Entwicklung von rekombinanten Proteinen zur Behandlung von chronischen Schmerzen

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, ein Fusionsprotein der entzündungshemmenden Zytokine IL4 und IL10 herzustellen, seine Qualität zu kontrollieren und seine funktionelle Aktivität und analgetischen Eigenschaften in Spiegelmodellen für chronisch entzündliche Schmerzen zu bewerten. Diese detaillierten Methoden helfen bei der Entwicklung neuartiger Biologika und testen deren Qualität und Funktionalität. Der Vorteil dieser Techniken besteht darin, dass Sie eine ausreichende Menge an rekombinanten Fusionsproteinen herstellen können, die eine Bewertung ihrer analgetischen Eigenschaften in vivo ermöglichen.

Um das therapeutische Potenzial des neu entwickelten Fusionsproteins zu bewerten, ist es wichtig, eine gut charakterisierte Charge zu haben und eine Vielzahl von Verhaltenstests zu verwenden. Die Implikation dieser Methoden ist, dass sie Einblicke in dringend benötigte neue Therapien für chronische Schmerzen geben, aber auch das Potenzial auf andere entzündliche Erkrankungen ausweiten. In der Regel werden Wissenschaftler, die neu in diesen Methoden sind, Schwierigkeiten haben, alle hier gezeigten Verfahren durchführen zu können, da Fachwissen in verschiedenen Bereichen erforderlich ist.

Nach der Subkultivierung von 100 Millilitern HEK 293F-Zellen in 500-Milliliter-Erlenmeyerkolben gemäß dem Textprotokoll werden 6,6 Milliliter DNA-Transfektionsreagenzgemisch in jeden Zellkolben gegeben. Kultivieren Sie die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius, 8 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit auf einem Orbitalschüttler, der sich bei 125 U/min dreht. Ernten Sie dann den Kulturüberstand, der das sezernierte IL4-10-Fusionsprotein enthält.

Um die Proteinaufreinigung durchzuführen, werden 100 Milliliter des 10-fach konzentrierten Zellkulturüberstands mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute durch eine zuvor vorbereitete, IL4-gekoppelte Sepharose-Bead-Säule geleitet. Verwenden Sie 50 Milliliter PBS, um die Säule zu waschen. Tragen Sie dann 12,5 Milliliter 0,1 molaren Glycinpuffer auf, um das gebundene IL4-10-Fusionsprotein in 2,5-Milliliter-Fraktionen mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute zu eluieren.

Fügen Sie als Nächstes 350 Mikroliter eines molaren Tris-Puffers, pH 9, zu jeder Fraktion hinzu, um den pH-Wert auf 7 zu bringen. Verwenden Sie Dialyseschläuche mit einem Trockendurchmesser von 16 Millimetern und einem Molekulargewichtsgrenzwert von 3,5 K, um die neutralisierten Fraktionen über Nacht gegen zwei Liter PBS zu dialysieren. Verwenden Sie dann Einwegfilter mit einem Porendurchmesser von 0,45 Mikrometern, um die dialysierten Fraktionen zu sterilisieren.

Aliquotieren Sie die sterile IL4-10-Fusionsproteinlösung und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Bewerten Sie die Reinheit des eluierten IL4-10-Fusionsproteins, indem Sie zunächst eine Probe auf ein 12%SDS-PAGE-Gel auftragen und das Gel mit Coomassie-Blau färben. Führen Sie dann eine Hochdruck-Größenausschlusschromatographie durch, indem Sie 40 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Protein auf die Säule laden.

Bestimmen Sie die Konzentration jeder Charge des gereinigten IL4-10-Fusionsproteins mit einem IL10-ELISA und einem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Protokollen des Herstellers. Verwenden Sie das RPMI-Medium, um dreifache serielle Vorverdünnungen des gereinigten IL4-10-Fusionsproteins über einen Konzentrationsbereich von fünf bis 1.215 Nanogramm pro Milliliter herzustellen. Geben Sie in die Vertiefungen einer 48-Well-Platte 50 Mikroliter IL4-10-Fusionsprotein, 75 Mikroliter RPMI-Medium, 25 Mikroliter LPS und 100 Mikroliter menschliches Blut.

Inkubieren Sie die Platte 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 8 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit. Verwenden Sie dann einen TNF-alpha-ELISA gemäß dem Protokoll des Herstellers, um die Konzentration von TNF-alpha in Kulturüberständen zu bewerten. Bewahren Sie vorbereitete Carrageen- oder CFA-Lösungen in Spritzen mit 30-Gauge-Nadeln mindestens 15 Minuten vor der Injektion bei Raumtemperatur auf.

Führen Sie dann die Nadel etwa 0,5 Zentimeter in den Daumen der Hinterpfote einer nicht anästhesierten Maus ein, richten Sie sie in Richtung Ferse und injizieren Sie 20 Mikroliter der Verbindung. Um Schmerzmessungen mit dem Von-Frey-Test durchzuführen, setzen Sie ein Tier in einen Acrylkäfig auf einem Drahtgitterständer und lassen Sie die Maus mindestens 15 Minuten lang akklimatisieren. Tragen Sie die Von-Frey-Filamente mit einer Größe von 0,02 bis vier Gramm senkrecht zur Pfotenoberfläche mit ausreichend Kraft auf, um eine leichte Biegung auf der Haut zu verursachen, und halten Sie sie etwa drei Sekunden lang.

Messen Sie die Rückzugsschwelle der Pfote als Reaktion auf jedes Haar und betrachten Sie jede Bewegung der Pfote weg von den aufgetragenen Haaren als positive Rückzugsreaktion. Setzen Sie die Tiere in Käfige auf einer vorgewärmten Glasplatte und lassen Sie die Mäuse vor den Messungen mindestens 15 Minuten lang akklimatisieren. Bestimmen Sie die Latenzzeiten der Wärmeentnahme, indem Sie ein Hargreaves-Gerät verwenden, um die Pfote der Tiere mit einem fokussierten sichtbaren Lichtstrahl zu erwärmen.

Messen Sie vor dem dynamischen Belastungstest das Körpergewicht jedes Tieres. Platzieren Sie ein Tier in einem dynamischen Gewichtstragsystem mit Bodeninstrumenten, das auf einer Abdeckung montiert ist, die eine Kamera trägt, die Mausbewegungen aufzeichnet. Lassen Sie das Tier 0,5 bis eine Minute lang akklimatisieren, bevor Sie die Bewegungen der Maus fünf Minuten lang aufzeichnen.

Führen Sie dann eine Analyse jedes Videos durch und stellen Sie sicher, dass jedes Glied von der Software in dem von der Software angegebenen Zeitrahmen korrekt erkannt wird. Füllen Sie die injizierbaren Verbindungen in eine saubere 25-Mikroliter-Glasspritze von Hamilton auf, die mit einer 27-Gauge-Nadel verbunden ist. Legen Sie die Maus mit dem Kopf in den Nasenkonus des Geräts auf den Tisch und halten Sie die Sedierung der Maus mit 1,5 bis 2 % Isofluran bei einer Sauerstoffflussrate von zwei Litern pro Minute aufrecht.

Überprüfen Sie, ob die Maus richtig betäubt ist, indem Sie die Pfote kneifen und sicherstellen, dass sie nicht reagiert. Halten Sie die Maus mit der Wirbelsäule hinter den Rippen fest. Positionieren Sie die Nadel senkrecht zwischen den Lendenwirbeln L5 und L6 und führen Sie sie vorsichtig durch die Haut in den Zwischenwirbelraum ein.

Bestätigen Sie die korrekte Ausrichtung, indem Sie überprüfen, ob ein Heckschlag stattgefunden hat. Wenn nur ein einziger Pfotenschlag beobachtet wird, ist die Nadel wahrscheinlich nicht richtig platziert. Injizieren Sie dann langsam fünf Mikroliter der Verbindung, warten Sie einige Sekunden und ziehen Sie die Nadel langsam zurück.

Hier ist ein repräsentatives Bild eines SDS-PAGE-Gels mit Affinitätschromatographie-Fraktionen zu sehen. In der Elutionsfraktion werden zwei Banden von 35 und 37 Kilodalton beobachtet, die zwei verschiedenen Glykoformen des IL4-10-Fusionsproteins entsprechen. Diese Abbildung veranschaulicht die Ergebnisse eines Wirksamkeitsassays in einem Vollblutassay von zwei verschiedenen IL4-10-Fusionsproteinchargen.

Es wird eine dosisabhängige Hemmung der LPS-induzierten TNF-alpha-Freisetzung beobachtet, die eine vergleichbare Bioaktivität für die beiden IL4-10-Fusionsproteinchargen zeigt. In diesen Experimenten wurden anhaltende entzündliche Schmerzen durch intraplantare Injektion von 2%Carrageen induziert. Am sechsten Tag nach der Induktion wurde den Mäusen intrathekal das IL4-10-Fusionsprotein injiziert.

IL4-10 löste sowohl die mechanische als auch die thermische Hyperalgesie signifikant ab und erreichte 24 Stunden nach der Injektion ihre maximale Wirkung. Hier wurden entzündliche Schmerzen durch eine intraplantare Injektion von 20 Mikrolitern CFA induziert. Die Belastung jeder Pfote wurde mit dem dynamischen Gewichtsstützgerät gemessen.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die intraplantare CFA-Injektion die Belastung der betroffenen Pfote reduzierte. Sieben Tage nach der intraplantaren CFA-Injektion wurde eine intrathekale Injektion des IL4-10-Fusionsproteins durchgeführt. Zwei Tage später wurde die Reduktion der Belastung der betroffenen Pfote im Vergleich zu Vehikel-injizierten Mäusen abgeschwächt.

Einmal gemeistert, können mit diesen Verfahren drei Milligramm Fusionsprotein aus jedem Liter kultivierter Zellen gewonnen werden. Es ist gut, daran zu denken, ein Expressionssystem zu wählen, das mit der zukünftigen GMP-Produktion von Fusionsproteinen kompatibel ist. Um das analgetische Potenzial dieses neuartigen Fusionsproteins zu testen, können andere Modelle für chronische Schmerzen verwendet werden, wie z. B. Nervenverletzungen oder Chemotherapie-induzierte Neuropathie.

In diesem Video wird eine Vielzahl von Verhaltenstests gezeigt, aber andere Schmerztests deuten darauf hin, dass auch eine konditionierte Ortspräferenz durchgeführt werden könnte. Vergessen Sie nicht, dass intrathekale Injektionen gut ausgebildetes Personal erfordern und dass das Injektionsvolumen eher begrenzt ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Fusionsprotein herstellt und seine Wirksamkeit in vivo in verschiedenen Schmerzmodellen testet.