Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Proteinkristallisation zu beantworten, wie z.B. den Zeitpunkt der Keimbildung, den Mechanismus des Kristallwachstums oder die Herstellung von Nano-/Mikrokristallen, wie sie vom Hamburg Center for Ultrafast Imaging untersucht wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Überwachung der Probenentwicklung in Echtzeit, die die Erfassung wertvoller Informationen ermöglicht, wie z. B. die radiale Verteilung von Partikeln in Lösung in verschiedenen Kristallisationsstadien. Obwohl diese Methode Einblicke in die Mikrokristallisation von Proteinen geben kann, kann sie auch für Proteine verwendet werden, die für die klassische Kristallographie verwendet werden, oder für das Wachstum großer Proteinkristalle, die für die Neutronenbeugung verwendet werden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da sie das Funktionsprinzip eines einzigartigen Kristallisationsgeräts zeigt. Filtrieren Sie zunächst 16 Milliliter 1,2 molare Natriumtartratlösung und 16 Milliliter destilliertes Wasser mit einem sterilen 2-Mikron-Spritzenfilter. Füllen Sie die Fällmittel- und Wasserflaschen mit fünf Millilitern der gefilterten Lösungen.

Montieren Sie dann die Flaschen in die Pumpenhalterungen der Experimentierkammer. Stellen Sie im Softwarefenster die experimentellen Parameter mit einer Temperatur von 20 Grad Celsius, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 20 Grad Celsius und Wasser als Lösungsmittel ein. Öffnen Sie die Vordertür der Experimentierkammer und entfernen Sie den Deckglasträger.

Legen Sie ein sauberes und silikonisiertes Deckglas auf den Träger und legen Sie es wieder in das Gerät ein. Schließen Sie die Versuchskammer, um die Umgebungsbedingungen zu sichern. Schalten Sie die Pumpe Null ein, indem Sie die wichtigsten Pumpeneigenschaften verwenden, die im Textprotokoll zu finden sind, und erzeugen Sie einen Wasserstrahl.

Stellen Sie den Wasserstrahl ein und richten Sie die Position in Richtung der Mitte des Deckglases, indem Sie die dafür vorgesehene Einstellschraube manuell betätigen. Schalten Sie die Pumpe Null aus, schalten Sie dann die erste Pumpe ein und erzeugen Sie wie zuvor einen Flüssigkeitsstrahl. Stellen Sie die Strahlposition der ersten Pumpe in die für die Pumpe Null festgelegte Position ein.

Ersetzen Sie nach dem Ausschalten von Pumpe Eins das gebrauchte Deckglas durch ein neues, sauberes Deckglas für das Kristallisationsexperiment. Erstellen Sie eine neue experimentelle Datei mit dem Softwarepaket. Geben Sie in der Versuchsdatei das Protein als Thaumatin aus Thaumatococcus daniellii ein; die Proteinkonzentration beträgt 14 Milligramm pro Milliliter, das Fällungsmittel Natriumtartrat und die Fällungsmittelkonzentration 1,2 molaren Einheiten.

Nachdem Sie die neue Experimentdatei geladen haben, um diese Informationen zu aktivieren, markieren Sie die Position auf dem Proteintröpfchen, indem Sie mit Pump Zero einen kleinen Wassertropfen hinzufügen. Drücken Sie die Tara'-Taste, um die Mikrowaage auf Null zu setzen. Öffnen Sie den oberen Deckel der Versuchskammer und pipettieren Sie 8 Mikroliter Thaumatin-Lösung auf den Wasserweg.

Um den neuen Thaumatin-Tropfen zu registrieren, klicken Sie zunächst auf den neuen Tropfen, um die Anfangsbedingungen aus der experimentellen Datei zuzuordnen. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Konstante", um die natürliche Verdunstung von Wasser aus dem Tröpfchen auszugleichen. Überprüfen Sie mit der CCD-Kamera, ob Pump Zero auf den Proteintropfen zielt.

Stellen Sie die Position der Pumpe Null neu ein, wenn der Wasserstrahl außerhalb des Tropfens liegt. Schalten Sie den DLS-Laser ein und platzieren Sie den Laserstrahl im Proteintropfen, indem Sie die Einstellschrauben manuell betätigen. Geben Sie die DLS-Parameter mit einer Messdauer von 60 Sekunden, einer Wartezeit zwischen zwei Messungen von 10 Sekunden und einer Anzahl von Messungen als 300 ein.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die DLS-Messungen zu starten. Überprüfen Sie die Qualität der Probe, indem Sie eine der DLS-Grafikdarstellungen auswählen. Geben Sie in der Zeitplantabelle die Bedingungen für den Verdampfungsschritt ein, wie im Textprotokoll dargestellt.

Aktivieren Sie dann den Schritt der Probenverdampfung, indem Sie auf die Schaltfläche "Automatisierung" klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp", wenn der Schritt der Probenverdampfung abgeschlossen ist. Aktivieren Sie die Konstantentaste, um das Gewicht des Tröpfchens konstant zu halten.

Diese Funktion kompensiert die Möglichkeit einer natürlichen Probenverdunstung und stellt sicher, dass keine Konzentrationsänderungen stattfinden können, bis weitere Maßnahmen ergriffen werden. Geben Sie anschließend die Bedingungen für den Schritt der Fällmittelzugabe in die Zeitplantabelle ein, wie sie im Textprotokoll aufgeführt sind. Aktivieren Sie den Schritt der Fällmittelzugabe, indem Sie auf die Schaltfläche "Automatisierung" klicken.

Um die Entwicklung des Kristallisationströpfchens im Laufe der Zeit zu verfolgen, überprüfen Sie das Aussehen der Thaumatin-Kristalle mit der CCD-Kamera. Überprüfen Sie die Partikelgrößenverteilung anhand der grafischen DLS-Darstellungen. Überprüfen Sie auch die Entwicklung des Gewichts und der experimentellen Parameter, indem Sie das Anzeigefenster verwenden.

Alle in diesem Fenster angezeigten Informationen werden in Echtzeit berechnet und angezeigt, basierend auf den Gewichtsänderungen während der Kristallisation, die von der hochempfindlichen Waage online aufgezeichnet werden. Beschichten Sie eine saubere Standard-Terasaki-Platte, indem Sie 3 Milliliter Paraffinöl auf die Platte geben. Verteilen Sie das Paraffinöl auf den Plattenvertiefungen, indem Sie die Platte vorsichtig in verschiedenen Winkeln bewegen, so dass das Öl alle 72 Vertiefungen bedeckt.

Entfernen Sie das überschüssige Paraffinöl, indem Sie das Öl, das auf der Platte schwimmt, ausgießen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp", um das Kristallisationsexperiment zu beenden. Nehmen Sie vorsichtig den Probenträger mit dem Kristallisationströpfchen heraus.

Mit einer Pipette werden zwei Mikroliter Aloquots des Kristallisationstropfens in die Vertiefungen der Terasaki-Platte gegeben. Durch die Rückgewinnung des Kristallisationstropfens in einer Platte unter Öl kann die Probe mit Hilfe eines Mikroskops oder anderer diolischer Techniken, die mit Terasaki-Platten arbeiten, regelmäßig auf ihre Stabilität beim Kristallwachstum überprüft werden. Hier ist eine Radiusdiagrammverteilung dargestellt, die das Wachstum der Partikelgröße im Proteintropfen während des gesamten Kristallisationsprozesses vom monomeren Protein bis zur Bildung von Kernen, Nanokristallen und Mikrokristallen zeigt.

Hier stellen Diagramme die zeitliche Entwicklung des Gewichts des Proteintröpfchens dar, zusammen mit der berechneten Proteinkonzentration und der Fällmittelkonzentration. Hier ist ein aufgenommenes Foto von Thaumatin-Mikrokristallen am Ende des Experiments. Das Tröpfchen zeigt eine sehr große Menge an kleinen Mikrokristallen, die in Proteinlösung gesättigt sind.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde und 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, dass Sie den DLS-Laser in den Mikrodosiersystemen in das Proteintröpfchen einstellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einfach mit diesem Kristallisationsgerät umgehen können, um eine Proteinprobe erfolgreich zu kristallisieren.

Diese Methode ist aufgrund der in situ dynamischen Lichtstreuung möglich, die direkt an das Kristallisationströpfchen gekoppelt ist. Dies ermöglicht es uns, alle Änderungen in der Radiusverteilung zu überwachen und somit bestimmte Verteilungsmuster entweder auf die Kristallisation oder die Proteinfällung zurückzuführen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Kryo-Elektronenmikroskopie oder Elektronenbeugung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten und den kristallinen Zustand von submikrometergroßen Partikeln in Lösung zu überprüfen.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die zweistufige Theorie der Keimbildung, da die DLS-Karten ein klares Muster einer doppelt so großen Verteilung von Partikeln in Lösung zeigen, die vor dem Kristallwachstum liegen.