. 190 µL 200 µL, je nach Erfahrung im Handling) und verschieben Sie ihn auf ein Rohr mit 200 µL Phenol/Chloroform, pH 6,6 (Vorsicht: giftig, siehe Anmerkung). Achten Sie darauf, die gleiche Menge über Proben Aspirieren.</li>
		<li>Whirl Mischen der Probe und Spin für 3 min bei 25.000 x g. Hinweis: Chloroform ist giftig und sollte in einer Dampfhaube Verschleißschutz Haut behandelt werden. Chloroform wird hinzugefügt, Phenol, entfernen die nachgelagerte Analyse der RNA durch Hemmung der reversen Transkription14 und Polymerase-Kettenreaktionen15beeinflussen können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chloroform Extraktion durch Absaugen der oberen wässrigen Phase als vor (jetzt rund 180 µL) durchzuführen und zu einem Schlauch mit 200 µL Chloroform übertragen. Whirl mischen die Probe und spin 3 min bei 25.000 x g.</li>
	<li>Aspirieren der oberen wässrigen Phase als vor (jetzt ca. 170 µL) und überträgt es auf ein Rohr mit 17 µL (1/10-bändige) 3 M CH3COONa, pH 6.0. Fügen Sie zu neutralisieren und RNA aus der wässrigen Lösung auszufällen, 2 µL Glykogen (20 mg/mL), die Ausscheidungen zusammen mit RNA und RNA-Pellet sichtbarer macht.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL 96 % Ethanol um Bindung zwischen den Salzionen und RNA und Mischung zu erhöhen durch Umdrehen der Röhre ein paar Mal. Lassen Sie das Röhrchen über Nacht bei-20 ° C oder 15 min auf Trockeneis.</li>
	<li>Drehen Sie die Probe bei 25.000 x g, 4 ° C für 30 min. verwerfen überstand ohne zu stören das Pellet und waschen Sie das Pellet in 185 µL 75 % Ethanol, Salz zu entfernen. Mit 25.000 x g, 4 ° C für 5 min drehen.</li>
	<li>Verwerfen Sie überstand vollständig zu, ohne zu stören das Pellet und lassen Sie das Pellet 5-10 min mit einem geöffnetem Deckel trocknen. Aufschwemmen Sie in 10 µL RNase-freie H2O auf der Seite der Röhre angewendet, um nicht zu stören das Pellet.</li>
</ol>5. Analyse der RNA
<ol><li>Bereiten Sie cDNA mit einer cDNA reversen Transkription kit (siehe Tabelle der Materialien) oder jede andere bevorzugte Methode mit 2 µL RNA-Probe und 1 µg Hefe Gesamt-RNS als Träger RNA für die cDNA-Synthese-Reaktion (nicht verwendet, wenn cDNA für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet wird). Verwenden Sie 1 µg RNA ohne Hefe RNA für cDNA Vorbereitung der entsprechenden Eingabe.</li>
	<li>Verdünnte cDNA 01:25 und Mix 9 µL verdünnt cDNA mit 10 µL qPCR Mischung und 1 µL Fluorogenic Sonde, beherrschen beide angegeben in der Tabelle der Materialien. Hinweis: Die cDNA-Verdünnung richtet sich nach der cDNA Vorbereitung und qPCR-Methode verwendet.</li>
	<li>Führen Sie das folgende qPCR-Programm (z. B. auf einem 7500 schnell Real-Time PCR System oder Äquivalent): 2 min bei 50 ° C, 20 s bei 95 ° C, 40 Zyklen von 3 s bei 95 ° C und 30 s bei 60 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase+2+modulates+%CE%B1-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).</li>
<li>Imamachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRIC-seq%3A+A+genome-wide+approach+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells.</a> Methods. 67, 55-63 (2014).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+and+its+Misregulation+in+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease.</a> Cell. 152, 1237-1251 (2014).</li>
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<li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz des BrU-IP für Bestimmung der RNA-Produktion durch Kennzeichnung von neu RNA für 1 h mit BrU produzierten, gefolgt von sofortige RNA-Extraktion und Immunopräzipitation BrU gekennzeichnet RNA. Diese Methode ist bisher in Referenz16beschrieben worden, und dieser Artikel enthält einige zusätzliche Schritte, um IP-Spezifität und RNA Reinheit, von Pre-Behandlung von Perlen mit niedrigen Konzentrationen von BrU sowie eine Phenol-Chloroform Reinigungsstufe zu erhöh...

5-Bromouridine (BrU) Immunopräzipitation (IP) ermöglicht die Untersuchung der RNA-Produktion in Zellen ohne oder sehr begrenzte Auswirkungen auf die Zelle Physiologie während der kurzen Periode1,2Kennzeichnung. Die Methode basiert auf Einbeziehung der synthetischen Uridin Ableitung BrU in neu synthetisierte RNA gefolgt von IP-Adresse des gekennzeichneten RNA mit Anti-BrU-Antikörpern (Abbildung 1).
Es ist bekannt für Jahrzehnte die Proteinsynthese transcriptionally geregelt werden kann, und die Existenz von Transkriptionsfaktoren wurde vor mehr als 50 Jahren die Hypothese3. Heute ist bekannt, dass verschiedene Krankheiten durch Dysregulation der Transkription und der Stabilität der RNA entstehen (ergänzende Abbildung S1 in Referenz4), und die Fähigkeit, Veränderungen in der Produktion von RNA zu messen ist von großer Bedeutung im Verständnis der Krankheit Entwicklung.
Auf der anderen Seite bieten Werkzeuge, RNA-Produktion zu regulieren neue Möglichkeiten für die Behandlung von Krankheiten, die durch zu wenig oder zu viel Protein-Expression oder Protein Akkumulation wie z. B. bei Morbus Parkinson (PD). Das vorherrschende Protein akkumulieren als unlösliche Aggregate in PD ist α-Synuclein und das Niveau der α-Synuclein knüpft direkt an die Krankheit, wie gen-Multiplikation des α-Synuclein Gens familiäre PD5verursacht. Darüber hinaus sammelt α-Synuclein in gewissem Sinne Konzentration abhängig. Herabregulation von α-Synuclein-mRNA-Niveaus ist daher eine interessante therapeutische Strategie, die erfolgreich erreicht worden ist, mit RNA-Interferenz, um neuronaler Zellverlust im PD Nager-Modelle6,7zu verringern.
Es ist wichtig, um Änderungen in der RNA Produktion verursacht durch Krankheit oder therapeutische Interventionen zu messen können. Modernste Methoden verändert für Steady-State Messhöhen RNA, wie reverse Transkription, gefolgt von quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR), nicht in der Lage sind, die Unterscheidung zwischen Änderungen durch transcriptional Regelung oder RNA-Stabilität. Eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung der RNA Zerfall Sätze blockiert der transkriptionellen Maschinen mit Verbindungen wie α-Amanitin oder Actinomycin D gefolgt von Messungen der verfallenden RNAs. Allerdings gibt es einige Probleme im Zusammenhang mit einer allgemeinen Blockade der Transkription in Zellen, wie Induktion der Apoptose8,9. Neben der zytotoxischen Effekte präsentieren transcriptional Hemmer auch mehrere technische Probleme wie langsame zelluläre Aufnahme von α-Amanitin und mangelnde Spezifität von Actinomycin D (rezensiert in Referenz10).
Um die allgemeine Blockierung der Transkription zu vermeiden, wurden Nukleotidanaloga verwendet, z. B. 5-Ethynyl Uridin (5-EU) und 4-Thiouridine (4-TU) BrU. Diese sind leicht von Säugerzellen aufgegriffen und integriert neu synthetisierte RNA ermöglichen, Puls-Kennzeichnung von RNA innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens. BrU ist weniger toxisch als EU-5- und 4-TU, so dass es die bevorzugte Analogon zur Wahl11,12.
BrU-IP kann verwendet werden, zu untersuchen, die bei RNA-Synthese und Stabilität, und somit zu unterscheiden zwischen den zugrunde liegenden Ursachen der Veränderungen im Gesamt-RNS. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Messung der RNA-Synthese und bezieht sich auf2 für Details zur Untersuchung der Stabilität der RNA um zu verweisen. Um RNA-Synthese zu untersuchen, werden Zellen kurz mit BrU z.B. für 1 h, gefolgt von BrU-IP-1 (Abbildung 1) gekennzeichnet. Dies ermöglicht Messungen der RNA synthetisiert innerhalb der kurzen Zeit der Kennzeichnung und beobachtete Veränderungen geben eine bessere Schätzung der Vorschriften in der RNA-Synthese als durch die Messung von Veränderungen im gesamten RNA durch RT-qPCR. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass obwohl die Kennzeichnung, z. B. nur 1 h dauert Abbau noch einen Einfluss auf die RNA-Ebenen beobachtet haben kann.
RNS von BrU-IP-Experimente eignen sich für nachgelagerte Analyse von RT-qPCR1 oder nächste Generation Sequenzierung2,13. Andere standard RNA Nachweisverfahren, wie Nordbeflecken oder Ribonuklease-Protection-Assay können auch für bestimmte RNAs gelten.

<table><tbody><tr><td>Ribolock Rnase Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Schaf Anti-Maus IgG</td><td>Life Technologies</td><td>11202D</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bromodeoxyuridin Maus Antikörper</td><td>BD Bioscience</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Ultraviolett-sichtbare Spektrophotometrie</td></tr><tr><td>Wassergesättigtes Phenol pH 6,6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9712</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6,6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Isolierungskit für hochreine RNA</td><td>Roche</td><td>11828665001</td> Reverse Transkriptionskit für cDNA ThermoFisher 4368814 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Advanced Master</td><td>Mix ThermoFisher</td><td>4444557</td><td>qPCR Master Mix</td></tr><tr><td>Taqman RNA-Sonden</td><td>ThermoFisher</td><td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td><td>Flurogene Sonden</td></tr><tr><td>7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Zelllinie</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Hank-Puffer</td><td></td><td></td><td>5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 und 136,8 mM NaCl pH 6,77, autoklaviert.</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td></td><td></td><td>0,1% Diethylpyrocarbonat, behandelt H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP Puffer</td><td></td><td></td><td>40 mM Tris-HCl pH 7,5 und 500 mM NaCl in DEPC H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP+BSA/RNAse Inhibitor</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP Puffer ergänzt mit 1 &mu; g/&mu; L BSA und 80 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>BrU-IP+ 1 mg/mL Heparin</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP Puffer verdünnt 1:1 DEPC-H2O und ergänzt mit 1mg/mL Heparin</td></tr><tr><td>1xBrU-IP</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP Puffer verdünnt 1:1 in DEPC-H2O und ergänzt mit 0,5 &mu; g/&mu; L BSA und 20 U/mL Ribolock-Elutionspuffer</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>0,1 % SDS in RNAse-freiem H2O</td></tr></tbody></table>

untersuchung der rns-synthese mit 5-bromouridine kennzeichnung und immunopräzipitation

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Wenn Steady-State RNA-Ebene zwischen zwei Bedingungen verglichen werden, ist es nicht möglich zu unterscheiden, ob Änderungen durch Veränderungen in der Produktion oder Abbau der RNA entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung der RNA-Produktion, mit 5-Bromouridine Kennzeichnung von RNA, gefolgt von Immunopräzipitation, die Untersuchung der RNA synthetisiert innerhalb eines kurzen Zeitraums (z.B. 1 h) ermöglicht. Der Vorteil von 5-Bromouridine-Kennzeichnung und Immunopräzipitation über die Verwendung von giftigen transcriptional Hemmer wie α-Amanitin und Actinomycin D ist, dass es keine oder sehr geringe Auswirkungen auf die Zellviabilität bei kurzfristigen Einsatz. Da 5-Bromouridine-Immunopräzipitation nur RNA produziert innerhalb der kurzen Kennzeichnung Zeit erfasst, langsam erzeugt sowie schneller abgebaut kann RNA jedoch schwierig, mit dieser Methode zu messen sein. Die 5-Bromouridine-gekennzeichnete RNA durch 5-Bromouridine-Immunopräzipitation erfasst kann durch reverse Transkription, quantitative Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzierung der nächsten Generation analysiert werden. Alle Arten von RNA untersucht werden können, und die Methode beschränkt sich nicht auf mRNA zu messen, wie in diesem Beispiel dargestellt wird.

Unsere ersten Tests der BrU-Kennzeichnung Zeit wurden AsPC-1-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden für 0, 1, 2 und 4,5 h, gefolgt von insgesamt RNA-Extraktion und BrU-IP mit BrU behandelt. GAS5 und GAPDH wurden in BrU-IP-RNA, gemessen, die bewiesen, dass 1 h Kennzeichnung ausreichend, eine ca. 9 - und 44 - fache-Änderung im Vergleich zum Hintergrund (0 h) für GAPDH und GAS5, bzw. zu erreichen war.
BrU-IP und der oben beschriebe...

Diese Methode kann verwendet werden, um RNS-Synthese zu messen. 5-Bromouridine Zellen hinzugefügt und synthetisierte RNA eingebaut. RNA-Synthese wird durch RNA-Extraktion unmittelbar nach der Kennzeichnung, gemessen, gefolgt von 5-Bromouridine-gezielte Immunopräzipitation gekennzeichneten RNA und Analyse durch reverse Transkription und quantitative Polymerase-Kettenreaktion.

Untersuchung der RNS-Synthese mit 5-Bromouridine Kennzeichnung und Immunopräzipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Veränderungen in der RNA-Synthese durch Bromouridin-Markierung und Immunpräzipitation zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des RNA-Stoffwechsels zu beantworten, indem sie misst, ob eine Veränderung des RNA-Spiegels durch Veränderungen in der RNA-Synthese verursacht wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf jede bevorzugte Art von Zellkultur angewendet werden kann und die verwendeten Materialien leicht zugänglich sind.Zu Beginn des Protokolls säen Sie 3,5 mal 10 bis sechs HEK293T Zellen in einer 10 Zentimeter großen Petrischale in 10 Milliliter Wachstumsmedium aus, um bei der Extraktion 48 Stunden später insgesamt mehr als 40 Mikrogramm RNA zu erhalten. Halten Sie die Zellen nach der Aussaat bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2,48 Stunden, saugen Sie acht Milliliter Wachstumsmedium an und lassen Sie zwei Milliliter zurück, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. Geben Sie zwei Millimol Bromouridin und die Behandlung in das Wachstumsmedium und entfernen Sie die restlichen zwei Milliliter aus den Zellen, bevor Sie die acht Milliliter bromouridinhaltiges Wachstumsmedium erneut auft

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu...

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

RNA-Transkripte sind Gegenstand intensiver posttranskriptioneller Regelung, die durch eine Vielzahl von trans-agierenden RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) vermittelt wird. Hier präsentieren wir Ihnen eine verallgemeinerbare Methode zur Identifizierung und präzise auf Transkriptom-weiten Skala der RNA-Bindungsstellen von RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

Dieses Video zeigt einen in vitro RNA-Pulldown-Assay zur Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die mit den Adenylat-Uridylat-Rich Element (ARE)-Sequenzen in mRNA interagieren. Die Ziel-RBPs aus einem Zelllysat werden mit einer RNA-Sonde gemischt, um RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die Komplexe werden mittels Affinitätsreinigung isoliert, wobei die Affinität der Desthiobiotin-Markierung der RNA-Sonde zu einem Streptavidin-markierten magnetischen Kügelchen genutzt wird.

RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

Zelluläre Gesamt-RNA ein Template für die Untersuchung schlechte kurzfristige Änderungen in der RNA-Synthese und Zerfall sowie die Kinetik der RNA-Prozessierung. Hier beschreiben wir metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-Thiouridin gefolgt von Thiol-spezifische Biotinylierung und Aufreinigung von neu transkribierten RNA ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden.

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

Dieses Verfahren beschreibt die Verwendung von Klick-Chemie, um Änderungen in Wirtszelle Transkription nach der Infektion zu messen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12. Die Ergebnisse können qualitativ visualisiert werden über Fluoreszenzmikroskopie oder erhalten quantitativ durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ist zur Verwendung mit anderen Viren.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Wir beschreiben eine Technik zur Analyse der globalen RNA-Synthese in Hypoxie mit bildgebenden. Click-Chemie Markierung von RNA wurde bisher nicht unter Hypoxie durchgeführt und ermöglicht die Visualisierung der globalen RNA Veränderungen auf Einzelzellebene. Dieser Ansatz ergänzt die bestehenden gemittelt RNA-Techniken, die eine direkte Visualisierung von Zell-zu-Zell-Veränderungen in der globalen RNA-Synthese.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Wir beschreiben einen grundlegenden experimentellen Ansatz zur Analyse der Beendigung der Transkription durch RNA-Polymerase II in vivo unter Verwendung von BrUTP durch den strangspezifischen Transkriptions-Run-on-Ansatz (TRO) in knospenden Hefen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um die Transkriptionsbeendigung durch andere RNA-Polymerasen sowohl in Hefe als auch in höheren Eukaryoten zu untersuchen.

Die Analyse der Beendigung der Transkription unter Verwendung von BrUTP strangspezifische Transkription Run-on (TRO) Ansatz

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der genomweiten Quantifizierung der neugebildete mRNA von Hefezellen mit 4-Thiouracil beschriftet gereinigt. Diese Methode ermöglicht die Messung der mRNA-Synthese von mRNA Decay abgekoppelt und schafft somit eine genaue Messung der RNA-Polymerase II Transkription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Purine gehören zu den am häufigsten vorkommenden nicht-kanonischen Nukleotiden während Eukaryotische nukleare DNA-Replikation in das Genom integriert. Wenn nicht richtig entfernt, verursachen Purine DNA-Schäden und Mutagenese. Hier präsentieren wir Ihnen zwei experimentelle Ansätze, die verwendet werden, um die Fülle der Ribonukleotidreduktase Einbindung in DNA und seine mutagenen Wirkungen zu beurteilen.

Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese

Die Verwendung von thioliertem Uracil zur empfindlichen und gezielten Reinigung neu transkribierter RNA aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Extrem schnelle und spezifische metabolische Kennzeichnung von RNA In Vivo mit 4-Thiouracil (Ers4tU)

Lernen Sie die Messung der RNA-Synthese durch Bromouridin-Kennzeichnung und Immunopräzipitation in Zellkulturen. Diese Methode ermöglicht Forschern, Veränderungen der RNA-Metabolismus-Dynamik zu untersuchen.

Untersuchung der RNS-Synthese mit 5-Bromouridine Kennzeichnung und Immunopräzipitation

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