Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen
16. April 2018
Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine kardialspezifische Genmanipulation in vivo durch intramyokardiale Adenovirus-Injektion in adulte Mäuse zu erreichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der kardiovaskulären Forschung über die molekularen Mechanismen und die Wirksamkeit der Gentherapie zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie frei von Beatmung ist, dass sich die Mäuse schnell von der Operation erholen und dass sie reproduzierbar und einfach durchzuführen ist.
Also, fangen wir jetzt an. Am Tag des Eingriffs die gereinigte Adenovirus-Vektorlösung von minus 80 Grad Celsius erwärmen und auf Eis lagern. Wenn das Adenovirus aufgetaut ist, ziehen Sie eine Gesichtsmaske, einen sterilen Kittel und sterile Handschuhe an.
Und besprühen Sie das Adenovirus-Röhrchen mit 75% Ethanol. Übertragen Sie das Virus in eine sterile Laminar-Flow-Haube und aspirieren Sie 50 Mikroliter der Viruslösung in eine sterilisierte 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze. Befestigen Sie eine 30-Gauge-Nadel an der Spritze.
Drehen Sie die Spritze in die aufrechte Position. Drücken Sie den Kolben vorsichtig zusammen, bis ein Tropfen Lösung an der Nadelspitze sichtbar ist, um die Nadelspitze mit Viren zu füllen. Aspirieren Sie dann vorsichtig weitere 30 Mikroliter Adenovirus-Lösung in die Spritze und legen Sie die Spritze auf Eis.
Um das Adenovirus in ein Mausherz zu injizieren, bestätigen Sie das angemessene Maß an Sedierung durch fehlendes Ansprechen auf das Zehenkneifen und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf. Rasieren Sie die obere Brust und den Bauch des Tieres. Tragen Sie die im Handel erhältliche Enthaarungscreme auf die exponierte Haut auf.
Verwenden Sie eine feuchte Gaze, um die Creme und alle verbleibenden Haare nach einer Minute zu entfernen. Sterilisieren Sie mit drei antiseptischen Peelings auf Jod-Chlorhexidin-Basis die untere linke Seite der Brust. Decken Sie dann das Tier mit einem OP-Tuch ab, schneiden Sie ein Loch über den Operationsbereich und ziehen Sie ein neues Paar sterile Handschuhe an.
Als nächstes machen Sie mit steriler Technik und Instrumenten einen 0,5 Zentimeter großen Hautschnitt vom Xiphoid bis zur Achselhöhle und verwenden Sie eine Pinzette und ein Mikromücken-Hämostat, um die großen und kleinen Brustmuskeln stumpf zu präparieren. Ziehen Sie die großen und kleinen Brustmuskeln zurück, um den Interkostalraum freizulegen. Und verwenden Sie das Micro Mosquito Hämostat, um den vierten Interkostalraum zu durchstechen und zu öffnen.
Drücken Sie mit dem Zeigefinger der nicht dominanten Hand sanft gegen die rechte Seite der Brustwand, um das Herz in Richtung Schnitt zu bewegen. Befestigen Sie dann vorsichtig das externalisierte Herz mit dem Zeigefinger und Daumen derselben Hand und injizieren Sie mit der dominanten Hand 10 Mikroliter Adenoviruslösung in das Myokard der ventralen, dorsalen und lateralen Wände des linken Ventrikels. Nach der letzten Injektion bringen Sie das Herz sofort wieder in den intrathorakalen Raum zurück.
Drücken Sie die Brustwand sanft in Richtung der Inzisionsstelle, um die Luft manuell aus dem intrathorakalen Raum zu evakuieren. Verschließen Sie die Haut mit einer Seidennaht mit fünf Otts in einem horizontalen Matratzenmuster und legen Sie die Maus auf ein 37 Grad Celsius heißes Heizkissen mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung. Sterilisieren Sie dann die gebrauchte Hamilton-Spritze und die 30-Gauge-Nadel in einem Hochdrucksterilisator mit hoher Temperatur und entsorgen Sie die sterilisierte Nadel in einem geeigneten Behälter für scharfe Gegenstände.
Fünf Tage nach intramyokardialer Injektion des Adenovirus, das Luciferase umschließt, deutet die In-vivo-Bildgebung auf eine robuste Überexpression von Luciferase, insbesondere im Herzen, hin, die durch Western-Blot-Analyse bestätigt werden kann, was auf das Fehlen einer Non-Target-Organtransduktion hindeutet. Die Western-Blot-Analyse zeigt auch eine signifikant erhöhte Expression von Vitamin-D-Rezeptoren. Und der linke Ventrikel von Mäusen, denen das Adenovirus injiziert wurde, das für den Vitamin-D-Rezeptor kodiert.
Mit einer verminderten Expression des Rezeptors, die bei Tieren beobachtet wurde, die mit Adenoviren injiziert wurden, die für kurze Haarnadeln kodieren, die auf den RNA-Vitamin-D-Rezeptor abzielen. Im Gegensatz dazu ist die Expression des Vitamin-D-Rezeptors in den rechten Ventrikeln der beiden Tiere, denen der linke Ventrikel injiziert wurde, nicht signifikant verändert. Einmal gemeistert, kann diese Methode innerhalb von zwei Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Injektion von Herzzellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Wirksamkeit spezifischer Zelltherapien bei Myokardinfarkten.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur herzspezifischen Genmanipulation bei adulten Mäusen durch intramyokardiale Adenovirus-Injektion. Die Technik ermöglicht eine schnelle Erholung und Reproduzierbarkeit und eignet sich daher für die kardiovaskuläre Forschung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissensbereich
- Kardiovaskuläre Forschung
- Gentherapie
- Herzbiologie
Hintergrund
- Verständnis der molekularen Mechanismen bei Herzverletzungen.
- Bewertung der Wirksamkeit von Gentherapie bei Herzerkrankungen.
- Bedeutung von Genmanipulationstechniken in vivo.
- Vorteile nicht-beatmeter Verfahren in Tiermodellen.
Zweck der Studie
- Herzspezifische Genmanipulation zu erreichen.
- Die Auswirkungen spezifischer Gene auf die Herzfunktion zu untersuchen.
- Eine zuverlässige Methode für zukünftige kardiovaskuläre Studien bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Externalisierung der Mäuseherzen durch den vierten Interkostalraum.
- Injektion von Adenoviren, die spezifische Gene codieren, in das Myokard.
- Messung der Proteinexpression mittels in vivo Bildgebung.
- Western Blot Analyse zur Beurteilung der Genexpression.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Genmanipulation im Herzgewebe.
- Schnelle Erholung der Mäuse nach der Operation.
- Reproduzierbarkeit der Technik über Versuche hinweg.
- Effektive Messung der Proteinexpressionsniveaus.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ist ein wertvolles Instrument zur Untersuchung der kardialen Genfunktion.
- Es erleichtert die Erforschung von Gentherapie-Anwendungen bei Herzerkrankungen.
- Die Methode verbessert das Verständnis kardialer molekularer Mechanismen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise cardiac-specific gene manipulation in mice, supporting target validation and mechanistic de-risking in cardiovascular drug discovery. By minimizing off-target transduction and enabling rapid recovery, it improves predictive confidence in preclinical models. The technique aligns with early discovery workflows requiring reproducible, scalable, and physiologically relevant gene modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through cardiac-specific overexpression or silencing of target genes like VDR.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating cardiac effects from systemic confounders.
- Strategic Value: Supports target confidence assessment prior to lead identification campaigns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable cardiac-specific readouts via luciferase imaging and Western blot for assay validation.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for consistent compound or vector screening in disease-relevant systems.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by enabling standardized myocardial delivery across studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling cardiac-specific gene modulation in vivo.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation with minimal procedural variability.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by confirming on-target cardiac effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, enabling reliable cardiac gene modulation before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through precise cardiac gene manipulation.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with quantitative, heart-specific outputs.
- Analytics: Provides measurable endpoints via in vivo imaging and Western blot for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant cardiac targeting without off-target effects.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for cardiac gene, cell, or material delivery across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through target-specific modulation and reduced biological noise.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across cardiac studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by isolating cardiac mechanisms and reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on confirmed cardiac target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac surgery and sterile technique.
- Necessitates Hamilton syringes, 30-gauge needles, and sterile laminar flow hoods.
- Demands cross-team standardization for consistent myocardial injection volumes and depths.
- Involves adaptation considerations when scaling to different cardiac disease models.
- Limited by manual externalization technique, which may require training for reproducibility.
