Auswertung der extrazellulären Vesikel Funktion im Malaria-Infektion

In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle, um die Rolle der extrazellulären Vesikel (EVs) veröffentlicht durch Plasmodium Falciparum infizierten Erythrozyten zu untersuchen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Wechselwirkungen von EVs mit Endothelzellen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktion der extrazellulären Vesikel zu untersuchen, die von den mit dem Malariaparasiten infizierten roten Blutkörperchen freigesetzt werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Malaria zu beantworten, z. B. wie die Parasiten die Parasiten-Wirt-Kommunikation regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Visualisierung der vesikulären Arbitage durch Indoterotzellen unter Untersuchung der regulatorischen Funktion der vesikulären RNA durch Indoterotzellen.

Das Verfahren wird von Mya Alondez, Smartin Bagu und Bayo Babatunde, allesamt Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. In ein Mikrozentrifugenröhrchen werden 100 Mikrogramm extrazelluläre Vesikel und ein Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung gegeben. Zentrifugieren Sie dann die extrazellulären Vesikel bei einer maximalen Geschwindigkeit von 20.000 g sieben Minuten lang, um ein Pellet zu bilden.

Sobald die Zentrifugation beendet ist, entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Lösen Sie dann das extrazelluläre Vesikelpellet in 100 Mikrolitern Dilumat auf C.To sorgen Sie für eine vollständige Mischung, pipettieren Sie es mehrmals. Geben Sie anschließend in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen vier Mikroliter der ethanolischen Farbstofflösung PKH67 zu 100 Mikrolitern Dilmant C.

Bereiten Sie die 40 Mikromolare 2XPKH67-Färbelösung kurz vor dem Färbeprozess vor. Kombinieren Sie dann schnell 100 Mikroliter von zwei x extrazellulärer vesikulärer Suspension mit dem gleichen Volumen der ethanolischen Farbstofflösung PKH67. Pipettieren Sie die Mischung dann 10 Mal, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten.

Nach dem vollständigen Mischen inkubieren Sie das extrazelluläre Vesikulum und die ethanolische Farbstofflösung PKH67 fünf Minuten lang ohne Licht. Während der Inkubation die Mischung drei- bis viermal vortexen. Um die Färbereaktion zu stoppen, fügen Sie der Mischung 200 Mikroliter Serum hinzu und inkubieren Sie eine Minute lang, damit sich der überschüssige Farbstoff binden kann.

Waschen Sie anschließend die extrazellulären Vesikel dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Nach dem Waschen zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 20.000 g g. Lösen Sie dann das extrazelluläre vesikuläre Pellet in 100 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf, um eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter zu erreichen.

Übertragen Sie die Endothelzellen in einem Milliliter vollständigem Endothelzellwachstumsmedium auf ein mit Polyelithen beschichtetes Deckglas. Lassen Sie die Zellen zu einer Monoschicht auf dem Deckglas wachsen. Nachdem die Monoschicht gebildet wurde, entfernen Sie das Medium vorsichtig und fügen Sie einen Milliliter frisches Medium hinzu, um die Zellen zweimal zu waschen.

Geben Sie dann 50 Mikrogramm PKH67-gefärbte extrazelluläre Vesikel auf den Deckglas und inkubieren Sie vier Stunden lang. Nach der Inkubation das Medium ansaugen. Um alle ungebundenen extrazellulären Vesikel zu entfernen, waschen Sie die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Bei der Färbung der Deckgläser ist mit einer feinen Zange Vorsicht geboten, um Zellverlust und Deckglasbruch zu vermeiden. Verwenden Sie nach dem Waschen drei Prozent Paraformaldehydlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um die Zellen 15 Minuten lang zu fixieren. Waschen Sie die Zellen erneut dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und fügen Sie 250 Mikroliter 0,1 Prozent Tritan x 100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung hinzu, um die Zellen zu permeablizieren und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren.

Waschen Sie anschließend die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und fügen Sie den Zellen 400 Mikroliter Blockpuffer hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen dreißig Minuten lang bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Waschen Sie die Zellen nach dem Blockieren einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Verdünnen Sie dann fünf Mikroliter Phalloiden-Stammlösung in 200 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem Prozent Rinderserumalbumin, um die Färbelösung für jedes Deckglas herzustellen. Anschließend 200 Mikroliter der Färbelösung auf den Deckglas geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sobald die Inkubation beendet ist, waschen Sie die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Verwenden Sie dann die Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter Hooksed 3342 in 200 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um die DNA 30 Sekunden lang gegenzufärben. Fügen Sie nach dem Färben 400 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu, um den Deckbezug zweimal zu waschen. Heben Sie dann das Deckglas vorsichtig mit Hilfe einer Pinzette an und drehen Sie es auf der Oberseite eines Tropfens Antifading-Montagemedium auf einem Glasobjektträger um.

Verwenden Sie ein Taschentuch, um überschüssige Medien vorsichtig zu entfernen, und versiegeln Sie dann die Umgebung mit Nagellack. Es sollte auch sehr darauf geachtet werden, dass die Zellen während der Mikroskopie nicht zu viel Farbstoff ausgesetzt werden, um ein Zellbleichen zu vermeiden. In einem 24-Well-Gewebekultureinsatz mit einer Pour-Größe von 0,4 Mikromolaren Endothelzellen säen.

Lassen Sie die Zellen dann fünf Tage lang ungestört in der Kultur wachsen, um eine differenzierte Monoschicht zu bilden. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag. Sobald sich die Monoschicht gebildet hat, säen Sie 50 Mikrogramm in einem Milliliter extrazellulärer Vesikel in der oberen Kammer aus.

Geben Sie dann 20 Milligramm pro Milliliter Rotomindextran in die obere Vertiefung und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid. Überwachen Sie die Migration des fluoreszierenden Dextrans zum Boden der Vertiefung, indem Sie die Fluoreszenzmission von 40 Mikrolitern Medium Avoquat messen. Programmieren Sie dann die Anregungswellenlänge bei 544 Nanometern und die Emissionswellenlänge bei 590 Nanometern für einen Multi-Label-Mikroplatten-Reader.

Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen zu zählen. Anschließend werden die Endothelzellen in vollständigem Endothelkulturmedium erneut suspendiert und die Zellen in einer 96-Well-Platte in 100 Mikrolitern Endothelzellwachstumsmedium ausgesät. Um eine Konzentration von 0,1 bis zehn Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen, fügen Sie 100 Mikroliter antibiotisches Medium hinzu.

Überwachen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen jeden zweiten Tag mit einem 20-fachen Objektiv unter dem Lichtmikroskop. Kultivieren Sie die Zellen für weitere 10 bis 14 Tage und ersetzen Sie das antibiotische Medium je nach Zellwachstum alle zwei bis drei Tage. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter MTS-Reagenz in jede Vertiefung und mischen Sie das Reagenz.

Inkubieren Sie die 96-Well-Platte vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach vier Stunden die Platte auf einem Shaker kurz umrühren. Anschließend lesen Sie die Absorptionsmittel der behandelten und unbehandelten Zellen mit einem Plattenleser bei 490 Nanometern ab.

Einen Tag vor der lentiviralen Transduktion säen Sie die Endothelzellen in einem Milliliter vollständigem Medium aus. Warten Sie, bis die Zellen eine Konfluenz von 50 bis 80 Prozent für die lentivirale Transduktion erreicht haben. Bevor Sie das Röhrchen öffnen, drehen Sie die lentivirale Suspension 30 Sekunden lang mit dem 200-fachen g, um ein Überlaufen zu vermeiden. Geben Sie dann Hexidimethrynbromid zu den Zellen, um eine Endkonzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter einzustellen, und schwenken Sie die Platte vorsichtig.

Geben Sie das Lentivirus zu den Zellen und schwenken Sie die Platte erneut vorsichtig für 30 Sekunden, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Um die Effizienz der lentiviralen Transduktion zu erhöhen, zentrifugieren Sie das Zell-Virus-Gemisch bei 300-mal g für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Dann inkubieren Sie das Zell-Virus-Gemisch bei 37 Grad Celsius über Nacht.

Entsorgen Sie am nächsten Tag das Viruspartikel, das Medium enthält, und ersetzen Sie es durch vorgewärmtes, frisches, vollständiges Kulturmedium. Beginnen Sie am zweiten Tag mit der Puromycin-Auswahl. Ersetzen Sie das komplette Kulturmedium durch puromycinhaltiges Medium.

Ernten Sie nach der Puromycin-Selektion die Zellen. Isolieren Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers RNA aus den Zellen mit einem RNA-Isolationskit. Verwenden Sie ein reverses Transkriptionskit, um die komplementäre DNA mit den ausgewählten Mikro-RNAs zu isolieren.

Richten Sie dann die quantitative PCR-Reaktion ein. Um die Internalisierung der extrazellulären Vesikel durch Endothelzellen zu überwachen, wurden PKH67-markierte grüne Vesikel mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. In dem Assay werden Faloudin und Hookst 33342, deren Färbungen in Rot bzw. Nuklidblau wirken, verwendet, um die Translokation der Vesikel innerhalb der Endothelzellen zu verfolgen.

Konfokale Bilder zeigen eine bereitwillige Aufnahme der Vesikel durch die Endothelzellen nach vier Stunden. Als nächstes wurde zur Untersuchung der Permeabilität der Diffusionsfähigkeit der Endothelzell-Monoschicht von Rodamin b isothyosionadedextran analysiert. Dieser Assay zeigt, dass die Inkubation der Endothelzellen mit 50 und 100 Mikrogramm pro Milliliter extrazellulärer Vesikel die Permeabilität der endothelialen Monoschicht nach zwei Stunden erhöhte.

In der Grafik stellt die x-Achse die Konzentration der extrazellulären Vesikel und die y-Achse die Faltenänderungen der endothelialen Permeabilität dar, die bei 590 Nanometern gemessen wird. Um die Empfindlichkeit der Endothelzellen unter Puromycin-Behandlung zu bestimmen, wurde anschließend eine Kill-Kurve erstellt. Die Abtötungskurve zeigt, dass bereits 0,15 Mikrogramm pro Milliliter Puromycin ausreichen, um alle Zellen abzutöten.

Darüber hinaus wurde zur Bestimmung des Expressionsniveaus von micro-RNA451a, die aus den Endothelzellen isoliert wurde, eine quantitative Echtzeit-PCR durchgeführt. Die Balkendiagramme zeigen eine signifikante Überexpression des micro-RNA451a-Transkripts gegen das Haushälter-Gen U6. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten, um die Rolle von Evs bei der Wirtsinteraktion und der zellulären Kommunikation durch den Transfer von genetischem Material zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Aufnahme von EV durch Empfängerzellen visualisiert und wie man die Funktion kleiner einschließlich RNA bei der Regulation von Endothelzellen untersucht.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Malaria-Parasiten und menschlichem Blut extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, einem Laborkittel und das Arbeiten unter einer sterilen Haube bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.