Name: Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Lernen Sie die Optimierung der Einbeziehung nicht-kanonischer Aminosäuren in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und bioorthogonale Chemie in lebenden Säugerzellen. Diese Methode ermöglicht die Kartierung von Ligandenbindungsstellen.

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Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) unter Stipendien CO822/2-1 (Emmy-Noether-Programm) und CO822/3-1 bis I.C gegründet

Die Autoren haben keine Konflikte zu erklären.

Das Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Assays zur Bewertung der Effizienz der orthogonalen Paare für die Einbindung der NcAAs in Proteine in Säugetierzellen. Der Hauptvorteil dieser Methode in Bezug auf weit verbreiteten Tests basierend auf FACS ist, dass es die gleichzeitige Zubereitung und Messung einer größeren Anzahl von Proben ermöglicht und liefert Daten, die leicht mit einem normalen Software analysiert werden. Die Verfügbarkeit einer Medium-Durchsatz-Methode zur orthogonalen Paare in Säugetierzel...

Die genetische Einbeziehung der chemischen Sonden in Proteinen ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der strukturellen und dynamischen Aspekte der Proteinfunktion direkt im heimischen Kontext der live Zelle zu erleichtern. Heute können Hunderte von nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs), ausgestattet mit den verschiedensten chemischen Gruppen ortspezifisch Proteine durch Biosynthese1,2,3,4integriert werden. Dazwischen findet man lichtempfindliche NcAAs wie Foto-Vernetzer5, Foto-Käfig6,7,8,9 und Foto-schaltbare Aminosäuren10, 11, Aminosäuren mit angespannten Alkenen und Alkinen für Katalysator-freie Bioorthogonal Chemie2,12,13,14,15,16 ,17, Aminosäuren tragen Dansyl18, Cumarin9,19und21 Fluorophore prodan20,und Aminosäuren ausgestattet mit anderen biophysikalischen Sonden als sowie mit den Post translationale Modifikationen1,2,3,4,22,23,24,25.
Die genetische Codierung eine ncAA wird ermöglicht durch eine dedizierte amino-Acyl-tRNA-synthestase (AARS) gekoppelt an ein cognate Suppressor-tRNA, die der ncAA in Reaktion auf eine bernsteinfarbene Stopcodon während der regelmäßige ribosomale Synthese enthält. NcAARS/tRNA-Paare sind so konstruiert, um im Wirtsorganismus, d. h. nicht mit den endogenen paar Übersprechen orthogonal sein. Die Technik ist gut etabliert, sowohl in prokaryotischen und eukaryotischen Gastgeber und leicht anwendbare, Säugetier-Zellen. Paare zum ncAA Einbau in Säugerzellen basieren auf drei orthogonalen Hauptsysteme: das Tyrosyl-System, das die TyrRS von E. Coli26 mit einem Tyrosyl Bernstein-Schalldämpfer von B. Stearothermophilus27 (EG kombiniert TyrRS /BstYam Paar), die E. Coli Leucyl System (EGLeuRS/tRNALeuCUA Paar)6,18,28 und die Archaeen Pyrrolysyl-System (PylRS/tRNA Pyl Paar)3, wobei die tRNAPyl ist ein natürlicher Bernstein Suppressor. Im Allgemeinen ist eine spezialisierte NcAARS jedes ncAA anerkannt. Abhängig von der Struktur der ncAA erhält man die NcAARS durch gerichtete Evolution von TyrRS, LeuRS oder PylRS, obwohl einige synthetasen mehrere ncAA akzeptieren können.
Das orthogonale Paar wird in die Zellen importiert, indem Sie einfach ein Plasmid-Vektor. Am meisten common und effiziente Plasmide sind Bicistronic und sowohl für die synthestase und die tRNA bilden die orthogonale Paar29zu kodieren. Eine zweite Plasmid-Codierung für das Protein des Interesses trägt eine gelbe Codon am Standort für die Änderung ist Co transfizierten. Die ncAA ist einfach das Wachstumsmedium Zelle hinzugefügt. Jedoch verwenden verschiedene Fachgruppen oft verschiedene Varianten von Plasmid Konstrukte auch für die Aufnahme der gleichen ncAA. Konstrukte unterscheiden sich in der Anordnung der Gene in den Vektor, der synthestase, Codon Usage synthestase gen, Projektträger Nutzung, Variante der tRNA und Anzahl der tRNA Expressionskassetten. Darüber hinaus kann die Einbeziehung Effizienz der verschiedenen NcAAs drastisch aufgrund der verschiedenen katalytische Effizienz der verschiedenen synthetasen, die Qualität der tRNA und anderen Faktoren30variieren. Daher ist es wichtig, eine schnelle und zuverlässige Methode zur Bewertung der Effizienz eines orthogonalen Pairs, die am besten geeignete System für eine gewünschte Anwendung auswählen und einige Optimierungsschritte durchführen, die Verbesserung der Gesamt-Protein-Expression zur hand zu haben Renditen.
Wir haben eine einfache und robuste Fluoreszenz basierende Assays zur Bewertung der Effizienz der orthogonalen Paare29 (Abbildung 1) etabliert. Zellen sind in der Probe Co transfected mit der Plasmid-Codierung für das orthogonale Paar, zusammen mit einem Bicistronic Reporter Plasmid Codierung sowohl für das grün fluoreszierende Protein trägt eine gelbe Stopcodon an einer freizügigen Position (EGFP-TAG) und die mCherry gen. Rote und grüne Fluoreszenz der gesamten Zelle Lysates werden in getrennten Kanälen auf einem Teller-Leser in einer 96-Well-Platte gelesen. Die Intensität der grünen Fluoreszenz korreliert direkt mit der Effizienz der Bernstein Unterdrückung, während die Intensität der rote Fluoreszenz eine direkte Schätzung der Größe der gemessenen Probe und die Transfektion Effizienz gibt. In Bezug auf ähnliche Tests basierend auf Fluoreszenz assistierten Zelle Sortieren (FACS) ausgelesen31,32, Assays gibt eine sofortige und umfassende Bewertung der Proteinexpression in der gesamten Zellpopulation, die mehr Vertreter der üblichen experimentellen Bedingungen, und bietet eine einfachere Datenerfassung und Verarbeitung mit standard-Software. Insgesamt ist der Hauptvorteil des Tests, dass ein Medium, um eine große Anzahl von Proben parallel analysiert werden kann. Mit Hilfe dieses Tests, haben wir eine rational konzipierte Bibliothek von Suppressor-tRNAs zur Verbesserung der Effizienz der Pyl orthogonalen System30gezeigt. Diese Arbeit beschreibt das experimentelle Protokoll zum Durchführen dieser Assay und zeigen Beispiele für seine Anwendung, einschließlich der Optimierung des orthogonalen Paares für die Einbeziehung von der Foto-Vernetzung ncAA p-Azido-L-Phenylalanin (Azi) und den Vergleich der Einbindung Wirkungsgrade verschiedener Aminosäuren (Abbildung 2).
In den letzten Jahren ncAA Werkzeuge sind sehr mächtig, um strukturelle Untersuchung nachgewiesen worden und funktionalen Aspekte des G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. beim Menschen GPCRs bilden eine große Familie von Membranrezeptoren (800 Mitglieder) und Hauptziele für therapeutische Drogen darstellen. Direkte strukturelle Charakterisierung von GPCRs ist immer noch anspruchsvoll und ergänzende biochemische Methoden sind hoch für ihre Untersuchung erforderlich. Wir sind Pionier im Einsatz von Foto-Vernetzung NcAAs GPCR Oberflächen abbilden und Ligand verbindliche Taschen34zu entdecken. Mit unserem optimierten System Azi Aufnahme haben wir systematisch Azi in der ganzen Juxtamembrane Domäne von GPCR direkt in lebenden Säugetier-Zellen aufgenommen. Bei UV-Bestrahlung bildet Azi eine hochreaktive Nitrene Spezies, die benachbarten Moleküle kovalent erfasst. Wenn die Liganden zum System hinzugefügt wird, dient Azi als ein Näherungssensor zu offenbaren, welche Positionen des Rezeptors in der Nähe der gebundenen Liganden kommen. Auf diese Weise wurde der Bindungsmodus des Hormons Neuropeptid Urocortin ich (Ucn1) auf die Klasse B GPCR Corticotropin-freigeben-Faktor-Rezeptor Typ 1 (CRF1R)33 erstmals vorgestellt. In letzter Zeit, haben wir unterschiedliche verbindliche Muster von Agonisten und Antagonisten auf die gleichen Rezeptor38offengelegt. Ein ähnlicher Ansatz wurde von anderen Orthosteric und allosterische Bindungsstellen anderer Peptide und niedermolekularen Liganden auf andere GPCRs39,40,41,42offenbaren angewendet. Dieses Manuskript beschreibt das experimentelle Protokoll in unserem Labor für Foto-Vernetzung Zuordnung von GPCR Oberflächen angewendet. Die Methode ist relativ schnell, unkompliziert und erfordert keine spezielle Ausrüstung, so dass es im standard Biochemie Labor anwendbar ist. Wichtig ist, der Ansatz bietet ein wertvolles Instrument, nicht nur um Ligand verbindliche Aufstellungsorte zu identifizieren, wo 3D Strukturdaten sind knapp, sondern auch zur Ergänzung der vorhandenen in-vitro- Daten mit Informationen aus voll posttranslational modifizierte Rezeptoren in der physiologische Umgebung der Zelle Leben.
Die jüngste Entwicklung von neuartigen NcAAs Lager auf der Seite Kette chemischen Gruppen geeignet für ultraschnelle Katalysator-freie Bioorthogonal-Chemie hat eröffnet die Möglichkeit, letzte Generation Fluorophore für super-Resolution Imaging in Proteine zu installieren direkt auf die Zellen2,43. Diese chemische Dübel sind gespannte Cyclooctyne in SCOK14, Bicyclo [6.1.0] Nonyne BCNK12,17und Trans-Cyclooctenes TCO * K13,15,17 unter anderen NcAAs beherbergen eine Norbornen16,17,44 oder Cyclopropen45,46 Glyko-. Sperrige NcAAs für Bioorthogonal Chemie fließen durch eine Variante des PylRS, die in der Regel als PylRSAF bezeichnet (Angabe Mutation Y271A und Y349F in M. Barkeri PylRS), sowie durch andere ad-hoc- entwickelt NcAARSs17 , 44. Bioorthogonal Anker mit kurz Reagenzien47 über inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder Cycloaddition Kennzeichnung ertragreich innerhalb von wenigen Minuten43,48zu reagieren. Anwendung dieses leistungsstarken Konzepts Label GPCRs hat jedoch durch einen niedrigen Gesamtwirkungsgrad des orthogonalen ncAA Einbeziehung Systems streitig gemacht. Mit unserem erweiterten Pyl-System haben wir vor kurzem hochverzinsliche Berücksichtigung solcher Aminosäuren GPCRs und ultraschnelle GPCR Kennzeichnung auf der Oberfläche des lebenden Säugetier-Zellen30gezeigt. Beschriftete Rezeptoren waren noch funktionsfähig, da sie physiologisch, beim Aktivieren des Agonist-Rezeptors verinnerlicht. Das experimentelle Protokoll für die Einbeziehung von Bioorthogonal in GPCRs Anker und die folgende Kennzeichnung Schritte werden hier beschrieben. GPCRs mit kleinen hellen Fluorophore auszustatten, ist der erste grundlegende Schritt zur Studie von GPCR Strukturdynamik in der live-Zelle über erweiterte mikroskopiertechniken.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acryamide/Bisacrylamid 30% (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>p-Azidophenylalanin (Azi)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbobenzyloxy-L-lysin (Lys(Z))</td><td>NovaBiochem</td><td>8540430100</td><td></td></tr><tr><td>Cyclooctin-L-lysin (SCOK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz (ECL) mit erhöhter Chemilumineszenz</td><td>hausgemachtes</td><td></td><td>10 mg/l Luminol in 0,1 M Tris-HCl pH 8,6 ; 1100 mg/l&nbsp; p-Cumarsäure in DMSO ; 30&nbsp;% H2O2 (1.000 : 100 : 0,3)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.1</td><td></td></tr><tr><td>Endo-Bicyclo[6.1.0]nonyn-L-lysin (BCNK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8014</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher ( Gibco)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Carl Roth</td><td>7533.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Carl Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Applichem</td><td>A2185,0005</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth</td><td>0082,3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189,2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Lactat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>121551000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>p-Cumarsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008-1G</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11548876 (15140-122)</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>NEB</td><td>P0704L</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Membran Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Magermilchpulver&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazin-Cy3</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-014-05</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>trans-Cycloocten-L-lysin (TCO*K)</td><td>Sichem</td><td>SC-8008</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 2.5%</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30%)</td><td>Merck</td><td>1.07210.0250</td><td></td></tr><tr><td>Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 Zellen</td><td>Deutsch Kollektion von Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-305</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-635<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td><td>Bio-Budget Technologies GmbH</td><td>40-BLX-E365</td><td>5 x 8 Watt</td></tr><tr><td>Röhren Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&nbsp;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid E2AziRS</td><td>Das huminisierte Gen für E2AziRS wurde von Geneart (Life Technologies)Plasmid synthetisiert,</td><td></td> <td>das 4 Tandemkopien der Suppressor-tRNA Bst-Yam, die vom humanen U6-Promotor angetrieben wird, und eine Kopie eines humanisierten Gens für die verstärkte Variante der Azi-tRNA-Synthetase (EAziRS), die von einem PGK-Promotor</td></tr> <tr><td>angetrieben wird, enthält.POI-TAG-mutierte Plasmide Plasmide</td><td></td><td></td><td>, die für den POI kodieren, der vom CMV-Promotor gesteuert wird, C-terminal mit dem FLAG-Tag fusioniert ist und an der gewünschten Position ein TAG-Codon trägt&nbsp;</td></tr><tr><td>CRF1R-95TAG-EGFP</td><td></td><td></td><td>kloniert in der MCS von pcDNA3.1</td></tr><tr><td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td><td></td><td></td><td>Kloniert in der MCS von pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Arrestin3-FLAG</td>, <td>synthetisiert von Genart (Life Technologies)</td><td></td><td>Kloniert in der MCS von pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Antikörpern</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG-HRP M2 Antikörperkonjugat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592&nbsp;</td><td>monoklonal, hergestellt im Mausklon M2</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-CRF-Antikörper</td><td>hausgemachter</td><td>PBL #rC69</td><td>polyklonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., und Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr><tr><td>Kaninchen-anti-Ucn1-Antikörper</td><td>hausgemacht</td><td>PBL #5779</td><td>polyklonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., und Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr></tbody></table>

optimierung der genetischen einbeziehung der chemischen sonden in gpcrs für foto-vernetzung-mapping und bioorthogonal chemie in live säugerzellen

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

Die genetische Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) über Bernstein Stopp-Codon Unterdrückung ist eine leistungsstarke Technik, künstliche Sonden und reaktive Moieties auf Proteine direkt in der live Zelle zu installieren. Jede ncAA ist durch eine spezielle orthogonale Suppressor-tRNA/amino-Acyl-tRNA-synthestase (AARS) Paar aufgenommen, die in den Wirtsorganismus importiert wird. Die Einbeziehung Effizienz der verschiedenen NcAAs kann stark unterschiedlich und in einigen Fällen unbefriedigend sein. Orthogonale Paare können verbessert werden durch die Manipulation der AARS oder der tRNA. Gerichtete Evolution von tRNA oder AARS mit großen Bibliotheken und tot/lebendig Auswahlmethoden sind jedoch nicht machbar in Säugetierzellen. Hier ist eine einfache und robuste Fluoreszenz basierende Assays, die Effizienz der orthogonalen Paare in Säugetierzellen zu bewerten präsentiert. Der Test ermöglicht screening Dutzende bis Hunderte von AARS/tRNA-Varianten mit mäßigem Aufwand und innerhalb eines angemessenen Zeitraums. Verwendung des Assays neue tRNAs generieren, die deutlich die Effizienz der Pyrrolysin orthogonalen System beschrieben ist, zusammen mit der Anwendung von NcAAs zur Erforschung der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die Objekte eine für ncAA Herausforderung sind Mutagenese. Erstens werden durch die systematische Integration eine Foto-Vernetzung ncAA in der extrazellulären Oberfläche eines Rezeptors, Bindungsstellen der verschiedenen Liganden auf den intakten Rezeptor direkt in der live Zelle zugeordnet. Zweite, durch den Einbau von NcAAs der letzten Generation in einem GPCR, ultraschnelle Katalysator-freie Rezeptor Kennzeichnung mit einem fluoreszierenden Farbstoff ist gezeigt hat, nutzt die Bioorthogonal Belastung gefördert inverse Diels Alder Cycloaddition (SPIEDAC) auf die live-Zelle. Wie NcAAs in der Regel auf jedem Protein unabhängig von dessen Größe angewendet werden kann, ist die Methode von allgemeinem Interesse für eine Reihe von Anwendungen. Darüber hinaus ncAA Einarbeitung erfordert keine spezielle Ausrüstung und erfolgt im standard Biochemie Labor.

Die Umrisse der Fluoreszenz-Test ist in Abbildung 1dargestellt. Der Test ist in drei Anwendungen eingesetzt. An erster Stelle werden eine Reihe von tRNA-Varianten für den Einbau des Lys(Boc) durch die Pyl orthogonal paar gezeigt. Lys(BOC) ist eine Aminosäure Pyl sterisch ähnlich. Pyl nicht kommerziell verfügbar ist, wird Lys(Boc) häufig als standard Substrat für die PylRS verwendet. Die abgeschirmten tRNAs basieren auf der tRNAPyl. Jede tRNA-Varian...

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Einbaurate von nicht-kanonischen Aminosäuren in Säugetierzellen zu verbessern, um biologische Fragestellungen in lebenden Zellen zu lösen, einschließlich der Kartierung von Protein-Protein-Interaktionsoberflächen und der bioorthogonalen Markierung von Oberflächenrezeptoren. Mit Hilfe der bernsteinfarbenen Codon-Suppression werden verschiedene nicht-kanonische Aminosäuren mit unterschiedlicher Effizienz eingebaut. Wir haben einen Fluoreszenz-Assay etabliert, um die Inkorporationsraten nicht-kanonischer Aminosäuren in Säugetierzellen innerhalb kurzer Zeit einfach vergleichen zu können.Der systematische Einbau von photovernetzenden, nicht-kanonischen Aminosäuren durch unsere GPCR-Oberflächen ermöglicht die Kartierung von Ligandenbindungsstellen und liefert wertvolle Informationen über den Aufnahmerezeptor direkt aus der lebenden Zelle. Durch die Integration von nicht-kanonischen Aminosäuren der letzten Generation für die bioorthogonale Chemie erreichen wir eine ortsspezifische, superschnelle, katalysatorfreie Markierung von GPCRs mit kleinen, hellen Fluorophoren für High-End-Bildgebungsanwendungen in lebenden Säugetierzellen. Zuerst werden 600.000 HEK 293-Zellen in zwei Millilitern vollständigem Wachstumsmedium pro Vertiefung in zwei Sechs-Well-Platten gesät.Bereiten Sie so viele Wells vor, wie die Anzahl der Proben und zwei zusätzliche Wells für den Wildtyp-EGFP bzw. eine Mock-transfizierte Probe vor. Eine Stunde vor der Transfektion die entsprechende Menge frisch zubereiteter nicht-kanonischer Aminosäure-Stammlösung in alle Vertiefungen geben, um eine endgültige Aminosäurekonzentration von 0,25 bis 0,5 Millimolar zu erreichen. Um die Zellen zu transfizieren, mischen Sie ein Mikrogramm Plasmid-DNA und die Kodierung für das zu testende Synthetase-t-RNA-Paar mit einem Mikrogramm Reporterplasmid-DNA in einem Mikrozentrifugenröhrchen.Bereiten Sie in getrennten Röhrchen eine identische Transfektion unter Verwendung der EGFP-Wildtyp-Referenz und einer Scheintransfektion vor. Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter laktatgepufferte Kochsalzlösung in jedes Röhrchen, das die DNA enthält. Nach kurzem Mischen sechs Mikroliter von einem Mikrogramm pro Mikroliter PEI und laktatgepufferte Kochsalzlösung in jedes Röhrchen geben.Sofort vortexen und dann 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie 400 Mikroliter Zellmedium aus jeder Vertiefung in die DNA-PEI-Mischung, um den pH-Wert zu neutralisieren. Tröpfeln Sie dann die DNA-Mischung auf die Zellen.Ernten Sie die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion, indem Sie das Medium aspirieren und die Zellen einmal mit zwei Millilitern vorgewärmtem PBS spülen. Fügen Sie 800 Mikroliter PBS hinzu, ergänzt mit 0,5 Millimolar EDTA, und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation lösen und suspendieren Sie die Zellen, indem Sie auf und ab pipettieren.Übertragen Sie anschließend die Zellsuspension in Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern PBS, die mit fünf Millimolar Magnesiumchlorid ergänzt sind. Zentrifugieren Sie die Proben zwei Minuten lang bei 800-facher Schwerkraft. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand.Geben Sie nun 100 Mikroliter Tris-Lysepuffer zu den Zellpellets und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis. Um die Lyse zu erleichtern, alle fünf Minuten vortexen. Schleudern Sie die Zelltrümmer 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 14.000-facher Schwerkraft herunter.90 Mikroliter des Überstands werden in schwarze 96-Well-Platten überführt. Messen Sie dann die EGFP- und mCherry-Fluoreszenz mit einem Platten-Reader, der mit dem Fluoreszenzmodul ausgestattet ist. 500.000 293 T-Zellen in zwei Millilitern vollständigem Wachstumsmedium pro Well in zwei Sechs-Well-Platten säen.Bereiten Sie für jede zu screenende Position eine Vertiefung pro Liganden sowie eine Vertiefung für die Bindungskontrolle vor. Eine Stunde vor der Transfektion geben Sie den Photovernetzer p-Azidophenylalanin oder Azi in alle Vertiefungen bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Millimolar. Transfizieren Sie eine Gesamtmenge von zwei Mikrogramm DNA pro Vertiefung unter Verwendung eines Mikrogramms Plasmids und kodieren für das mit GPCR markierte Flag, das ein Tag-Codon an der gewünschten Position trägt, und ein Mikrogramm des Plasmids und kodieren für das orthogonale Paar, das Azi gewidmet ist.48 Stunden nach der Transfektion stellen Sie eine 1.000-fache Ligandenstammlösung her, indem Sie den Peptidliganden in einer Konzentration von 100 Mikromolar in DMSO auflösen. Verdünnen Sie die Ligandenstammlösung um eins bis 1.000 in Bindungspuffer. Ersetzen Sie das Zellmedium durch einen Milliliter der Ligandenlösung und inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.Bestrahlen Sie die Zellen nach der Inkubation 20 Minuten lang in einem UV-Vernetzer in einem Abstand von 365 Nanometern und fünf Zentimetern zu den Zellen. Wenn Sie fertig sind, lösen Sie die Zellen durch Pipettieren und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 800-facher Schwerkraft.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellpellets in 50 Mikrolitern HEPES-Dissoziationspuffer (HDB), der einen Cocktail aus Proteaseinhibitoren enthält. Dann frieren Sie die Zellen in flüssigem Stickstoff schockfrosten. Anschließend tauen Sie die Zellen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Sekunden auf und wirbeln Sie sie anschließend kurz auf.Pelletieren Sie die Membranen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 2500-facher Schwerkraft. Wenn Sie fertig sind, verwerfen Sie den Überstand, der den Großteil der zytosolischen Proteine enthält. Resuspendieren Sie die Pellets gründlich in 50 Mikrolitern HEPES-Lysepuffer mit einer Pipette.Dann lysieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis und wirbeln sie alle fünf Minuten. Anschließend wird der Zelltrümmer 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 14.000-facher Schwerkraft nach unten geschleudert. Jeder Überstand wird sofort in ein frisches Reaktionsröhrchen für die Western-Blot-Analyse überführt.Wenn der GPCR glykosyliert ist und schwache oder verschmierte Banden ein Problem bei der Western-Blot-Analyse darstellen, deglykosylieren Sie die Proben mit PNGase F, um die Signalintensität zu erhöhen und die Banden zu schärfen. Lösen Sie dann die Proben auf einer Standard-SDS-Seite auf und bloten Sie die Transferproteine auf eine PVDF-Membran ab. Nachdem Sie die Membran blockiert haben, untersuchen Sie sie mit einem Anti-Liganden-Antikörper, um das Auftreten von Vernetzung zu erkennen.Um das Expressionsniveau des Azi-GPCR nachzuweisen, untersuchen Sie die Membran mit einem kommerziellen Anti-Flag-Antikörper. Weichen Sie die Membran nach dem Waschen in verbesserter Chemilumineszenzlösung ein und visualisieren Sie die Signale im Dunkeln. 100.000 HEK 293 t-Zellen in 600 Mikrolitern farbstofffreiem, vollständigem DMEM pro Vertiefung eines Mikroskopieobjektträgers, der mit vier Vertiefungen ausgestattet ist, säen.Eine Stunde vor der Transfektion eine frische 100 millimolare Stammlösung aus TCOK und 0,2 molar Natriumhydroxid und 15 % DMSO herstellen. Mischen Sie drei Mikroliter der TCOK-Stammlösung mit 12 Mikrolitern eines molaren HEPES-Puffers mit einem pH-Wert von 7,4. Geben Sie die Lösung vorsichtig in jede Vertiefung, bis eine TCOK-Endkonzentration von 0,5 Millimolar erreicht wird.In einem Mikrozentrifugenröhrchen verdünnen wir 200 Nanogramm des Plasmids, das für den Rezeptor kodiert, der das bernsteinfarbene Codon enthält, und 200 Nanogramm des Plasmids, das für das orthogonale Paar kodiert ist, in 50 Mikrolitern Medium. Verdünnen Sie 1,25 Mikroliter Lipofectamin 2.000 in 50 Mikrolitern farbstoff-, serum- und antibiotikafreiem Medium und geben Sie die Lösung zur DNA-Lösung. Sofort vortexen und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Fügen Sie dann die DNA-Lipidkomplexe zu den Zellen hinzu. 24 Stunden nach der Transfektion werden 100 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen überführt. Fügen Sie 1,8 Mikroliter einer orange fluoreszierenden Farbstoff-Tetrazin-Stammlösung und 0,3 Mikroliter einer DNA-Färbestoff-Stammlösung hinzu.Das Medium mit den Farbstoffen wird zurück in die Vertiefung gegeben und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Saugen Sie das Medium an und spülen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS aus, um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Geben Sie dann 600 Mikroliter vorgewärmtes, vollständig farbstofffreies Wachstumsmedium in die Zellen.Visualisieren Sie nun die markierten Rezeptoren unter 63-facher Vergrößerung mit Filtern, die für GFP-Orangefluoreszenzfarbstoff und DNA-Färbefarbstoff geeignet sind. Nach Zugabe von Peptidagonisten-Stammlösung zu den Zellen ist die Internalisierung unter dem Mikroskop mit den oben genannten Filtern zu beobachten und Bilder nach dem deutlich nachweisbaren Auftreten der Internalisierung zu machen. Unterschiedliche tRNAs führen zu einer unterschiedlichen Suppressionseffizienz, die sich deutlich in der Menge der gemessenen Fluoreszenz widerspiegelt.Der Einbau von Azi in CRF1R war bei Verwendung des Codon-optimierten Azi-tRNA-Synthetase-Gens im Vergleich zum nativen Gen stark verbessert, was zeigt, dass selbst eine moderate Verbesserung für ein lösliches Protein einen größeren Einfluss auf das Expressionsniveau anspruchsvollerer Membranproteine haben kann. Das für den Azi-Einbau optimierte System, einschließlich des humanisierten E2 Azi RS-Gens, wurde eingesetzt, um die Bindungstasche des CRF1R zu kartieren und Bindungswege von fünf Liganden zu finden. Eine Bande in der richtigen Größe des Vernetzungsprodukts im Western Blot zeigt, dass die Position in der Nähe des Liganden innerhalb des Ligandenrezeptorkomplexes liegt.Mehrfache Vernetzungstreffer mit allen getesteten Liganden zeigten unterschiedliche Bindungsmuster für die Peptid-Agonisten und -Antagonisten. Sowohl Fluoreszenz- als auch Western-Blot-Daten deuten darauf hin, dass TCOK die nicht-kanonischen Aminosäuren für die bioorthogonale Chemie sind, die mit der höchsten Effizienz der AF-Variante der Paralysin-tRNA-Synthetase eingebaut werden. TCOK wurde in ein CRF1R EGFP-Fusionsprotein eingebaut und ermöglichte die Installation eines kleinen, hellen Fluorophors auf dem Rezeptor.Nach Zugabe eines Peptids Agaonist wurden fluoreszierende Kompartimente im gesamten Zytosol beobachtet, was den physiologischen Prozess der GPCR-Internalisierung aufzeigt. Um einen Fluoreszenz-Assay durchzuführen, haben wir hier ein einfaches und effektives Werkzeug vorgestellt, um die Effizienz einer Synthetase, TI und API in Säugetierzellen zu bewerten und zu optimieren. Hohe Inkorporationsraten sind entscheidend für die Anwendung nicht-kanonischer Aminosäuren zur Untersuchung anspruchsvoller biologischer Fragestellungen.Der hocheffiziente Einbau von vernetzenden nicht-kanonischen Aminosäuren ermöglicht eine umfassende Oberflächenkartierung praktisch aller Proteine, einschließlich Membranrezeptoren oder niedrigbandiger Proteine. Die Methode enthüllt die Topologie von Interaktionsgrenzflächen, die weiter analysiert werden können, um genaue molekulare Modelle zu erhalten. Die hohe Inkorporationseffizienz von nicht-kanonischen Aminosäuren der letzten Generation für die bioorthogonale Chemie ermöglicht es uns, GPCRs mit kleinen, hellen Fluorophoren auszustatten und damit den Weg für die Untersuchung der strukturellen Dynamik von GPCRs in lebenden Zellen mit Hilfe fortschrittlicher Mikroskopietechniken zu ebnen.

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Research

Forschung

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Chemistry

Chemie

Durch den Einsatz einer spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-System sind auf Pixel-Ebene Karten von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Wirkungsgrade für Zellen, die Membran-Rezeptoren angenommen, dass sie homo-oligomeren Komplexen Form erhalten. Von der Effizienz Karten FRET, sind wir in der Lage, stöchiometrische Informationen über die Oligomer-Komplex unter-Studie zu schätzen.

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu analysieren von Zelle zu Zelle Übertragung der oszillierenden Informationen durch optogenetische Kontrolle und Überwachung der Genexpression zu leben. Dieser Ansatz bietet eine einzigartige Plattform, um eine funktionale Bedeutung der dynamischen Ausdruck Genprogramme in mehrzelligen Systeme zu testen.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

GPCR----Arrestin-Wechselwirkungen sind ein aufstrebendes Feld in GPCR-Medikamentenentdeckung. Genaue, präzise und einfach einzurichtende Methoden sind notwendig, um solche Wechselwirkungen in lebenden Systemen zu überwachen. Wir zeigen einen strukturellen Komplementierungstest zur Überwachung der GPCR----Arrestin-Interaktionen in Echtzeit lebenden Zellen und können auf jede GPCR erweitert werden.

Überwachung von GPCR---Arrestin1/2-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen zur Beschleunigung der Arzneimittelentdeckung

Die kinetische Vernetzung und Analyse von cDNA ist eine Methode, die es ermöglicht, die Dynamik von Protein-RNA-Interaktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Hier wird das Protokoll detailliert beschrieben, einschließlich des Wachstums von Hefezellen, der UV-Vernetzung, der Ernte, der Proteinreinigung und der Vorbereitungsschritte der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek.

Überwachung der Protein-RNA-Interaktionsdynamik in vivo mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von χCRAC

Die zuverlässige Kontrolle lichtempfindlicher Säugetierzellen erfordert die Standardisierung optogenetischer Methoden. Um dieses Ziel zu erreichen, skizziert diese Studie eine Pipeline von Genschaltkreiskonstruktion, Zelltechnik, optogenetischem Gerätebetrieb und Verifikationsassays, um die Untersuchung der lichtinduzierten Genexpression unter Verwendung eines optogenetischen Genschaltkreises mit negativer Rückkopplung als Fallstudie zu standardisieren.

Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll und einen Datenanalyse-Workflow zur Durchführung der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET), um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

Dieser Artikel bietet ein einfaches und klares Protokoll zur ortsspezifischen Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mittels genetischer Code-Expansion (GCE) und zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie...

Super-Resolution-Bildgebung von bakteriell sezernierten Proteinen mittels genetischer Code-Expansion

Dieses Protokoll beinhaltet die Transfektion von cAMP-Sensoren und bPAC-nLuc, einem optogenetischen Protein, um seine zelluläre Verteilung und Reaktion auf Lichtstimulation genau zu verfolgen. Der innovative Ansatz, eine cAMP-Antwortkarte mit Hilfe eines Punktscansystems zu erstellen, birgt das Potenzial, die Forschung mit optogenetischen Proteinen in verschiedenen Bereichen voranzutreiben.

Kartierung der zellulären Verteilung eines optogenetischen Proteins mit Hilfe eines Lichtstimulationsgitters

Diese Arbeit beschreibt eine Methode für Hochdurchsatz-Experimente mit einem 3D-gedruckten LED-Array, um die lichtinduzierbare Genexpression in HEK293T Zellen zu optimieren.

Schnelle Optimierung eines lichtinduzierbaren Systems zur Kontrolle der Genexpression von Säugetieren

Lernen Sie die Optimierung der Einbeziehung nicht-kanonischer Aminosäuren in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und bioorthogonale Chemie in lebenden Säugerzellen. Diese Methode ermöglicht die Kartierung von Ligandenbindungsstellen.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen (Video) | JoVE Journal

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

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