Untersuchung der RNS-Synthese mit 5-Bromouridine Kennzeichnung und Immunopräzipitation
3. Mai 2018
Diese Methode kann verwendet werden, um RNS-Synthese zu messen. 5-Bromouridine Zellen hinzugefügt und synthetisierte RNA eingebaut. RNA-Synthese wird durch RNA-Extraktion unmittelbar nach der Kennzeichnung, gemessen, gefolgt von 5-Bromouridine-gezielte Immunopräzipitation gekennzeichneten RNA und Analyse durch reverse Transkription und quantitative Polymerase-Kettenreaktion.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Veränderungen in der RNA-Synthese durch Bromouridin-Markierung und Immunpräzipitation zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des RNA-Stoffwechsels zu beantworten, indem sie misst, ob eine Veränderung des RNA-Spiegels durch Veränderungen in der RNA-Synthese verursacht wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf jede bevorzugte Art von Zellkultur angewendet werden kann und die verwendeten Materialien leicht zugänglich sind.
Zu Beginn des Protokolls säen Sie 3,5 mal 10 bis sechs HEK293T Zellen in einer 10 Zentimeter großen Petrischale in 10 Milliliter Wachstumsmedium aus, um bei der Extraktion 48 Stunden später insgesamt mehr als 40 Mikrogramm RNA zu erhalten. Halten Sie die Zellen nach der Aussaat bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2,48 Stunden, saugen Sie acht Milliliter Wachstumsmedium an und lassen Sie zwei Milliliter zurück, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. Geben Sie zwei Millimol Bromouridin und die Behandlung in das Wachstumsmedium und entfernen Sie die restlichen zwei Milliliter aus den Zellen, bevor Sie die acht Milliliter bromouridinhaltiges Wachstumsmedium erneut auftragen.
Inkubieren Sie die Zellen anschließend eine Stunde lang. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation in fünf Millilitern Hank-Puffer und trypsinisieren Sie die Zellen fünf Minuten lang mit zwei Millilitern 0,05 % Trypsin. Fügen Sie acht Milliliter Wachstumsmedium hinzu, um die Reaktion zu stoppen, geben Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie die Zellen zwei Minuten lang bei 1.000 g g.
Entfernen Sie dann den Überstand und extrahieren Sie die Gesamt-RNA mit einem RNA-Isolationskit aus dem Zellpellet und eluieren Sie die RNA in RNase-freiem Wasser. Diese Technik ist sehr empfindlich, und daher ist es wichtig, mit RNA von hoher Qualität zu arbeiten. Die RNA-Extraktion ist daher ein kritischer Schritt, der aber auch mit den heutigen RNA-Extraktionskits problemlos durchgeführt werden kann.
Bereiten Sie die Kügelchen in einer Charge für die Anzahl der zu untersuchenden Proben plus eine zusätzliche Charge vor, um Verluste beim Pipettieren und Mischen mit dem Wirbel zu berücksichtigen. Resuspendieren Sie magnetische Anti-Maus-IgG-Kügelchen gründlich durch Wirbelmischen und entnehmen Sie 20 Mikroliter Beads pro Probe in einem RNase-freien 1,5-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das 1,5-Milliliter-Röhrchen für 20 Sekunden in einen Magnetständer, damit sich die Kügelchen an der Seite sammeln können.
Entfernen Sie den Überstand, nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetständer und resuspendieren Sie die Kügelchen in 40 Mikrolitern einmaligem Bromouridin-IP-Puffer durch Pipettieren. Drehen Sie das Röhrchen zwei Sekunden lang in einer Tischzentrifuge, setzen Sie es wieder in den Magnetständer ein und entfernen Sie den Überstand. Blockieren Sie als Nächstes die unspezifische Bindung an die Kügelchen mit Heparin.
Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter eines Mal Bromouridin-IP plus einem Milligramm pro Milliliter Heparinpuffer und drehen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang. Waschen Sie dann die Perlen einmal. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter des einmal Bromouridin-IP-Puffers und fügen Sie 1,25 Mikrogramm Anti-Alpha-Bromodeoxyuridin-Antikörper pro Probe hinzu.
Inkubieren Sie die Kügelchen eine Stunde lang unter Drehen. Waschen Sie die Perlen nach der Inkubation dreimal. Resuspendieren Sie die gewaschenen Kügelchen in 50 Mikrolitern pro Probe aus einem Mal Bromouridin-IP-Puffer, ergänzt mit einem millimolaren Bromouridin, und lassen Sie die Kügelchen 30 Minuten lang rotieren.
Waschen Sie die Kügelchen nach der Drehung dreimal und resuspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern pro Probe mit dem Einmaligen Bromouridin-IP-Puffer. Messen Sie die RNA-Konzentrationen in den RNA-Extrakten mit Hilfe der ultraviolett-sichtbaren Spektrophotometrie und verdünnen Sie 40 Mikrogramm RNA aus jeder Probe in RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern. Nachdem Sie die RNA zwei Minuten lang bei 80 Grad Celsius denaturiert haben, drehen Sie die Proben kurz in einer Tischzentrifuge.
Nach dem Schleudern 200 Mikroliter zweifaches Bromouridin-IP plus BSA, RNase-Hemmer hinzufügen. Geben Sie dann 50 Mikroliter der resuspendierten und vorbereiteten Kügelchen zu jeder Probe und drehen Sie die Proben eine Stunde lang. Waschen Sie die Kügelchen nach der Inkubation viermal.
Resuspendieren Sie die Kügelchen in 200 Mikrolitern Elutionspuffer, um die RNA zu eluieren, und fügen Sie schnell 200 Mikroliter Phenol mit einem pH-Wert von 6,6 hinzu, um alle Nicht-RNA-Moleküle aus der Probe zu entfernen. Drehen Sie die Probe zum Mischen und drehen Sie sie drei Minuten lang mit 25.000 g in einer Tischzentrifuge. Als nächstes aspirieren Sie so viel wie möglich von der oberen Phase, etwa 190 Mikroliter, und geben sie in ein Röhrchen mit 200 Mikrolitern Phenol-Chloroform mit einem pH-Wert von 6,6.
Stellen Sie sicher, dass Sie bei allen Proben die gleiche Menge aspirieren. Wirbeln Sie das Sample und drehen Sie es. Nach dem Schleudern führen Sie die Chloroform-Extraktion durch, indem Sie die wässrige obere Phase, etwa 180 Mikroliter, aspirieren und in ein Röhrchen mit 200 Mikrolitern Chloroform übertragen.
Wirbeln Sie die Probe und drehen Sie sie dann. Die wässrige obere Phase, etwa 170 Mikroliter, wird aspiriert und in ein Röhrchen mit 17 Mikrolitern Natriumacetat mit drei molaren pH-Werten von sechs übertragen, um die RNA aus der wässrigen Lösung zu neutralisieren und auszufällen. Fügen Sie als nächstes zwei Mikroliter Glykogen hinzu, das mit der RNA ausfällt und das Pellet besser sichtbar macht.
Fügen Sie 500 Mikroliter 96%iges Ethanol hinzu, um die Bindung zwischen den Salzionen und der RNA zu erhöhen, und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen ein paar Mal umdrehen. Lassen Sie die Tube über Nacht bei minus 20 Grad Celsius oder 15 Minuten auf Trockeneis stehen. Schleudern Sie die gekühlte Probe, entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu beschädigen, und waschen Sie das Pellet in 185 Mikrolitern 75%igem Ethanol, um Salzreste zu entfernen.
Schleudern Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei 25.000 g bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vollständig, ohne das Pellet zu stören, und lassen Sie das Pellet fünf bis 10 Minuten bei geöffnetem Deckel trocknen. Suspendieren Sie das Pellet in 10 Mikrolitern RNase-freiem Wasser, das auf die Seite des Rohrs aufgetragen wird, um eine Störung des Pellets zu vermeiden.
AsPC-1-Zellen wurden null, ein, zwei und 4,5 Stunden lang mit Bromouridin behandelt, gefolgt von einer vollständigen RNA-Extraktion und Bromouridin-IP. GAS5 und GAPDH wurden in Bromouridin-IP-RNA gemessen, was zeigte, dass eine Stunde Markierung ausreichte, um eine neun- und 44-fache Veränderung im Vergleich zum Hintergrund zu erreichen. Die Behandlung mit zwei Millimol Bromouridin induzierte weder für eine einstündige noch für die längere vierstündige Behandlung morphologische Veränderungen in HEK293T Zellen.
Die PLK-2-Hemmung verursachte einen Anstieg der alpha-Synuclein-mRNA sowohl in der Input als auch in der Bromouridin-IP, was darauf hindeutet, dass der Anstieg der Steady-State-RNA durch eine Zunahme der RNA-Synthese verursacht wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neu synthetisierte RNA mit Bromouridin markiert und eine anschließende Immunpräzipitation von Bromouridin und der markierten RNA durchführt.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Methode kann verwendet werden, um die RNA-Synthese mittels Bromouridin-Markierung und Immunpräzipitation zu messen. Sie hilft dabei zu bestimmen, ob Veränderungen in den RNA-Spiegeln auf Änderungen in der RNA-Synthese zurückzuführen sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- RNA-Stoffwechsel
- Zellkultivierungstechniken
- Quantitative Analyse
Hintergrund
- Die RNA-Synthese ist ein kritischer Prozess für die zelluläre Funktion.
- Bromouridin ist ein Nukleosidanalogon, das zur Markierung von RNA verwendet wird.
- Die Immunpräzipitation ermöglicht die Isolierung markierter RNA.
- Diese Technik ist auf verschiedene Zelltypen anwendbar.
Zweck der Studie
- Um Veränderungen in der RNA-Synthese zu messen.
- Um die Beziehung zwischen RNA-Konzentrationen und Syntheseraten zu untersuchen.
- Um eine Methode anzuwenden, die leicht zugänglich ist und an verschiedene Zellkulturen angepasst werden kann.
Verwendete Methoden
- HEK293T-Zellen in einer Petrischale ansäen.
- Bromuridin in das Wachstumsmedium einbringen.
- RNA nach einer definierten Inkubationszeit extrahieren.
- Immunpräzipitation durchführen und die RNA mittels quantitativer PCR analysieren.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Einbindung von Bromouridin in synthetisierte RNA.
- Quantitative Messung der RNA-Synthese erreicht.
- Nachweis der Anwendbarkeit der Methode in verschiedenen Zelltypen.
- Gewonnene Erkenntnisse über die Dynamik des RNA-Stoffwechsels.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode eignet sich zur Untersuchung der RNA-Synthese.
- Sie kann dazu beitragen, die Mechanismen des RNA-Stoffwechsels aufzuklären.
- Die Verwendung zugänglicher Materialien und Techniken erhöht ihre Nützlichkeit in der Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die direkte Messung der RNA-Synthese mithilfe von 5-Bromuridin-Markierung und Immunpräzipitation ermöglicht es Biopharma-Teams, zwischen transkriptioneller Produktion und RNA-Abbau zu unterscheiden – einen entscheidenden Wendepunkt bei der Zielvalidierung und der mechanistischen Risikominimierung. Dieser Ansatz stärkt das Vorhersagevertrauen in der frühen Entdeckung, indem geklärt wird, ob beobachtete Änderungen der RNA-Spiegel auf veränderte Syntheseraten zurückzuführen sind. Die Verträglichkeit der Methode mit verschiedenen Zellsystemen und nachgeschalteten quantitativen Analysen erhöht ihre breite Anwendbarkeit im gesamten Portfolio.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der transkriptionellen Aktivität zur funktionellen Zielvalidierung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem synthesebedingte von abbauassoziierten RNA-Veränderungen unterschieden werden.
- Erleichtert die Vorhersagbarkeit bei Studien zur Modulation von Signalwegen und Zielmolekülbindung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Auslesungen der RNA-Synthese für nachgeschaltete quantitative Workflows vor.
- Ermöglicht die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch definierte Markierungs- und Immunpräzipitationsschritte.
- Ermöglicht die skalierbare Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf die RNA-Produktion in verschiedenen Zelltypen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Ausrichtung an krankheitsrelevanten Modellen durch die Messung der RNA-Synthese in verschiedenen Zellsystemen.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem quantitative Biomarker-Analysen unterstützt werden.
- Verringert das Risiko von Fehlschlägen in späteren Entwicklungsstadien, indem die transkriptionellen Mechanismen, die phänotypischen Veränderungen zugrunde liegen, geklärt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie eine direkte Messung der RNA-Synthese ermöglicht und sowohl Hypothesentests als auch quantitative Analysen unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Klärt, ob eine Zielmodulation die RNA-Produktion oder -Stabilität beeinflusst, und liefert damit Hinweise für die Pfadanalyse.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Daten zur RNA-Synthese, die für die Beurteilung von Wirkstoffen geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht nachgeschaltete qPCR- und Sequenzierungsanalysen zur robusten Messung neu synthetisierter RNA.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Biomarker-Abstimmung durch Messung der Synthese krankheitsrelevanter RNAs.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen breit anwendbaren Arbeitsablauf für Studien zum RNA-Stoffwechsel über verschiedene Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Target-Validierung.
- Operativer Wert: Standardisiert die Messung der RNA-Synthese mit leicht verfügbaren Reagenzien und Protokollen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem transkriptionelle Mechanismen früh im Prozess geklärt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung, indem RNA-Änderungen, die auf Synthese zurückgehen, von solchen, die auf Degradation beruhen, unterschieden werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit RNA und Immunpräzipitationstechniken.
- Benötigt Zugang zu Zellkultur, immunpräzipitativen Verfahren mit magnetischen Mikrokügelchen und quantitativen Analyseplattformen.
- Erfordert eine strenge Qualitätskontrolle der RNA, um Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit sicherzustellen.
- Kann aufgrund kurzer Markierungsintervalle eine Anpassung bei langsam synthetisierten oder rasch abgebauten RNAs erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört eine mögliche Unterrepräsentation bestimmter RNA-Spezies aufgrund ihrer Synthese- und Abbaudynamik.
