Name: Auswertung der extrazellulären Vesikel Funktion im Malaria-Infektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie extrazelluläre Vesikel bei Malaria-Infektionen isoliert und visualisiert werden, um die Interaktion mit Endothelzellen zu untersuchen. Diese Methode liefert Einblicke in die Parasit-Wirt-Kommunikation.

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Diese Studie wurde von der Novartis-Stiftung für medizinische und biologische Forschung (um PYM), der Gottfried und Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (für MW und PYM) und den Forschungspool der Universität Freiburg (um PYM) teilweise finanziell unterstützt. Weitere Beihilfen gehören die Schweizer Regierung Excellence Scholarships für ausländische Wissenschaftler (zur KAB und SM). Wir danken Isabelle Fellay und Solange Kharoubi Hess für technischen Support.

Menschlichen Erythrozyten stammen aus dem Blut von gesunden Spendern, gemäß den Richtlinien des AGEK (swissethics.ch).
Hinweis: P. Falciparum Parasit Kulturen (3 7) und EV Produktion waren zuvor beschrieben in Mbagwu, Et Al. 11 da p. Falciparum ein menschlicher Erreger handelt, wenden Sie sich an die örtlichen Vorschriften Handhabung. Die Kulturen aufbewahrt werden sterile die gesamte Zeit.
(1) Fluoreszenz Kennzeichnung des EFD
Hinweis: Das folgende Verfahren nutzt die Kennzeichnung Technologie, einen grünen Fluoreszenzfarbstoff (PKH67) stabil zu integrieren mit großen aliphatischen Schwänzen in der Lipid-Region der EV-Membran. Die Reaktion erfolgt in einem 200 µL letzte Band mit einer Endkonzentration von 20 µM von PKH67 Färbung. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur (20-25 ° C)
<ol><li>Platz 100 µg des EFD in 1 mL PBS in einem Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Zentrifugieren der EVs in einem Microcentrifuge Schlauch mit maximaler Geschwindigkeit (20.000 x g) für 7 min zu Pellets. Hinweis: Da im Rahmen des EFD Hemozoin vorliegt, ist ein rot-dunkel bräunlicher Pellet hinzuweisen. Wenn der Überstand rötlich ist, haben die EVs lysiert.</li>
	<li>Aspirieren Sie nach Zentrifugation überstand sorgfältig, um zu vermeiden, entfernen EVs. Hinweis: Minimieren Sie die Menge der verbleibenden Puffer vorhanden ist, bevor resuspending EVs im Verdünnungsmittel C um Reproduzierbarkeit und Effizienz der Färbung zu erhöhen.</li>
	<li>Aufschwemmen EV Pellet in 100 µL Verdünnungsmittel C (2 X EV Suspension) und sanft pipettieren, komplette Dispersion zu versichern.</li>
	<li>Bereiten Sie einen neuen Microcentrifuge Schlauch und 100 µL des Verdünnungsmittels C. Vortex gut mischen fügen Sie 4 µL der PKH67 ethanolische Farbstofflösung hinzu. Bereiten Sie diese 2 X Farbstofflösung (40 µM) unmittelbar vor der Färbung. Hinweis: Um zu vermeiden, heterogene Färbung, fügen Sie die PKH67 ethanolische Farbstofflösung direkt zum EV Pellet.</li>
	<li>Kombinieren Sie schnell, die 100 µL 2 X EV Suspension (Schritt 1.4) mit 100 µL 2 X Farbstofflösung (Schritt 1.5). Dann mischen Sie die Probe durch Pipettieren nach oben und unten 10 Mal.</li>
	<li>Inkubieren Sie die EV/Farbstoff Suspension aus Schritt 1.6 für 5 min geschützt vor Licht und Mischung von vortexen 3-4 Mal während der Inkubation 5 min. Hinweis: Inkubation der EV/Farbstoff Suspension für längere Zeiten bietet keinen Vorteil, denn die Färbung so schnell.</li>
	<li>Stoppen Sie die Färbung Reaktion durch Zugabe von ein gleiches Volumen (200 µL) des Serums zu und inkubieren Sie für 1 min zur Bindung von überschüssigen Farbstoff zu ermöglichen. Hinweis: Vor dem Anhalten der Färbung, zum Abbau des Serums von EVs durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 20 min.</li>
	<li>3 Mal mit PBS waschen und Spin-down bei 20.000 x g für 5 min. Aufschwemmen der EVs in 100 µL PBS, eine Endkonzentration von 1 µg/µL zu erreichen.</li>
</ol>2. visualisieren Sie Aufnahme des EFD konfokalen Mikroskopie
Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Verfolgung von EV Internalisierung von Endothelzellen auf Glasdeckgläser angebaut. Die Endothelzellen sind semi-verewigt menschlichen Knochenmark Endothelial Zellen wie in12beschrieben.
<ol><li>Arbeiten in einer sterilen Umgebung, Mantel Deckgläsern mit einem Überschuss von 0,01 % Poly-L-Lysin für 10 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Aspirieren Sie die Poly-L-Lysin-Lösung und lassen Sie Deckgläsern vollständig trocknen.</li>
	<li>Führen Sie eine tragfähige Endothelzellen Zählung verwenden Trypan blau Ausgrenzung und eine Hemocytometer.</li>
	<li>1 x 105 Endothelzellen in 1 mL der komplette Endothelial Zelle Wachstumsmedium, enthält die Ergänzung-Mischung, um die Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläsern und lassen die Zellen wachsen zu einem monomolekularen Film zu übertragen. Hinweis: Das Medium enthält Wachstumsfaktoren, die Zellen zu einem monomolekularen Film bilden und tight Junctions bilden können.</li>
	<li>Sobald die Zellen einer monomolekularen Film bilden, sorgfältig aspirieren Sie das Medium und 1 mL frisches Medium, die Zellen zu waschen. Wiederholen Sie noch einmal waschen. Fügen Sie 50 µg des EFD PKH67 beschriftet und 4 h inkubieren. Hinweis: Um den optimalen Zeitpunkt für die Aufnahme zu finden, kann ein zeitlichen Verlauf erfolgen.</li>
	<li>Aspirieren Sie nach 4 h das Medium, und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS, Exzess und ungebundenen EVs zu entfernen. Befestigen Sie die Zellen mit 3 % Paraformaldehyd Lösung mit PBS-Puffer für 15 Minuten. Hinweis: Methanol kann bei der Fixierung Aktin stören; Daher empfiehlt es sich, jede Methanol, Fixiermittel oder andere Lösungsmittel Fixiermittel enthalten zu vermeiden. Es empfiehlt sich, frei von Methanol Formaldehyd als Fixiermittel verwenden.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS. Fügen Sie sorgfältig 250 µL von 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer für die Zellen permeabilize. 5 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal mit PBS. Fügen Sie 400 µL blocking-Puffer (5 % BSA mit PBS-Puffer) für 30 min bei RT, unspezifischen Bindung zu blockieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Bereiten Sie die Färbelösung durch Verdünnung 5 µL der Phalloidin Vorratslösung in 200 µL PBS/1% BSA pro jedes Deckglas. Pipettieren 200 µL der Färbelösung auf das Deckglas und 20 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal mit PBS. Counterstain die DNA für 30 s mit Hoechst 33342 auf eine Endkonzentration von 2 µg/mL in 200 µL PBS.</li>
	<li>Waschen Sie 2 x das Deckglas durch Zugabe von 400 µL PBS. Vorsichtig das Deckglas mit Zange greifen und auf der Oberseite einen Tropfen Antifade Montage Medien auf einen Objektträger zu invertieren. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Medien mit einem Tuch und versiegeln Sie jede Seite mit Nagellack.</li>
	<li>Lagern Sie die Folien bei 4 ° c lichtgeschützt</li>
	<li>Visualisieren Sie die Zellen mit einem confocal Mikroskop am Laser Erregungen 405, 488 und 543 nm und einer 63 X 1,3 NA Öl Ziel mit fluoreszierenden Emissionen bei 450-470 nm (blau), 505-530 nm (grün) und 620 nm. Hinweis: Typische F-Aktin Färbung Ergebnisse sind in Abbildung 1gezeigt.</li>
</ol>(3) Endothelzellen Durchlässigkeit
Hinweis: Endothelzellen Durchlässigkeit wird durch die Messung der Übertragung von Rhodamin B erfolgt-Dextran (durchschnittliche MW 70.000) über die Endothelzellen Monolage beurteilt. Dextran bietet ein ausgezeichnetes Werkzeug zur vaskulären Permeabilität zu studieren.
<ol><li>Graf tragfähige Endothelzellen mit 0,4 % Trypan blau Ausgrenzung und eine Hemocytometer.</li>
	<li>Platte die Endothelzellen bei einer Dichte von 0,6 x 105 Zellen bis Mündung in 24-Well-Zellkultur-Einsätze (0,4 µm Porengröße) und lassen Sie ungestört für mindestens 5 Tage, differenzierte Monolagen zu bilden. Aktualisieren Sie das Medium jeden zweiten Tag.</li>
	<li>Sobald die Zellen einer Monoschicht erreichen, laden die EVs (50 µg in 1 mL) auf die obere Kammer. Fügen Sie die Rhodamin-Dextran zum oberen Brunnen in einer Endkonzentration von 20 mg/mL. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Überwachen Sie die Übertragung von fluoreszierenden Dextran nach unten gut durch Messung der Fluoreszenzemission von 40 µL Medium Aliquote. Richten Sie den Multilabel Mikrotestplatte Leser auf 544 nm Anregung und 590 nm Emission für Messungen. Hinweis: Die Menge an diffusen Dextran kann mit Kalibrierkurven gegründet mit der Stammlösung quantifiziert werden. Darüber hinaus können kinetische Experimente durchgeführt werden, durch das Entfernen von kleiner Proben des Mediums Außenkammer in einen zeitlichen Verlauf (Abbildung 2). Auch ohne Behandlung wird die Dextran durch die Zelle Monolage diffundieren.</li>
</ol>4. bestimmen Sie Puromycin Empfindlichkeit
Hinweis: Vor transducing die Zelllinien mit Lentivirus, ist es wichtig, die Kill-Kurve eines ausgewählten Arzneimittels für diese bestimmte Zelle Zeile zu bestimmen. Zur Bestimmung des Mindestbetrag der Wirkstoffkonzentration notwendig, alle Zellen zu töten, eine Dosis-Antwort-Experiment mit inkrementellen Dosen des Medikaments ausgewählten durchführen. Weil jede Zeile Säugetier-Zelle verfügt über eine andere Empfindlichkeit vor dem experimentieren, sollte die optimale Konzentration des Antibiotikums bestimmt werden, durch die Entwicklung der Kill-Kurve-Titration wie unten aufgeführt.
<ol><li>Zählen Sie die Zellen mit den Hemocytometer. Aufschwemmen der Endothelzellen in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/mL in komplette Endothelial Zelle Wachstum-haltigem Medium der Supplement-Mix.</li>
	<li>Platte 1 x 104 LiPo-Zellen in einer 96-Well-Platte in einem Endvolumen von 100 µL des Mediums Endothelial Zelle Wachstum.</li>
	<li>100 µL der Antibiotika zu einer Konzentration von 0,1-10 µg/mL-haltigem Medium hinzufügen (siehe Abbildung 3).</li>
	<li>Die Zellviabilität alle 2 Tage unter einem Lichtmikroskop mit einem 20 X Objektiv zu prüfen. Kultur der Zellen für 10-14 Tage und das Medium mit Puromycin alle 2-3 Tage je nach Zellwachstum zu ersetzen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL/Well MTS Reagenz in jede Vertiefung, Mischung, und 4 h bei 37 ° C im standard Kulturbedingungen inkubieren.</li>
	<li>Schütteln Sie die Platte kurz in einen Shaker geben und Messen Extinktion von behandelten und unbehandelten Zellen mit einem Teller Reader auf 490 nm (Abbildung 3).</li>
</ol>(5) Transduktion von Endothelzellen mit Lentivirale Vektor
<ol><li>Platte 1 x 105 Endothelzellen in 1 mL der kompletten Medium am Vortag Transduktion. Führen Sie Transduktion, wenn die Zellen 50-80 % Konfluenz erreicht haben.</li>
	<li>Tauen Sie die Lentivirus auf Eis auf, und machen Sie Aliquote der viralen Bestände, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Spin-down das Material bei 200 X g für 30 s in Röhren vor dem öffnen um Verschütten zu vermeiden.</li>
	<li>Die Zellen in einer Endkonzentration von 8 µg/mL Hexadimethrine Bromid hinzufügen. Hinweis: Hexadimethrine Bromid hilft die Transduktion Effizienz, jedoch in einigen Fällen für die Zellen giftig sein könnte. Daher sollte die optimale Konzentration bestimmt werden, durch die Durchführung einer Tötung Kurve vor der Transduktion.</li>
	<li>Schwenken Sie die Platte vorsichtig mischen. Fügen Sie die entsprechende Menge der Viruspartikel (zwischen 0,5-2 x 106 Teilchen) am geeignet Multiplizität der Infektion (MOI) und wirbeln die Platte vorsichtig für 30 s zu mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zelle-viralen Partikel Mix in der Zentrifuge bei RT für 45 min bei 300 X g zur Steigerung der Effizienz der Transduktion. Über Nacht inkubieren Sie die Zelle Viruspartikel Mischung bei 37 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig das virale Partikel-haltigen Medium und entsprechend entsorgen. Ersetzen Sie es mit frischen, vorgewärmten komplette Kulturmedium.</li>
	<li>Starten Sie die Auswahl mit Puromycin am zweiten Tag: das Medium zu entfernen und ersetzen es durch frisches Medium mit der richtigen Konzentration von Puromycin wie zuvor im Abschnitt 4 (Abbildung 3).</li>
	<li>Zellen nach Puromycin Auswahl zu ernten und RNA mit einer RNA Isolierung Kit nach den Anweisungen des Herstellers zu isolieren.</li>
	<li>Ausführen cDNA Synthese mit dem ausgewählten MiRNAs mit Hilfe einer reversen Transkription kit (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Die qPCR-Reaktion nach der zitierten Protokoll13eingerichtet.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Einige Parasiten, einschließlich Toxoplasma, Trypanosomen und Leishmanien Trichomonas auslösen die Freigabe der EVs von der infizierten Wirtszelle. Je nach Erreger können freigegebene EVs vermitteln zelluläre Kommunikation zwischen den Parasiten6bzw. der Host Immunantwort modulieren. Jedoch gibt es wenig Hinweise darauf, wie diese kleinen Bläschen zu Malaria Krankheit beitragen. Hier haben wir mehrere Möglichkeiten, um die Funktion des EFD bei Plasmodium Infektion untersuchen beschrieben....

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation gab es 212 Millionen neue Fälle von Malaria im Jahr 2015 weltweit und rund 429.000 Menschen starben, vor allem Kinder unter fünf Jahren Alter1. Die Mechanismen, die schwere Krankheit, die oft mit vaskuläre Dysfunktion assoziiert wird, bleiben unklar2. Plasmodium- iRBCs absondern, kleine Bi-Lipidmembran Sphären als extrazelluläre Vesikel (EVs) bekannt. Es ist bekannt, dass diese EVs den Infektionsprozess und die Host-Immunantwort auf eine Infektion potenziell relevant sind; jedoch ist wenig bekannt über die genaue Funktion von diesen kleinen Vesikeln in Malaria-Infektion3. Es ist möglich, dass sie zwei wichtige Rollen spielen: auf der einen Seite könnte sie zur Pathogenese beitragen, durch die Aktivierung von Makrophagen4,5; und auf der anderen Seite könnten sie zellulare Kommunikation zwischen Parasiten und zwischen Parasiten und Host6,7vermitteln. In der Tat können Parasiten Proteinen oder Nukleinsäuren untereinander über EFD übertragen. Z. B. Trypanosomen Trypanosomen Rhodesiense EVs Virulenzfaktor Serum Resistance-Associated (SRA) zu übertragen und kann gezielt andere T. Trypanosomen und Host Erythrozyten-8. Darüber hinaus kommunizieren p. Falciparum- iRBCs zwischen einander durch die Übertragung von Nukleinsäuren im EFD. Dadurch können die Parasiten zu optimieren und das Wachstum zu synchronisieren. In der Tat EVs möglicherweise wichtiger Regulator der Gametocyte Umwandlung, und somit dazu beitragen, die Regelung der Übertragung Stufe7.
Nicht nur tun EVs regulieren die Parasiten, sie vermitteln auch Parasit-Wirt-Interaktionen. Wir haben kürzlich entdeckt, dass EVs aus iRBCs Host-abgeleitete Micro-RNAs (MiRNAs; kleine RNA-Spezies im Bereich von 21-25 Nukleotide9) enthalten, die von menschlichen Endothelzellen aufgegriffen wurden. Die MiRNAs in der EVs bilden eine stabile komplexe mit Ago2 (ein Mitglied des RNA-induced silencing complex), die einmal an den Empfängerzellen geliefert ist in der Lage, gezielt Genexpression zum Schweigen zu bringen und die Auswirkungen auf die Barriereeigenschaften der Zellen10. Standard-Protokolle wurden entwickelt, um die Funktion des EFD zu untersuchen. Hier beschreiben wir zunächst ein Protokoll, das fluoreszierende Kennzeichnung von EVs zu untersuchen, deren Aufnahme durch Empfängerzellen ermöglicht. Mithilfe einer confocal Mikroskop ist es darüber hinaus möglich, die EV Schicksal innerhalb der Zelle zu verfolgen. Einige Leuchtstofffärbungen können verwendet werden, um EVs zu verfolgen. Die Amin-Reaktivfarbstoffen, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFSE-) und Calcein-AM werden Leuchtstoffröhren einmal im Inneren der Bläschen. Wir bevorzugen die amphiphile Label, PKH, weil es ein heller und gleichmäßiger Signal gibt. Dieser Ansatz bietet wichtige Informationen, um die Wechselwirkungen zwischen EVs und Empfängerzellen verstehen. Während in einigen Fällen EVs an der Oberfläche der Zellen zu binden, werden einige Bläschen schnell aufgegriffen. Nach Aufnahme liefern EVs ihre Fracht an den Zellen, in denen sie ihre regulatorische Funktionen ausüben.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Barriere-Funktion der Endothelzellen in-vitro- messen durch die Übertragung von einem fluoreszierenden Dextran durch eine zelluläre Monolage zu quantifizieren. Empfindlicher Tracer können z. B. radioaktiven Marker verwendet werden. Sie erfordern jedoch besondere Sicherheitsvorkehrungen für den Einsatz. Andere Tests bestehen, um die in-vitro- Barriere-Funktion wie Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER), zu messen, die engen Kreuzung Integrität misst. Schließlich visualisieren ZO-1, eine tight Junction Proteins durch Immunfluoreszenz ermöglicht Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen enge Kreuzung als gut10. Da die EVs komplexen und heterogenen Entitäten enthält mehrere Ladungen mit möglichen regulatorischen charakteristisch sind, ist es sinnvoll, eine spezifische RNA um seine Wirkung auf die Empfängerzelle studieren overexpress. Deshalb definieren wir auch eine Protokoll, die darauf abzielt, stabilen Zelllinien mit dem Ausdruck der MiRNA Interesse10zu generieren.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Grün fluoreszierender Zellverlinker Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Verdünnungsmittel C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin CF594</td><td>Biotium</td> <td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Eindeckmittel</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin B Isothiocyanat&ndash; Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Einsatz mit PET-Membran transparent Falcon&nbsp; für Platte 24 Vertiefungen</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth&nbsp; Medium MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin-Dihydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Zellproliferation Kolorimetrisches Assay-Kit</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>Hexadimethrinbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&nbsp; Lenti microRNA, humane has-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negativkontrolle 1 Transduktionspartikel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&nbsp; Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transkription Kit 1000 Reaktionen</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>has-mir-451a&nbsp; RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, mit UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

auswertung der extrazellulären vesikel funktion im malaria-infektion

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria ist eine lebensbedrohliche Krankheit, verursacht durch Plasmodium -Parasiten, mit p. Falciparum als auf dem afrikanischen Kontinent verbreitet und verantwortlich für die meisten Malaria-Todesfälle weltweit. Mehrere Faktoren einschließlich der Parasit Sequestrierung in Geweben, vaskuläre Dysfunktion und Entzündungsreaktionen beeinflussen die Entwicklung der Krankheit bei Menschen mit Malaria infiziert. P. Falciparum-infizierten roten Blutkörperchen (iRBCs) lösen kleine extrazelluläre Vesikel (EVs), enthält verschiedene Arten von Fracht-Moleküle, die Pathogenese und zelluläre Kommunikation zwischen Parasiten und Host zu vermitteln. EVs werden effizient durch Zellen aufgenommen in denen sie ihre Funktion modulieren. Hier besprechen wir Strategien, um die Rolle der EVs in Parasit-Wirt-Interaktionen. Zunächst beschreiben wir eine einfache Methode für die Kennzeichnung und Nachverfolgung EV Internalisierung von Endothelzellen, mit einem grünen Zelle Linker Farbstoff. Zum anderen berichten wir über eine einfache Methode zur Durchlässigkeit über eine Monolage Endothelzellen messen mithilfe von Eindringmittel beschrifteten Dextran. Schließlich zeigen wir, wie die Rolle der kleine nicht-kodierende RNA-Moleküle in Endothelzellen Funktion zu untersuchen.

Hier beschreiben wir Protokolle untersuchen die Wechselwirkungen des EFD mit Wirtszellen. Die Aufnahme von Eindringmittel beschrifteten EVs wird durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1) überwacht. Endotheliale Zellen nehmen effizient EVs, aber die Inkubationszeit mit EVs optimiert werden kann, um die Aufnahme zu verfolgen. Färben Sie für eine bessere Lokalisierung der EVs in den Zellen Actin mit Phalloidin. Als Nächstes verwenden wir eine Filtermembran, auf ...

In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle, um die Rolle der extrazellulären Vesikel (EVs) veröffentlicht durch Plasmodium Falciparum infizierten Erythrozyten zu untersuchen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Wechselwirkungen von EVs mit Endothelzellen.

Auswertung der extrazellulären Vesikel Funktion im Malaria-Infektion

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktion der extrazellulären Vesikel zu untersuchen, die von den mit dem Malariaparasiten infizierten roten Blutkörperchen freigesetzt werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Malaria zu beantworten, z. B. wie die Parasiten die Parasiten-Wirt-Kommunikation regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Visualisierung der vesikulären Arbitage durch Indoterotzellen unter Untersuchung der regulatorischen Funktion der vesikulären RNA durch Indoterotzellen.Das Verfahren wird von Mya Alondez, Smartin Bagu und Bayo Babatunde, allesamt Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. In ein Mikrozentrifugenröhrchen werden 100 Mikrogramm extrazelluläre Vesikel und ein Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung gegeben. Zentrifugieren Sie dann die extrazellulären Vesikel bei einer maximalen Geschwindigkeit von 20.000 g sieben Minuten lang, um ein Pellet zu bilden.Sobald die Zentrifugation beendet ist, entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Lösen Sie dann das extrazelluläre Vesikelpellet in 100 Mikrolitern Dilumat auf C.To sorgen Sie für eine vollständige Mischung, pipettieren Sie es mehrmals. Geben Sie anschließend in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen vier Mikroliter der ethanolischen Farbstofflösung PKH67 zu 100 Mikrolitern Dilmant C.Bereiten Sie die 40 Mikromolare 2XPKH67-Färbelösung kurz vor dem Färbeprozess vor. Kombinieren Sie dann schnell 100 Mikroliter von zwei x extrazellulärer vesikulärer Suspension mit dem gleichen Volumen der ethanolischen Farbstofflösung PKH67. Pipettieren Sie die Mischung dann 10 Mal, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten.Nach dem vollständigen Mischen inkubieren Sie das extrazelluläre Vesikulum und die ethanolische Farbstofflösung PKH67 fünf Minuten lang ohne Licht. Während der Inkubation die Mischung drei- bis viermal vortexen. Um die Färbereaktion zu stoppen, fügen Sie der Mischung 200 Mikroliter Serum hinzu und inkubieren Sie eine Minute lang, damit sich der überschüssige Farbstoff binden kann.Waschen Sie anschließend die extrazellulären Vesikel dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Nach dem Waschen zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 20.000 g g. Lösen Sie dann das extrazelluläre vesikuläre Pellet in 100 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf, um eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter zu erreichen.Übertragen Sie die Endothelzellen in einem Milliliter vollständigem Endothelzellwachstumsmedium auf ein mit Polyelithen beschichtetes Deckglas. Lassen Sie die Zellen zu einer Monoschicht auf dem Deckglas wachsen. Nachdem die Monoschicht gebildet wurde, entfernen Sie das Medium vorsichtig und fügen Sie einen Milliliter frisches Medium hinzu, um die Zellen zweimal zu waschen.Geben Sie dann 50 Mikrogramm PKH67-gefärbte extrazelluläre Vesikel auf den Deckglas und inkubieren Sie vier Stunden lang. Nach der Inkubation das Medium ansaugen. Um alle ungebundenen extrazellulären Vesikel zu entfernen, waschen Sie die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Bei der Färbung der Deckgläser ist mit einer feinen Zange Vorsicht geboten, um Zellverlust und Deckglasbruch zu vermeiden. Verwenden Sie nach dem Waschen drei Prozent Paraformaldehydlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um die Zellen 15 Minuten lang zu fixieren. Waschen Sie die Zellen erneut dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und fügen Sie 250 Mikroliter 0,1 Prozent Tritan x 100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung hinzu, um die Zellen zu permeablizieren und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren.Waschen Sie anschließend die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und fügen Sie den Zellen 400 Mikroliter Blockpuffer hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen dreißig Minuten lang bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Waschen Sie die Zellen nach dem Blockieren einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Verdünnen Sie dann fünf Mikroliter Phalloiden-Stammlösung in 200 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem Prozent Rinderserumalbumin, um die Färbelösung für jedes Deckglas herzustellen. Anschließend 200 Mikroliter der Färbelösung auf den Deckglas geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sobald die Inkubation beendet ist, waschen Sie die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Verwenden Sie dann die Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter Hooksed 3342 in 200 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um die DNA 30 Sekunden lang gegenzufärben. Fügen Sie nach dem Färben 400 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu, um den Deckbezug zweimal zu waschen. Heben Sie dann das Deckglas vorsichtig mit Hilfe einer Pinzette an und drehen Sie es auf der Oberseite eines Tropfens Antifading-Montagemedium auf einem Glasobjektträger um.Verwenden Sie ein Taschentuch, um überschüssige Medien vorsichtig zu entfernen, und versiegeln Sie dann die Umgebung mit Nagellack. Es sollte auch sehr darauf geachtet werden, dass die Zellen während der Mikroskopie nicht zu viel Farbstoff ausgesetzt werden, um ein Zellbleichen zu vermeiden. In einem 24-Well-Gewebekultureinsatz mit einer Pour-Größe von 0,4 Mikromolaren Endothelzellen säen.Lassen Sie die Zellen dann fünf Tage lang ungestört in der Kultur wachsen, um eine differenzierte Monoschicht zu bilden. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag. Sobald sich die Monoschicht gebildet hat, säen Sie 50 Mikrogramm in einem Milliliter extrazellulärer Vesikel in der oberen Kammer aus.Geben Sie dann 20 Milligramm pro Milliliter Rotomindextran in die obere Vertiefung und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid. Überwachen Sie die Migration des fluoreszierenden Dextrans zum Boden der Vertiefung, indem Sie die Fluoreszenzmission von 40 Mikrolitern Medium Avoquat messen. Programmieren Sie dann die Anregungswellenlänge bei 544 Nanometern und die Emissionswellenlänge bei 590 Nanometern für einen Multi-Label-Mikroplatten-Reader.Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen zu zählen. Anschließend werden die Endothelzellen in vollständigem Endothelkulturmedium erneut suspendiert und die Zellen in einer 96-Well-Platte in 100 Mikrolitern Endothelzellwachstumsmedium ausgesät. Um eine Konzentration von 0,1 bis zehn Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen, fügen Sie 100 Mikroliter antibiotisches Medium hinzu.Überwachen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen jeden zweiten Tag mit einem 20-fachen Objektiv unter dem Lichtmikroskop. Kultivieren Sie die Zellen für weitere 10 bis 14 Tage und ersetzen Sie das antibiotische Medium je nach Zellwachstum alle zwei bis drei Tage. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter MTS-Reagenz in jede Vertiefung und mischen Sie das Reagenz.Inkubieren Sie die 96-Well-Platte vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach vier Stunden die Platte auf einem Shaker kurz umrühren. Anschließend lesen Sie die Absorptionsmittel der behandelten und unbehandelten Zellen mit einem Plattenleser bei 490 Nanometern ab.Einen Tag vor der lentiviralen Transduktion säen Sie die Endothelzellen in einem Milliliter vollständigem Medium aus. Warten Sie, bis die Zellen eine Konfluenz von 50 bis 80 Prozent für die lentivirale Transduktion erreicht haben. Bevor Sie das Röhrchen öffnen, drehen Sie die lentivirale Suspension 30 Sekunden lang mit dem 200-fachen g, um ein Überlaufen zu vermeiden. Geben Sie dann Hexidimethrynbromid zu den Zellen, um eine Endkonzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter einzustellen, und schwenken Sie die Platte vorsichtig.Geben Sie das Lentivirus zu den Zellen und schwenken Sie die Platte erneut vorsichtig für 30 Sekunden, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Um die Effizienz der lentiviralen Transduktion zu erhöhen, zentrifugieren Sie das Zell-Virus-Gemisch bei 300-mal g für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Dann inkubieren Sie das Zell-Virus-Gemisch bei 37 Grad Celsius über Nacht.Entsorgen Sie am nächsten Tag das Viruspartikel, das Medium enthält, und ersetzen Sie es durch vorgewärmtes, frisches, vollständiges Kulturmedium. Beginnen Sie am zweiten Tag mit der Puromycin-Auswahl. Ersetzen Sie das komplette Kulturmedium durch puromycinhaltiges Medium.Ernten Sie nach der Puromycin-Selektion die Zellen. Isolieren Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers RNA aus den Zellen mit einem RNA-Isolationskit. Verwenden Sie ein reverses Transkriptionskit, um die komplementäre DNA mit den ausgewählten Mikro-RNAs zu isolieren.Richten Sie dann die quantitative PCR-Reaktion ein. Um die Internalisierung der extrazellulären Vesikel durch Endothelzellen zu überwachen, wurden PKH67-markierte grüne Vesikel mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. In dem Assay werden Faloudin und Hookst 33342, deren Färbungen in Rot bzw. Nuklidblau wirken, verwendet, um die Translokation der Vesikel innerhalb der Endothelzellen zu verfolgen.Konfokale Bilder zeigen eine bereitwillige Aufnahme der Vesikel durch die Endothelzellen nach vier Stunden. Als nächstes wurde zur Untersuchung der Permeabilität der Diffusionsfähigkeit der Endothelzell-Monoschicht von Rodamin b isothyosionadedextran analysiert. Dieser Assay zeigt, dass die Inkubation der Endothelzellen mit 50 und 100 Mikrogramm pro Milliliter extrazellulärer Vesikel die Permeabilität der endothelialen Monoschicht nach zwei Stunden erhöhte.In der Grafik stellt die x-Achse die Konzentration der extrazellulären Vesikel und die y-Achse die Faltenänderungen der endothelialen Permeabilität dar, die bei 590 Nanometern gemessen wird. Um die Empfindlichkeit der Endothelzellen unter Puromycin-Behandlung zu bestimmen, wurde anschließend eine Kill-Kurve erstellt. Die Abtötungskurve zeigt, dass bereits 0,15 Mikrogramm pro Milliliter Puromycin ausreichen, um alle Zellen abzutöten.Darüber hinaus wurde zur Bestimmung des Expressionsniveaus von micro-RNA451a, die aus den Endothelzellen isoliert wurde, eine quantitative Echtzeit-PCR durchgeführt. Die Balkendiagramme zeigen eine signifikante Überexpression des micro-RNA451a-Transkripts gegen das Haushälter-Gen U6. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten, um die Rolle von Evs bei der Wirtsinteraktion und der zellulären Kommunikation durch den Transfer von genetischem Material zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Aufnahme von EV durch Empfängerzellen visualisiert und wie man die Funktion kleiner einschließlich RNA bei der Regulation von Endothelzellen untersucht.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Malaria-Parasiten und menschlichem Blut extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, einem Laborkittel und das Arbeiten unter einer sterilen Haube bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir zeigen das Verfahren für die Durchführung Intravitalmikroskopie der Milz mit GFP transgenen Malaria-Parasiten und die Quantifizierung der Parasiten Mobilität und die Durchblutung in diesem Organ.

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Diese Methode untersucht die Blutplättchen-vermittelten Verklumpung...

Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infizierten Erythrozyten in einer Ressource Schlechte Einstellung

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Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

Mess Antikörper Funktion ist der Schlüssel zum Verständnis Immunität gegen Plasmodium falciparum Malaria. Diese Methode beschreibt die Reinigung von lebensfähigen Merozoiten und Messung der Opsonisierung-abhängigen Phagozytose mittels Durchflusszytometrie.

High Yield Reinigung von<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Die Malaria-Parasiten dringt und Wiederholungen in den roten Blutkörperchen. Die genaue Beurteilung der Merozoiten Invasion und Parasitämie ist daher entscheidend für die Beurteilung der Verlauf der Malaria-Infektion. Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie basiertes Protokoll für die Messung dieser Parameter in einem Maus-Modell der Malaria.

In-vivo-Bewertung der Nager Plasmodium Parasitämie und Merozoite Invasion durch Durchflusszytometrie

Koinfektion beim Menschen ist in vitro schwer zu replizieren. Humane Malariaparasiten können jedoch problemlos in vitro kultiviert werden, ebenso wie frisch isolierte mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut, die auf natürliche Weise mit HIV infiziert sind. Dies stellt ein hervorragendes Modell dar, um frühe Immunantworten auf Malariaparasiten im Rahmen einer HIV-Koinfektion zu untersuchen.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Humane microRNAs translozieren von Wirts-Erythrozyten zu Plasmodium falciparum-Parasiten. Im Folgenden werden die Techniken beschrieben, mit denen synthetische microRNAs in Erythrozyten des Wirts transfiziert und alle RNAs aus P. falciparum isoliert werden.  Darüber hinaus wird in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung von Polysomen in P. falciparum beschrieben, um die ribosomale Belegung und das translationale Potenzial von Parasitentranskripten zu bestimmen.

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Isolierung myeloischer Zellen aus der Maushaut und der Drainage von Lymphknoten nach intradermaler  Injektion von Plasmodium-Sporozoiten. Die Durchflusszytometrie der gesammelten Zellen bietet einen zuverlässigen Assay zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion der Haut und der Drainage von Lymphknoten auf den Parasiten.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Anweisungen zu geben, wie die Kapazität von Antikörpern gemessen werden kann, die in Seren oder Plasma von Individuen vorhanden sind, die natürlich einer Plasmodium falciparum-Infektion ausgesetzt sind, um die Phagozytose der parasiteninfizierten Erythrozyten (IEs) zu opsonisieren und zu induzieren.

Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay

Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.

In vitro Untersuchung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten

Erfahren Sie, wie extrazelluläre Vesikel bei Malaria-Infektionen isoliert und visualisiert werden, um die Interaktion mit Endothelzellen zu untersuchen. Diese Methode liefert Einblicke in die Parasit-Wirt-Kommunikation.

Auswertung der extrazellulären Vesikel Funktion im Malaria-Infektion

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