Name: Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie seltene CDH1-Transkriptvarianten in tiefgefrorenem Magenkrebsgewebe mittels chip-basierter digitaler PCR nachweisen. Diese Methode ermöglicht die hochpräzise Detektion niedrig abundanter Ziele.

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Die Autoren danken Gráinne Tierney für redaktionelle Unterstützung.

Das Protokoll folgt den Richtlinien des menschlichen Ethik-Forschungskommission IRST.
Hinweis: Dieses Verfahren ist speziell für die Erkennung von eine geringe Anzahl von cDNA-Moleküle im menschlichen Tiefkühlfrische Geweben entwickelt. Die Gewebeschnitte wurden auf Trockeneis, gekürzt, während noch gefroren, aus zuvor validierten Patienten abgeleitet Magen-Tumor oder normalen Gewebeproben.
(1) RNA Isolierung und Reinigung
<ol><li>
RNA-Extraktion Hinweis: RNA Isolierung erfolgt unter der Haube mit einem spezifischen Produkt (siehe Tabelle der Materialien). Jedoch eine Vielzahl von Isolierung Kits sind im Handel erhältlich.<ol>
<li>Homogenisieren Sie 50-100 mg von fein geschnittenen Tiefkühlfrische Gewebeprobe in einem 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL RNA Isolierung Reagenz und Vortex energisch für 15 S. Inkubation der Rohre bei-80 ° C über Nacht.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Rohr mit der Probe bei Raumtemperatur für 5 min und Mischung von vortexen für 15 s.</li>
		<li>Halten Sie das Rohr auf dem Eis, fügen Sie 200 µL Chloroform und kräftig vortexen 15 s.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 60 s und Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 min bei 4 ° c</li>
		<li>Übertragen der wässrigen Phase in einem 1,5 mL Röhrchen und fügen Sie 20 µg von Glykogen. Hinweis: Es ist wichtig, sorgfältig zu vermeiden Übertragung der Interphase oder organischen Schicht um Kontamination zu reduzieren.</li>
		<li>Fügen Sie 500 µL Isopropanol, invertieren die Röhre zu mischen, und inkubieren Sie für 10 min auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 12.000 x g für 15 min bei 4 ° C, RNA auszufällen. Hinweis: RNA wird in eine Gel-artige Pellet auf der Seite und Boden des Röhrchens, oft unsichtbar nach Zentrifugation vorhanden sein.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand ohne Störung des Niederschlags zu und waschen Sie ihn mit 1 mL 75 % Ethanol durch pipettieren.</li>
		<li>Das Rohr auf 7.500 x g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand zu entfernen, ohne zu stören das Pellet.</li>
		<li>Lassen Sie die Pellets trocknen, bis der Niederschlag transparent wird und in 50 µL RNase-freies Wasser auflösen.</li>
		<li>Die Proben bei-80 ° C vor der Quantifizierung mindestens über Nacht einfrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Genomische DNA-Beseitigung und Reinigung der RNA Hinweis: Ein DNase Verdauung Schritt, gefolgt von einer spaltenbasierten RNA Läuterung, Analysen von niedrig-Fülle Ziele empfiehlt sich für um kontaminierende DNA zu verdauen.<ol>
<li>Lösen Sie die gefriergetrockneten DNase auf (1.500 Kunitz Einheiten) in 550 µL RNase-freies Wasser mit einer Spritze, Mischung sanft durch die Durchstechflasche umdrehen / unterteilen die rekonstituierte Stammlösung in Aliquote.</li>
		<li>In einer 1,5 mL Tube das berechnete Volumen der Probe mit 15 µg RNA übertragen, 10 µL der DNase Verdauung Puffer aus dem Kit (im Table of Materials), 2,5 µL DNase I-Stammlösung und RNase-freies Wasser zu 100 µL. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten.</li>
		<li>Fügen Sie 350 µL Gewebe Lyse Puffer (aus dem Kit, siehe Tabelle of Materials) und Mischen von pipettieren.</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL aus 100 % Ethanol und Mischung von pipettieren.</li>
		<li>Übertragen Sie das gesamte Volumen (700 µL) in einer neuen Spin-Spalte und Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 s.</li>
		<li>Übertragen Sie den Filter in eine neue Kollektion-Röhre, die Spalte und die Zentrifuge bei 12.000 x g für 2 min fügen Sie 500 µL von 80 % Ethanol hinzu.</li>
		<li>Öffnen Sie den Deckel des Spin-Spalte und Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min mit einem neuen Sammlung Schlauch um den Filter zu trocknen; übertragen Sie dann den Filter auf eine 1,5 mL-Tube.</li>
		<li>Fügen Sie direkt auf die Filterspalte und Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min 14 µL RNase-freies Wasser.</li>
		<li>Die Proben auf Eis und fahren Sie mit Quantifizierung mit 2 µL der Probe auf einem Benchtop-Spektralphotometer oder speichern Sie, die RNA bei-80 ° C bis zur Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) cDNA Synthese
<ol><li>Statt 1.000 ng RNA, 4 µL des master-Mix, 1 µL Reverse Transkriptase und RNase-freies Wasser zu einem Endvolumen von 20 µL in ein steriles Röhrchen PCR. Vorsichtig mischen und spin-down.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Reaktion-Mix in einem Thermocycler, die folgenden Bedingungen: 5 min bei 25 ° C, 30 min bei 42 ° C, 5 min bei 85 ° C.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre kurz und gehen Sie zum dPCR Analyse oder Lagerung bei-20 ° C bis benötigt.</li>
</ol>3. digitale PCR-Reaktion einrichten
<ol><li>
dPCR Reaktion mischen und Probenvorbereitung
	<ol>
<li>Tauen Sie den master-Mix und die Probe bei Raumtemperatur für mindestens 20 Minuten.</li>
		<li>Verdünnen Sie die cDNA-Proben zu einer Konzentration von 300 ng in 6 µL Wasser.</li>
		<li>Sanft Wirbel Master mischen und die Mischung in ein steriles Röhrchen mit 8,7 µL des master-Mix, 0,87 µL der CDH1a benutzerdefinierte gestaltete Assay Grundierung und 1,83 µL Nuklease-freies Wasser einem Endvolumen von 11,4 µL vorbereiten. Hinweis: CDH1a benutzerdefinierte gestaltete Assay Grundierung Details finden Sie in der Tabelle der Materialien.</li>
		<li>11.4 µL der vorbereiteten Mischung der verdünnten cDNA-Probe übertragen, vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren. Hinweis: Bände enthalten 20 % Selbstbeteiligung Volumenverlust von Pipettieren zu kompensieren. Bereiten Sie die Mischung für alle Proben und einem keine Vorlage-Kontrolle (NTC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chip-Vorbereitung Hinweis: Für optimale Ergebnisse laden Sie die Chips so bald wie möglich.<ol>
<li>Der Chip-Lader stecken Sie ein und warten Sie, bis die Kontrolllampe grün leuchtet.</li>
		<li>Entfernen Sie die Kappe der Immersion Flüssigkeit Spritze durch den Kolben vorsichtig zurückziehen 1-2 mm und loslassen, um diesen Schritt zu erleichtern, und ersetzen Sie es mit einer Spitze.</li>
		<li>Nehmen Sie einen neuen Chip und notieren Sie den Code auf dem Deckel der Probe zuzuordnende geschrieben.</li>
		<li>Halten Sie den Deckel sorgfältig an ihrer Seite, ziehen Sie die Schutzfolie und legen Sie den Deckel mit dem klebrigen Gesicht nach oben in der richtigen Ausrichtung.</li>
		<li>Sorgfältig holen Sie einen Chip, kümmert sich nicht um den internen Teil berühren ab und laden Sie es auf die Chipnest in der richtigen Position durch herunterdrücken des Hebels um die Klemme zu öffnen.</li>
		<li>Laden Sie ein neues laden-Blatt auf den Loader zu und schieben Sie ihn sanft, um sicherzustellen, dass es fest im Ort ist.</li>
		<li>14.5 µL dPCR Reaktion Mischung auf die Beladung Klinge ohne Luftblasen zu übertragen oder Ablenkung die Klinge nach dem Drücken der schwarzes laden Schaltfläche, um die Lautstärke auf dem Chip zu verteilen.</li>
		<li>Verwenden Sie die Immersion Flüssigkeit Spritze ca. 20 Tropfen auf die Chipoberfläche kümmert sich nicht um die Oberfläche mit der Spitze berühren zu übertragen. Hinweis: Es ist wichtig, die gesamte Fläche zu decken, ohne zu verschütten Flüssigkeit über die Kanten.</li>
		<li>Drehen Sie den Lader Arm machen den Deckel kommen in Kontakt mit dem Chip und drücken Sie für 15 s.</li>
		<li>Taste die Deckel lassen Sie den Chip und den Arm in seine Position zurück.</li>
		<li>Den montierten Chip in einem Winkel von 45° zu halten und sorgfältig verzichten die Immersionflüssigkeit mit der Spritze durch die Einfüllöffnung, Drehen des Chips leicht um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind und überschüssigen Flüssigkeit mit einem sterilen Tuch zu entfernen.</li>
		<li>Versiegeln den Chip-Fall sanft Peeling entfernt das Etikett auf dem Chip Deckel und Presse über die Einfüllöffnung für mindestens 5 s.</li>
		<li>Speichern Sie den Chip im Dunkeln erst unmittelbar in den Thermocycler zu laden. Hinweis: Vorbereitete Chips sollten innerhalb von 2 h eingesetzt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
dPCR Reaktion
	<ol>
<li>Öffnen Sie den Deckel und installieren Sie die Adapter für beide Blöcke zu, auch wenn ein einzelner Block verwendet wird.</li>
		<li>Legen Sie die Chips auf die probenblock in der richtigen Position. Hinweis: Die Einfüllöffnung muss auf der Vorderseite der Thermocycler in einer erhöhten Position um Luftblasen zu schweben nach oben zu ermöglichen, ohne zu stören das Fenster des Chips ausgerichtet werden. Verwenden Sie leere Chips, die beiden Blöcke auszugleichen.</li>
		<li>Legen Sie das Wärmeleitpad auf der probenblock vollständig bedecken die Chips.</li>
		<li>Schließen Sie den Deckel und starten Sie die PCR ausführen, die folgenden Bedingungen: halten Sie bei 96 ° C für 10 min; 45 Zyklen von 60 ° C für 2 min und 98 ° C für 30 s; halten Sie bei 60 ° C für 2 min; bei 4 ° c zu halten Schalten Sie den Thermocycler und tauen Sie die Chips bei Raumtemperatur mindestens 10 min lang. Hinweis: Chip-Analyse muss innerhalb einer Stunde durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chip-Analyse
	<ol>
<li>Öffnen Sie den Deckel des Gerätes und entfernen Sie die Wärmeleitpads, dann entfernen Sie die Späne aus dem Adapter. Hinweis: Bewahren Sie die Chips in einer dunklen, saubere Lage bis zur Analyse.</li>
		<li>Reinigen Sie die Chipoberfläche mit Isopropanol und ein steriles Tuch. Hinweis: Untersuchen Sie jeder Chip auf Lecks oder potenzielle Probleme.</li>
		<li>Stecken Sie den USB in das Detektorsystem zum Speichern der Daten.</li>
		<li>Öffnen Sie die Spänewanne das Detektorsystem, laden Sie den Chip nach oben in die richtige Position und schließen Sie das Fach.</li>
		<li>Warten Sie 30 s für Verarbeitung, dann entfernen Sie den Chip und setzen Sie die nächsten ein.</li>
		<li>Warten Sie, bis die Analyse für die verarbeiteten Chips abgeschlossen sein, dann stecken den USB an einen Computer übertragen. Hinweis: Die Gesamtzeit für die Analyse ist etwa 2 bis 3 min/Chip.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Daten-Analyse und Interpretation
<ol><li>Schließen Sie an die Cloud-basierte Software-Plattform erforderlich, um alle nachgeschalteten Analysen durchführen.</li>
	<li>Erstellen Sie ein Projekt und importieren Sie alle Datendateien des Chips von Interesse.</li>
	<li>Geben Sie den Probennamen; Wählen Sie die Farbe und Assay verwendet im Register "Definieren Chips".</li>
	<li>Bestimmen Sie, ob der Chip ist durch die Visualisierung es im Reiter "Daten", überprüfen, wie gründlich die Probe auf den Chip geladen wurde und wie viele Datenpunkte auswertbar sind akzeptabel. Hinweis: Lehnen Sie Chips mit weniger als 13.000 auswertbaren Datenpunkte ab.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem Streudiagramm des ausgewählten Chips auf der rechten Seite des Bildschirms; alle Chips eine Schwelle von 6.000 für die Fluorescein Amidite (FAM) Reporter Farbstoff Signale (Y-Achse) zuweisen. Hinweis: Die Schwelle richten Sie variieren aufgrund der Assays verwendet.</li>
	<li>Entfernen Sie keine dubiosen positive Signale zu falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden, durch die Auswahl der relativen Stelle auf die Streuung plot mit dem Lasso-Werkzeug und drücken auf "unbestimmt". Alle verbleibenden positiven Punkte deuten auf das Vorhandensein von cDNA Exemplare des seltenen Ziels analysiert.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren berichten keine Interessenkonflikte für diese Arbeit.

dPCR wurde ursprünglich entwickelt für DNA-molekulare Messungen10,11,12,13 und in der Zeit, die diese Technologie adaptiert wurde für die Quantifizierung von Micro-RNA und RNA Transkripte5, 14,15. In diesem Protokoll haben wir erweitert die Liste der Anwendungen zur Erkennung von seltenen Transkripte ...

Das CDH1 -Gen kodiert für E-Cadherin, ein entscheidender Faktor bei der Aufrechterhaltung der normalen Magen Epithel durch die Regulierung der Zelle Adhäsion, überleben, Proliferation und Migration1beteiligt. Verlust von E-Cadherin-Protein durch schädliche Keimbahn oder somatischen Veränderungen des CDH1 wurde die Entwicklung von GC2,3zugeordnet. Nicht-kanonische Transkripte aus Intron 2 des Gens haben auch vermutet, um eine Rolle im Magen Karzinogenese4,5. Insbesondere eine solche Abschrift, CDH1a, hat gezeigt, dass im GC Zell-Linien ausgedrückt werden aber fehlt aus dem normalen Magen-4. Wir haben vor kurzem CDH1a in GC Gewebeproben von GC Patienten mittels Chip-basierte dPCR5festgestellt. dPCR wurde verwendet, um zum ersten Mal das Vorhandensein der CDH1a gen Abschrift im Darm GC und im Normalgewebe zu bewerten.
Die Gold-Standard-Methode zur Bestimmung der Genexpression ist real-time quantitative PCR (qPCR). Die resultierenden Daten können jedoch manchmal Variable und von schlechter Qualität, vor allem wenn das Ziel in der Probe ist gering. Diese Variabilität kann durch Verunreinigungen, die Polymeraseaktivität und Grundierung glühen, hemmen, führt zu unspezifischen Verstärkung und wettbewerbsfähige Seite Reaktionen6verursacht werden.
Obwohl die biochemischen Grundlagen der dPCR ähnlich denen der qPCR sind dPCR zeigt einige Vorteile, so dass für sehr genaue Messungen von genomischer DNA (gDNA) / ergänzende DNA (cDNA) Moleküle. In der Tat ist dPCR ein Endpunkt Reaktion, die stützt sich auf die kalibrierten Partitionierung einer Probe in Tausende von Brunnen, so dass jeder gut Null oder ein Einzelziel-Molekül enthält. Verstärkung dann tritt nur in den Vertiefungen, die mit einer Kopie des Ziels und wird durch ein Fluoreszenzsignal angezeigt. Die absolute Zahl der Zielmoleküle in der ursprünglichen Probe kann dann berechnet werden, bestimmen das Verhältnis von positiven zu total Partitionen mit binomischen Poisson Statistiken7.
Darüber hinaus die dPCR Technik eliminiert die Notwendigkeit für eine Standardkurve ausgeführt und somit die damit verbundenen Vorurteile und Variabilität, so dass für eine direkte Quantifizierung der Ziele8,9; Es liefert präzise und reproduzierbare Ergebnisse unabhängig von Verunreinigungen und Effizienz durch seine hohe Toleranz gegenüber Inhibitoren10; Es ist empfindlicher und spezifischer als qPCR und ist somit eine zuverlässige Methode zum Nachweis von seltenen Ziel. Schließlich die Aufteilung der Probe in mehrere Reaktionen reduziert den Wettbewerb mit Hintergrund-Moleküle und verbessert die Grenze der Zielerfassung, wodurch Verstärkung möglich und erleichtert die Erkennung von einzelnen Molekülen gDNA/cDNA6 . Die Erkennung und Quantifizierung von Nukleinsäuren durch Chip-basierte dPCR zunehmend zum Kopieren von Nummer Variante angewendet wurde, Quantifizierung von DNA-Fragmenten und Mutation analysiert11,12,13, angesichts der Präzision und geringen Material Eingang Anforderung der Methode. Darüber hinaus wurde vor kurzem dPCR in die Analyse der beiden Micro-RNAs14 und gen Transkripte5,15integriert.

<table><tbody><tr><td>TRIazol Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen 20 mg/ml</td><td>ROCHE</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthese Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26358</td><td></td></tr><tr><td>CDH1a IDT kundenspezifischer Assay</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>NA</td><td>F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR-optimierte Assay-Konzentrationen: 900 nM (F),&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26316</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>Thermo&nbsp; Scientific</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler (Labcycler)</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N805-0200</td><td></td></tr><tr><td>Dual Flat Block Probenmodul</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4425757</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Tilt Base für Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4486414</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit für Flat Block Thermocycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485513</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4482592</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Instrument mit Netzkabel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4489084</td><td></td></tr></tbody></table>

erkennung einer cdh1 selten transkript variante in tiefkühlfrische magenkrebs geweben durch chip-basierte digitale pcr

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, eine nicht-kanonischen Abschrift des CDH1 -Gens hat gefunden worden, um in einigen Zelllinien von Magenkrebs (GC) ausgedrückt werden, während er fehlt in normale Magenschleimhaut. Vor kurzem erkannt wir CDH1a Abschrift Variante in Tiefkühlfrische Tumorgewebe von Patienten mit GC erhalten. Der Ausdruck dieser Variante in Gewebeproben wurde von der Chip-basierten digitalen PCR (dPCR) Ansatz hier vorgestellten untersucht. dPCR bietet das Potential für eine präzise, robust und hochempfindlichen Messung von Nukleinsäuren und wird zunehmend für viele Anwendungen in verschiedenen Bereichen genutzt. dPCR ist in der Lage erkennen selten Ziele; Darüber hinaus bietet dPCR die Möglichkeit für absolute und präzise Quantifizierung von Nukleinsäuren ohne die Notwendigkeit für Kalibratoren und Standardkurven. In der Tat bereichert die Reaktion Partitionierung das Ziel aus dem Hintergrund, der Verstärkung Effizienz und Toleranz gegenüber Inhibitoren verbessert. Diese Eigenschaften machen dPCR ein optimales Tool für die Erkennung der CDH1a selten Abschrift.

Bei der hier vorgestellten Verfahren haben wir uns für den Ausdruck der seltenen Transkript Variante CDH1a im Magen Tiefkühlfrische Gewebe. Die Analyse von dPCR wurde auf 21 gepaart normalen und Krebszellen Gewebeproben und in 11 zusätzliche Tumorproben durchgeführt. CDH1a war in 15 von 32 (47 %) Tumoren nachweisbar, wobei keine normalen Gewebeproben die Anwesenheit von dieser seltenen Transkript5 zeigte. In unserer Analyse wurden Chips mit wenige...

Das Manuskript beschreibt einen Chip-basierte digitale PCR-Assay zu erkennen, eine seltene CDH1 Transkript Variante (CDH1a) in Tiefkühlfrische normalen und Tumorgewebe von Patienten mit Magenkrebs erhalten.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, seltene Transkriptvarianten in frisch gefrorenen Geweben mittels chipbasierter digitaler PCR nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Krebsforschung zu beantworten, wie z.B. den Nachweis seltener Transkriptvarianten, die an der Krebsentstehung beteiligt sein können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Nachweis von Zielen mit geringer Häufigkeit ermöglicht und so die Präzision und Reproduzierbarkeit im Vergleich zum quantitativen Goldstandard PCR verbessert.Obwohl diese Methode einen Einblick in den Nachweis einer geringen Anzahl von cDNA-Molekülen in menschlichen, frisch gefrorenen Geweben geben kann, kann sie auch auf andere Arten von biologischen Proben angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es notwendig ist, einige Fähigkeiten bei der Vorbereitung der Chips und der Definition von Parametern für die Analyse zu erwerben. Lassen Sie den Mastermix und den Assay zunächst mindestens 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auftauen.Laden Sie dann 0,5-Milliliter-Röhrchen mit sechs Mikroliter-Aliquoten der cDNA-Proben. Machen Sie auch ein Kontrollrohr ohne Schablone. Anschließend den Mastermix vorsichtig vortexen und 8,7 Mikroliter pro Reaktion in ein steriles Röhrchen aliquotieren.Fügen Sie dann für jede Reaktion 0,87 Mikroliter des benutzerdefinierten Assay-Primers hinzu und fügen Sie 1,83 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu. Mischen Sie die Kombination vorsichtig und geben Sie 11,4 Mikroliter in jedes Röhrchen, das cDNA enthält, und in die Kontrolle ohne Vorlage. Mischen Sie dann die Röhrchen vorsichtig und poolen Sie den Röhrcheninhalt mit Hilfe der Impulszentrifugation.Um optimale Ergebnisse zu erzielen, laden Sie die Chips so schnell wie möglich. Schließen Sie den Spänelader an und warten Sie, bis die Kontrollleuchte grün leuchtet. Bereiten Sie dann die Tauchflüssigkeitsspritze vor, indem Sie den Kolben vorsichtig auf ein bis zwei Millimeter ziehen, dann die Kappe entfernen und die Spitze aufsetzen.Notieren Sie sich als Nächstes den Code, der auf dem Deckel eines neuen Chips geschrieben ist. Halten Sie dann den Deckel vorsichtig an die Seite, ziehen Sie die Schutzfolie ab und positionieren Sie ihn mit der klebrigen Seite nach oben im Deckelnest. Drücken Sie nun den Hebel nach unten, um die Klemme zu öffnen, und laden Sie den Chip vorsichtig in das Chipnest.Setzen Sie anschließend ein neues Ladeschild in den Lader ein. Schieben Sie es vorsichtig an, um sicherzustellen, dass es fest sitzt. Übertragen Sie nun 14,5 Mikroliter Reaktionsgemisch auf das Lademesser.Machen Sie keine Luftblasen und lenken Sie die Klinge nicht ab. Drücken Sie dann die schwarze Ladetaste, um das Volumen auf den Chip zu verteilen. Es ist wichtig, dass Sie sicherstellen, dass die Ladeklinge an Ort und Stelle ist.Drücken Sie die Pipette dann beim Befüllen der Klinge nicht bis zum zweiten Anschlag, um Blasenbildung zu vermeiden. Lenken Sie die Klinge auch nicht mit der Spitze ab. Fahren Sie fort, indem Sie mit der Spritze etwa 20 Tropfen Tauchflüssigkeit auf die Chipoberfläche geben.Achten Sie darauf, die Oberfläche nicht mit der Spitze zu berühren, und bedecken Sie die Oberfläche vollständig, ohne sie zu überlaufen. Drehen Sie dann den Ladearm so, dass der Deckel mit dem Chip in Kontakt kommt, und drücken Sie ihn 15 Sekunden lang nach unten. Drücken Sie dann die Deckeltaste, um den Chip freizugeben, und bringen Sie den Ladearm wieder in seine Ruheposition.Öffnen Sie nun die Klemme und halten Sie den zusammengebauten Chip in einem 45-Grad-Winkel, um die Tauchflüssigkeit vorsichtig über eine Spritze durch die Einfüllöffnung abzugeben. Drehen Sie dann den Chip leicht, um Luftblasen zu entfernen, und entfernen Sie dann überschüssige Flüssigkeit mit einem sterilen Tuch. Vermeiden Sie es, Immersionsflüssigkeit auf den Rand des Chips zu verschütten.Entfernen Sie in diesem Fall vorsichtig den Überschuss, bevor Sie ihn versiegeln. Verschließen Sie abschließend das Chipgehäuse, indem Sie das Etikett auf dem Deckel vorsichtig abziehen und dann die Einfüllöffnung mindestens fünf Sekunden lang blockieren. Verwenden Sie den Chip nun innerhalb von zwei Stunden und lagern Sie ihn bis dahin im Dunkeln.Um die Reaktion einzurichten, öffnen Sie den Deckel und installieren Sie die Adapter an beiden Blöcken, auch wenn ein einzelner Block verwendet wird. Platzieren Sie dann einen Chip auf den Probenblöcken, richten Sie die Füllöffnungen zur Vorderseite des Thermocyclers aus und heben Sie die Öffnung leicht an. Verwende leere Chips, um die beiden Blöcke auszubalancieren.Legen Sie anschließend das Wärmeleitpad über das Setup, um die Chips vollständig abzudecken. Programmieren Sie dann die Zyklen, schließen Sie den Deckel und starten Sie die Reaktion. Wenn die Reaktion beendet ist, schalten Sie den Thermocycler aus, entfernen Sie die Wärmeleitpads und entfernen Sie dann die Chips.Lassen Sie die Chips mindestens 10 Minuten im Dunkeln auf Raumtemperatur auftauen und analysieren Sie sie innerhalb einer Stunde. Reinigen Sie die Chipoberfläche mit Isopropanol, während Sie sie auf Undichtigkeiten oder andere Probleme untersuchen. Um die Daten zu speichern, stecken Sie einen USB-Speicherstick in das Detektorsystem, auf dem die Daten gespeichert werden können.Öffnen Sie dann die Chip-Schublade des Detektorsystems und legen Sie den Chip mit der bedruckten Seite nach oben ein. Schließen Sie das Fach und warten Sie 30 Sekunden, bis die Daten verarbeitet wurden. Entfernen Sie dann den Chip und wiederholen Sie den Vorgang für den nächsten Chip.Verschieben Sie als Nächstes den USB-Stick vom Detektor auf einen Computer und übertragen Sie die Dateien. Öffnen Sie die Cloud-basierte Software, erstellen Sie ein Projekt und importieren Sie alle Datendateien für die gewünschten Chips. Wählen Sie dann auf der Registerkarte Chips definieren den verwendeten Farbstoff und Assay aus.Stellen Sie fest, ob der Chip akzeptabel ist, indem Sie ihn auf der Registerkarte "Daten überprüfen" visualisieren. Wenn die Probe gut geladen wurde, sollten mindestens 13.000 Punkte nutzbar sein. Schauen Sie sich als Nächstes das Streudiagramm für den ausgewählten Chip an.Wenden Sie dort einen Schwellenwert an, der durch den Assay-Typ definiert ist. Für das Fluoresceinamidit-Reporterfarbstoffsignal ist ein Schwellenwert von 6.000 zu verwenden. Entfernen Sie nun alle zweifelhaften Signale, die zu Fehlalarmen führen könnten.Wählen Sie die fragwürdige Stelle im Streudiagramm mit dem Lasso-Werkzeug aus, und wählen Sie die Option Unbestimmt. Alle verbleibenden positiven Spots deuten auf das Vorhandensein von cDNA-Kopien des analysierten seltenen Ziels hin. Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurde die Expression der seltenen Transkriptvariante CDH1a in frisch gefrorenem Magengewebe überprüft.Wenn der Chip mehrere Blasen, eine einzige große Blase oder weniger als 13.000 Datenpunkte aufwies, wurde er in der Analyse nicht berücksichtigt. Es waren keine positiven Signale oberhalb des gewählten Schwellenwerts von 6.000 für den FAM-Kanal in der No-Template-Kontrolle vorhanden. Die gelben Punkte zeigen an, dass keine Verstärkung vorhanden ist.Eine feine Chip-Analyse filterte die minderwertigen Datenpunkte und eliminierte das Risiko mehrdeutiger Ergebnisse. Wenn ein blaues Signal lokalisiert wurde, das eine Verstärkung anzeigte, wenn es sich an den äußersten Rändern des Chips oder um Blasen herum befand, wurde das Signal weggelassen. Um das Risiko von Fehlalarmen weiter zu vermeiden, waren Signale oberhalb des ausgewählten FAM-Schwellenwerts und ganz rechts im Diagramm wahrscheinlich unspezifisch und wurden ebenfalls herausgefiltert.Es wurden 21 gepaarte Normal- und Krebsgewebeproben sowie 11 weitere Tumorproben analysiert. Insgesamt war das seltene Transkript CDH1a in 15 von 32 Tumoren nachweisbar. Im Gegensatz dazu zeigte keine der 21 Kontrollgewebeproben das Vorhandensein dieses seltenen Transkripts.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine seltene Transkriptvariante in frisch gefrorenem Gewebe durch chipbasierte digitale PCR nachweisen können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs bis acht Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Proben, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Probe genau in die Klinge zu laden.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der molekularen Diagnostik den Weg, seltene Sequenzvarianten bei Krebspatienten zu erforschen.

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Forschung

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