Eine einfache Protokoll ortspezifisch generieren acetyliert Proteine in Escherichia Coli
9. Dezember 2017
Erweiterung des genetischen Codes dient als ein mächtiges Werkzeug für eine Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich Protein Acetylierung zu studieren. Hier zeigen wir, dass eine einfache Protokoll nutzen diese Technik zur Erzeugung von homogen Proteine an bestimmten Standorten in Escherichia coli Zellen acetyliert.
In dieser Arbeit werden wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung homogen acetylierter Proteine an bestimmten Stellen unter Verwendung von E.coli als Expressionswirt demonstrieren. Die reversible Lysinacetylierung von Proteinen ist eine der am häufigsten vorkommenden posttranslationalen Modifikationen in der Natur. Es spielt eine wichtige Rolle in einer Vielzahl biologischer Prozesse, einschließlich der Gentranskription, der Stressreaktion, der zellulären Differenzierung und des Stoffwechsels.
Die Erzeugung rein acetylierter Proteine an Designpositionen ist sehr nützlich für die Untersuchung der Proteinacetylierung. Bei den meisten klassischen Methoden ist es jedoch schwierig. Diese Herausforderung wurde durch die Technik der genetischen Codeerweiterung gelöst.
Es verwendet ein künstlich hergestelltes Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase-Variat, um tRNA-Pyl mit Acetyllysin aufzuladen, nutzt dann die Translationsmaschinerie des Wirts, um das UAG-Stoppcodon in der mRNA zu unterdrücken, und steuert den Einbau von Acetyllysin in die Designposition des Zielproteins. Zunächst muss das bernsteinfarbene Stoppcodon durch ortsgerichtete Mutagenese an die entsprechende Position im Zielgen eingebracht werden. Amplifizieren Sie das Template-Plasmid, das das Gen der Wildtyp-Proteine enthält, und fügen Sie die Stop-Codon-Mutation aus den Primern durch die PCR-Reaktion ein.
Nach der PCR wird das amplifizierte Material eine Stunde lang bei Raumtemperatur direkt in das Kinase-Ligase-Dpn1-Enzymgemisch gegeben, um es zu zirkulieren und die Template zu entfernen. Geben Sie fünf Mikroliter der Mischung in das Röhrchen mit 25 Mikrolitern aufgetauten E.coli-Zellen. Schnippen Sie vorsichtig mit der Tube, um sie zu mischen, und legen Sie die Mischung 30 Minuten lang auf Eis.
Die Mischung 30 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius hitzeschocken und weitere fünf Minuten auf Eis legen. Pipettieren Sie 600 Mikroliter SOC-Medien bei Raumtemperatur in die Mischung. Bei 37 Grad Celsius 60 Minuten unter Schütteln inkubieren.
100 Mikroliter mit dem entsprechenden Antibiotikum auf den Teller verteilen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Das Plasmid aus der einzelnen Kolonie wird zur Sequenzierung geschickt. Der zweite Schritt besteht darin, ortsspezifisch acetyliertes Protein zu exprimieren und aufzureinigen.
Nehmen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte, die das mutierte TAG-haltige Zielgen und das Acetyllysin-Inkorporationssystem enthält. Über Nacht bei 37 Grad Celsius in 15 Milliliter frische LB-Medien mit entsprechenden Antibiotika impfen. Die 15-Milliliter-Übernachtkultur mit Antibiotika auf 300 Milliliter frisches LB-Medium umfüllen und bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Fügen Sie fünf Millimolare Acetyllysin und 20 Millimolare Nicotinamid als endgültige Konzentrationen in Wachstumsmedien hinzu, wenn die Absorption 5 bei 600 Nanometern erreicht. Züchten Sie die Zellen für eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann den Induktor für die Proteinexpression hinzu und züchten Sie die Zellen über Nacht bei 25 Grad Celsius.
Sammeln Sie die Zellen, indem Sie 15 Minuten lang bei 3.000 g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie die Zellpellets bei minus 80 Grad. Tauen Sie die gefrorenen Zellpellets auf Eis auf und resuspendieren Sie sie mit 15 Millilitern Lysepuffer, fünf Mikrolitern Beta-Mercaptoethanol und einem Mikroliter Nuklease.
Zellen werden durch Beschallung aufgebrochen. Rohextrakt bei 20.000 g für 25 Minuten bei vier Grad zentrifugieren. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 45-Mikrometer-Membranfilter.
Die filtrierte Probe wird in eine Säule geladen, die einen Milliliter Nickel-NTA-Harz enthält, das mit 20 Millilitern Lysepuffer äquilibriert ist. Waschen Sie die Säule mit 20 Millilitern Waschpuffer. Das Zielprotein wird mit zwei Millilitern Elutionspuffer umgangen.
Das gereinigte Protein wird durch die PD-10-Säule entsalzt, indem 2,5 Milliliter Probe hinzugefügt werden, und die entsalzte Probe wird mit 3,5 Milliliter Entsalzungspuffer gesammelt. Der nächste Schritt besteht darin, gereinigtes acetyliertes Protein biochemisch zu charakterisieren. Denaturieren Sie Proteine mit dem SDS-Probenpuffer über 100 Grad für fünf Minuten.
Die Mischung zentrifugieren, auf das SDS-PAGE-Gel laden und 30 Minuten lang bei 200 Volt laufen lassen. Waschen Sie das Gel mit destilliertem Wasser und schütteln Sie es leicht. Um das Sandwich für das Western Blotting herzustellen, wird von der Kathode bis zur Anode ein Schwamm, Filterpapier, Transferpuffer, getränktes SDS-PAGE-Gel, eine methanolaktivierte PVDF-Membran, ein weiteres Filterpapier, die Entfernung der Blasen im Sandwich und ein weiterer Schwamm benötigt.
Legen Sie den Stapel in den Transferbehälter. Laufen Sie 45 Minuten lang mit einem konstanten Strom von 350 Milliampere. Waschen Sie die PVDF-Membran mit 25 Millilitern TBST-Puffer fünf Minuten lang unter leichtem Schütteln.
Blockieren Sie die Membran mit 5%BSA und dem TBST-Puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Membran mit verdünntem HRP-konjugiertem Acetyllysin-Antikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde oder vier Grad über Nacht unter leichtem Schütteln. Waschen Sie die Membran mit 20 Millilitern TBST-Puffer fünf Minuten lang unter leichtem Schütteln.
Wiederholen Sie diesen Schritt viermal. Tragen Sie das Chemilumineszenzsubstrat eine Minute lang auf die Membran auf. Erfassen Sie das Signal mit einem CCD-Kamera-Basis-Imager.
Die gleichen Volumina an Elutionsfraktionen und Proteinaufreinigung wurden auf das SDS-PAGE-Gel geladen. Die Ausbeute an acetyliertem Protein beträgt etwa die Hälfte des Wildtyp-Proteins, das hocheffizient ist, und derselbe Expressionsstamm ohne Acetyllysin und Wachstumsmedien kann keine Proteine mit nachweisbarer Menge produzieren, was auf eine hohe Reinheit des acetylierten Proteins hinweist, da an dieser spezifischen Position keine kanonischen Aminosäuren eingebaut sind. Western-Blotting zeigte, dass es keine nachweisbare Acetylierung im Wildtyp-Protein gibt, was auf den geringen Hintergrund der unspezifischen Acetylierung dieses Expressionssystems hinweist, während acetyliertes Protein eine klare Bande aufwies.
Die Tandem-Massenspektrometrie bestätigte, dass die Acetylierung an der richtigen Stelle stattfindet, deren entsprechende Position im Gen zum Stoppcodon mutiert wurde. Um eine gute Ausbeute und Reinheit von acetylierten Proteinen zu erzielen, sollte das optimierte Acetyllysin-Inkorporationssystem sowohl für eine hohe Effizienz als auch für eine hohe Reinheit verwendet werden. BL21(DE3)-Zellen sollten für eine niedrige Hintergrund- und unspezifische Acetylierung verwendet werden, um die Reinheit zu erhöhen.
Das genetische Inkorporationssystem könnte in eukaryotischen Systemen für breitere Anwendungen verwendet werden.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Herstellung homogen acetylierter Proteine an spezifischen Stellen unter Verwendung von E. coli als Expressionswirt vor. Die Technik nutzt die Erweiterung des genetischen Codes, um Herausforderungen zu überwinden, die mit herkömmlichen Methoden der Proteinacetylierung verbunden sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biokemie
- Proteinengineering
- Posttranslationale Modifikationen
Hintergrund
- Lysinacetylierung ist eine verbreitete posttranslationale Modifikation.
- Sie ist entscheidend für verschiedene biologische Prozesse wie die Genexpression und den Stoffwechsel.
- Die Herstellung acetylierter Proteine an spezifischen Stellen erleichtert die Untersuchung ihrer Funktionen.
- Herkömmliche Methoden zur Acetylierung sind häufig ineffektiv.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Herstellung acetylierter Proteine in E. coli.
- Erleichterung der Untersuchung von Mechanismen der Proteinacetylierung.
- Verbesserung des Verständnisses der Rolle der Acetylierung in biologischen Prozessen.
Verwendete Methoden
- Verfahren zur Erweiterung des genetischen Codes.
- Expression von Proteinen in Escherichia coli.
- Ortspezifische Acetylierung von Proteinen.
- Entwicklung eines Protokolls für homogene Acetylierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung homogen acetylierter Proteine.
- Nachweis der Wirksamkeit der Erweiterung des genetischen Codes.
- Bereitstellung eines neuen Werkzeugs zur Untersuchung der Proteinacetylierung.
- Verbessertes Verständnis der Rolle der Acetylierung bei biologischen Funktionen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll vereinfacht die Herstellung acetylierter Proteine.
- Diese Methode kann auf verschiedene Studien, die Proteinmodifikationen betreffen, angewendet werden.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können diese Technik nutzen, um acetylierungsbezogene Prozesse zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die ortsspezifische Acetylierung von Proteinen in Escherichia coli ermöglicht eine präzise Untersuchung posttranslationaler Modifikationen, die für die Zielvalidierung und die Reduzierung mechanistischer Risiken in der frühen Forschung entscheidend sind. Dieses Protokoll behebt langjährige Herausforderungen bei der Herstellung homogen modifizierter Proteine und unterstützt so eine zuverlässige Vorhersagbarkeit sowie translationsbezogene Kontinuität in Forschungs- und Entwicklungsportfolios.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Überprüfung von auf Acetylierung basierenden Hypothesen an definierten Proteinstellen.
- Unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken, indem die funktionellen Auswirkungen spezifischer Lysin-Acetylierungsereignisse isoliert werden.
- Ermöglicht eine robuste Target-Validierung, indem reine, ortsspezifisch modifizierte Proteine für nachgeschaltete Assays bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte, reproduzierbare azetylierte Proteinreagenzien für quantitative biochemische und biophysikalische Assays.
- Verbessert die Zuverlässigkeit von Assays, indem Hintergrundsignale durch unspezifische Azetylierung eliminiert werden.
- Ermöglicht die skalierbare Herstellung modifizierter Proteine für Hochdurchsatz-Screening-Plattformen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt biochemische Befunde aus In-vitro-Studien mit krankheitsrelevanten posttranslationalen Modifikationen, die in vivo beobachtet wurden.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem funktionelle Studien zur Acetylierung in Modellsystemen ermöglicht werden.
- Verringert das translationsbedingte Risiko, indem die biologischen Konsequenzen spezifischer Acetylierungsereignisse geklärt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung, indem es die Herstellung ortsspezifisch acetylierter Proteine für Hypothesentests, Assay-Entwicklung und mechanistische Untersuchungen ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Überprüfung von Nullhypothesen, indem ein direkter Vergleich von Wildtyp- und acetylierten Proteinvarianten ermöglicht wird.
- Screening: Stellt reproduzierbare Reagenzien mit hoher Reinheit für die quantitative Assay-Entwicklung und die Evaluierung von Verbindungen bereit.
- Analytik: Ermöglicht präzise Messung acetylierungsabhängiger funktioneller Veränderungen mittels Western Blot und Massenspektrometrie.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Abstimmung von in vitro-Ergebnissen mit in vivo-Acetylierungsmustern, die für Krankheitsmodelle relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Herstellung vielfältiger, gezielt modifizierter Proteine über mehrere Zielstrukturen hinweg.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Target-Validierung.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Herstellung modifizierter Proteine mit hoher Effizienz und Reinheit.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen, indem die funktionelle Wirkung der Acetylierung geklärt wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Targets und Signalwegen basierend auf robusten biochemischen Belegen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in molekularer Klonierung, Proteinexpression und Analyse posttranslationaler Modifikationen.
- Benötigt Zugang zu E. coli-Expressionssystemen, Werkzeugen für die gezielte Mutagenese sowie analytischen Plattformen wie Western Blotting und Massenspektrometrie.
- Erfordert eine standardisierte Protokollabstimmung zwischen Teams, um Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
- Kann je nach Projektanforderungen eine Anpassung an verschiedene Proteinziele oder Expressionssysteme notwendig machen.
- Die Ausbeute und Reinheit hängen von der Optimierung des Acetyllysin-Einbausystems und der Wahl des Wirtsstamms ab.
