Name: Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Lernen Sie die Extraktion von Hämozyten aus Drosophila-Larven für mikrobielle Infektionsstudien. Diese Methode ermöglicht die 3D-Visualisierung von Pathogen-Invasionen in Immunzellen mittels konfokaler Mikroskopie.

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Wir sind dankbar, Dr. Robert Heinzen für die Bereitstellung von Aktien von mCherry exprimierenden Coxiella Burnetii. Wir danken Dr. Luis Teixeira für Bereitstellung von Wirbellosen irisierende Virus 6 und Bloomington Stock Center für die Bereitstellung fliegen Bestände. Dieses Projekt wurde teilweise von NIH Grant R00 AI106963 (A.G.G) und der Washington State University finanziert.

1. ex Vivo -Infektion
<ol><li>Medium und Ausrüstung<ol>
<li>Unter sterilen Bedingungen bereiten frische Drosophila Hemocyte isolieren Medium (DHIM) mit 75 % Schneider Drosophila mit 25 % mittlere fetalen Bovine Serum (FBS) und Filter Sterilisieren sie.</li>
		<li>Layer-2-3 Stücke von 10 x 10 cm Paraffin Film unter einem Stereomikroskop.</li>
		<li>Bereiten Sie die Glas-Kapillare. Legen Sie die Kapillare Puller-Heizung auf 55 % des Maximums. Ziehen Sie das Kapillarrohr zu einer scharfen Spitze von ca. 10 µm.</li>
		<li>Abgleich der Kapillare mit Mineralöl.</li>
		<li>Montieren Sie gefüllte Kapillarröhrchen auf der Nanoinjector (Abb. 1A), und öffnen Sie verschmolzen Kapillarrohr Tipp durch Abbruch der Tipp mit der Pinzette (Abbildung 1B). Der Außendurchmesser der Spitze sollte 100 µm für die einfache Aufnahme von den Hemocytes.</li>
		<li>Werfen Sie so viel Öl wie möglich von der Spitze des Kapillarrohr aus, dann füllen Sie mit DHIM. Für einfache Visualisierung von der Grenze bis genommen Hämolymphe und das Öl, enthalten eine Luftblase zwischen Öl und DHIM (Abbildung 1B").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hämolymphe Extraktion<ol>
<li>Wählen Sie 3rd instar Drosophila Larven von innen Wand von Lebensmitteln Fläschchen vorsichtig mit Pinzette und legen Sie sie in einem 100 µm-Sieb (Abbildung 1C). 3rd Instar Larven befinden sich ca. 3-6 Tage nach fruchtbaren Eiablage durch eine erwachsene Frau. Hinweis: Diese Experimente verwendet den Genotyp, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ}, 2P {w+ mC= FH-2xEGFP} AH2, da Hemocytes von diesen Tieren erhöhte grünes fluoreszierendes Protein (EGFP) zur Identifizierung der Zellen durch Mikroskopie Unterstützung zum Ausdruck bringen.</li>
		<li>Larven 5 mL sterilem Wasser übergießen und schütteln Sie das Sieb 5 S. Ort das Sieb auf Aufgabe wischen, um das überschüssige Wasser entfernen (Abbildung 1C").</li>
		<li>Übertragen Sie die Larven in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Betäuben sie mit CO2 -Gas für 5 s (Abbildung 1D).</li>
		<li>Legen Sie die Larven auf Paraffin-Film unter dem Stereomikroskop mit Dorsalseite nach oben (Abb. 2A).</li>
		<li>Stelle das Glas leicht auf die Larven hinteren Körpers Kapillare zu befestigen und zu stören die hintere Nagelhaut öffnen mit feinen Spitzen Pinzette (Abbildung 2B).</li>
		<li>Lassen Sie die Hämolymphe auf Paraffin-Folie (Abbildung 2C) fließen.</li>
		<li>Machen Sie einen Pool von Hämolymphe einschließlich Hemocytes von 20-50 Larven zu einem Zeitpunkt auf dem Paraffin-Film.</li>
		<li>Nehmen Sie gepoolten Hämolymphe mit dem Glas Kapillare auf den Nanoinjector (Abb. 2D). Hinweis: Sollte ca. 10-20 µL der Hämolymphe.</li>
		<li>Werfen Sie die Hämolymphe zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL DHIM (Abb. 2E).</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.2.4) - 1.2.9) für jede Charge der Larven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Anzahl der Hemocytes.<ol>
<li>Pipette 5 µL 0,4 % Trypan blau-Lösung in einem 0,6 mL Microcentrifuge Schlauch, die toten Zellen zu beflecken. Vorsichtig mischen Sie, DHIM und Hemocytes in der 1,5 mL Tube mit einer Pipette und übertragen Sie 5 µL DHIM einschließlich Hemocytes 0,6 mL Microcentrifuge Schlauch und mischen Sie vorsichtig.</li>
		<li>Pipette 10 µL Zellen aus der 1:1 Trypan blau: Hemocyte Mischung in der Hemocytometer.</li>
		<li>Die Anzahl der Leben Hemocytes, die sind nicht befleckt mit Trypan blau in jeder der 4 Ecken Felder von der Hemocytomter und die Konzentration von Hemocytes pro Milliliter Formel zu berechnen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> wo X ist die Konzentration von live Hemocytes pro Milliliter; a, b, C und d sind die Anzahl der lebenden Zellen (wie von Trypan blau Ausgrenzung bestimmt) in je 4 der Felder in der Hemocytometer gezählt. Division durch 2 von der Gesamtzahl der Zellen gezählt ist aufgrund der Verdünnung von 1:1 der Zellen mit Trypan blau. Mit Trypan blau gefärbten Zellen gelten als tot.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ex-vivo Infektionen<ol>
<li>Bestimmen Sie die Anzahl der Vertiefungen mit Zellen basierend auf Zeitpunkte und biologische gesät werden repliziert benötigt für jedes Experiment. 5.0 × 104 Hemocytes sind wünschenswert, dass RNA und Protein Reinigung nach Infektion.</li>
		<li>Berechnen Sie das Volumen der Erreger Lager mit DHIM verdünnt werden, für eine Infektion mit der folgenden Formel: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> wo Multiplizität der Infektion (MOI) ist die Anzahl der Viren oder Bakterien auf Wunsch pro Zelle. Hinweis: MOI verwendet richtet sich nach den einzelnen Experiment und Tests durchgeführt. Hier, 10 Genom-äquivalente (GE) / Zelle von C. Burnetii, 10 KBE/Zelle von Listerienoder 1 TCID50/cell von IIV6 diente.</li>
		<li>Bereiten Sie 500 µL des Erregers Medium für jede Vertiefung einer 24-Well-Platte durch virale oder bakterielle Volumen in einem Rohr das richtige Volumen der DHIM hinzufügen.</li>
		<li>Platz 12 mm Runde Deckglas (Nr. 1-Dicke) in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte.</li>
		<li>Die DHIM einschließlich der Hemocytes in Vertiefungen von einer 24-Well-Platte aufgeteilt.</li>
		<li>Hemocytes in einem gut 500 µL des Erregers Medium hinzufügen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 x g für 5 min.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 28 ° c Alle 15 min leicht kippen die Platte von hinten, vorne, dann links nach rechts für 5 s von Hand.</li>
		<li>Nach 1 h Einmarsch/Anlage Schritt 1.4.8) sanft pipette aus dem Erreger Medium waschen die Hemocytes mit frischen DHIM und füllen Sie ihn mit 500 µL des frischen DHIM.</li>
		<li>Die gewünschte Zeit inkubieren Sie der infizierten Hemocytes. In diesen Experimenten, C. Burnetii- oder IIV6-infizierten Hemocytes sind für 24 h und Listeriainkubiert-infizierten Hemocytes sind für 1, 2 oder 4 h inkubiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. in-Vivo -Infektion
<ol><li>Infektion<ol>
<li>Warm Drosophila Obst Saft nährbodenplatte bei Raumtemperatur für 15 min. Platten erfolgt wie oben beschrieben20.<ol>
<li>700 mL Wasser und Autoklaven 30 g Agar-Agar hinzufügen es 40 Minuten.</li>
			<li>0,5 g Methylparaben in 10 mL von absoluten Ethanol auflösen.</li>
			<li>300 mL Fruchtsaftkonzentrat Methyl-Paraben-Lösung hinzufügen.</li>
			<li>Schnell die Saft-Konzentrat in die autoklaviert Agar Lösung mischen und 5 mL in 10 × 35 mm Petrischalen zu verzichten.</li>
			<li>Nachdem die Platten für 15 min abgekühlt haben, speichern sie bei 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie 3rd Instar Larven folgende Schritte 1.2.1) - 1.2.3).</li>
		<li>Legen Sie die Hefe-Paste auf einer nährbodenplatte. Machen Sie einen feinen Schnitt in der Agarplatte, wo die Larven migrieren können, um zu vermeiden, Trocknen(Abbildung 3). Montieren Sie eine 0,001 mm Spitzen Wolfram Nadel mit Zange mit Paraffin-Film (Abbildung 3B, C) zu halten.</li>
		<li>Hohe Titer mCherry 50 µL Pipette auszudrücken -C. Burnetii (5,95 × 109 GE/mL) auf das Paraffin unter dem Stereo-Mikroskop und Auflegen der Larven in den Pool von Bakterien.</li>
		<li>Legen Sie die Larven in den Pool von Bakterien. Stechen Sie die Larven mit einer Wolfram-Nadel (Abbildung 3D). Übertragen Sie die Larven auf einer nährbodenplatte (Abbildung 3E).</li>
		<li>Die verbleibenden Erreger Medium auf die Agarplatte zu übertragen und die Dichtplatte mit Paraffin Film.</li>
		<li>Halten Sie die Larven auf der Platte in feuchter Luft bis die gewünschte Zeit nach der Infektion (Abbildung 3F). In diesem Experiment, C. Burnetii-infizierten Larven sind auf dem Teller für 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hämolymphe Extraktion und Beschichtung von hemocytes<ol>
<li>Bereiten Sie das Medium und die Ausrüstung nach Schritt 1.1).</li>
		<li>Platz 12 mm Runde Deckglas (Nr. 1-Dicke) in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte. Pipette 500 µL DHIM in den Brunnen.</li>
		<li>Auszug der Hämolymphe aus infizierten Larven, die folgenden Schritte 1.2.4) - 1.2.8).</li>
		<li>Werfen Sie die Hämolymphe in den nun folgenden Schritt 2.2.2).</li>
		<li>2.2.3) wiederholen und 2.2.4) für mehrere Batches von Larven.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 x g für 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Visualisierung
<ol><li>Fixierung und Färbung<ol>
<li>Entfernen Sie nach Abzug der Hemocytes an die Runde Abdeckung Glas in den Brunnen zu begleichen vorsichtig das Medium aus jedem Brunnen.</li>
		<li>Fügen Sie sanft 200 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung der sesshaften Hemocytes. Inkubieren Sie die Hemocytes für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die 4 % PFA und sanft fügen Sie 200 µL PBS mit 0,1 % Triton X-100 und 1 % Bovine Serum Albumin (BSA) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Hemocytes für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die PBS und fügen Sie sanft 200 µL 1 × 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Hemocytes für 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die DAPI-Lösung, und fügen Sie sanft PBS in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Hemocytes für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Fallen Sie 10 µL des Mediums antifade Montage auf einen Glas-Objektträger.</li>
		<li>Nach dem Entfernen der PBS aus jedem Brunnen, entfernen Sie das Deckglas aus den 24-Well-Platte mit feinen Spitzen Pinzette. Sanft lege das Deckglas auf den antifade Eindeckmittel auf den Objektträger mit dem Hemocytes nach unten.</li>
		<li>Lassen Sie die Folie trocken indem man sie in die dunkle Nacht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocal Imaging<ol>
<li>Konfigurieren Sie die confocal Mikroskop für drei Farbe Imaging DAPI, EGFP und mCherry. Verwenden Sie die folgende Einstellung: DAPI Erregung (ex) 405 nm, Emission (Em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, Em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, Em 597-700 nm.</li>
		<li>Legen Sie die Probe auf das Mikroskop und den Fokus auf die Probe mit einem 63 X / 1.4 numerische Apertur (NA) Ziel. Suchen Sie nach gewünschten Hemocytes in das Sichtfeld für die Bildgebung.</li>
		<li>Stellen Sie Laser Power und Detektor Gewinne um angemessene Belichtung der Probe zu erreichen. Überprüfen Sie mehrere Z-Flugzeuge, um sicherzustellen, dass die Belichtung für die gesamte Probendicke geeignet ist.</li>
		<li>Die oberen und unteren Position auf der z-Achse eine ganze Hemocyte zu finden. Legen Sie diese Positionen als die Anfangs- und Endpositionen für Z-Schnitt.</li>
		<li>Verwenden Sie nur Scan Zoom Bild des Bereichs, in den Hemocyte. Zoom-Faktoren von 3 X werden häufig verwendet.</li>
		<li>Sammeln Sie die Bildserien mit geeigneten Auflösung z. B. 1024 x 1024 Pixel in der XY-Ebene und 0,3 µm-Abstand in der Z-Dimension.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D Modell-Rekonstruktion Hinweis: Open-Source-Software ist vorhanden, die viele der unten beschriebenen Funktionen für 3D Modell Rekonstruktion ausführt.<ol>
<li>Importieren Sie die Z-geschnittene Serie Bilddatei in die Software zugeordnete confocal Mikroskop für 3D-Modell Wiederaufbau.</li>
		<li>Wählen Sie eine Zelle zeigt Co Lokalisierung der Kerne gebeizt mit DAPI und mCherry mit dem Ausdruck C. Burnetii in einem EGFP Hemocyte zum Ausdruck zu bringen. Schneiden Sie die Bildserie, um nur die einzelne Zelle enthalten.</li>
		<li>Die Option 3D Viewer die mit abgepackten Softwarealgorithmus 3D-Modell rekonstruiert. Wählen Sie die gewünschte Art der 3D Darstellung unter Blend, Oberfläche und gemischte Optionen. Bei dieser Methode werden Hemocytes, Kerne und C. Burnetii Oberflächenmodelle mit angezeigt.</li>
		<li>Beobachten Sie die 3D rekonstruierte Zelle aus verschiedenen Positionen anzeigen durch die Maustaste gedrückt halten und ziehen den Cursor über den Bildschirm. Passen Sie die Zelle Ausrichtung und Position der modellierten Lichtquelle um das Bild zu optimieren. Andere Optionen für Deckkraft, Minimum und maximale Schwelle, Specular, Ambient, Shineness und Gamma bestehen, um das Bild zu optimieren.</li>
		<li>Nehmen Sie Querschnitte durch das Modell mit Clipping und speziellen Befehlen, um den inneren Inhalt der Hemocyte zu visualisieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Antrag auf gen und/oder Protein-Analyse
<ol><li>Nach der Infektion mit IIV6 und Listeria, lösen Sie Zellen für nachfolgende qRT-PCR oder Western-Blot Analyse wie zuvor beschrieben,21 und folgende Angaben des Herstellers. Hinweis: Siehe die Tabelle der Materialien für die Primer für qRT-PCR und die Antikörper für Western-Blot.</li>
	<li>Analysieren Sie PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese, wie zuvor beschrieben22, um die richtige Länge des verstärkten Produktes zu gewährleisten.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Um besser zu verstehen, wie Wirtszellen infiziert werden, ist es wichtig, die Lokalisation des Erregers in den Zellen zu klären, vor allem, wenn zuvor noch nicht getesteten Erreger und Zelle Typ Kombinationen4experimentieren. Während Studium der zellulären Antwort Kaskade nach Infektion produktive Erreger Invasion anzeigen kann, gilt die Kombination von bildgebenden und zellulären Antwortdaten Erreger Invasion und Infektion nachweisen. Während Berichte zeigen 2D-Bilder Erreger Invasion in die Wirt...

Drosophila Melanogaster ist eine gut etablierte Modellorganismus zur Erforschung der angeborenen Immunität1. Im Rahmen der angeborenen Immunantwort spielen Hemocytes eine wichtige Rolle bei der Reaktion auf Krankheitserreger Herausforderung. Hemocytes sind entscheidend für die Kapselung von Parasiten, sowie eine wichtige Funktion bei der Bekämpfung des Erregers durch phagocytic Aktion während Pilz-, Virus- und bakterielle Infektion2,3.
Um den Host angeborene Immunantwort auf pathogene mikrobielle Infektion am besten zu verstehen, ist es wichtig, wie der Erreger dringt in Wirtszellen während der Infektion zu visualisieren. Diese Visualisierung trägt zum Verständnis des Mechanismus der Invasion. Zusammen mit Details der Erreger intrazelluläre Lokalisation und die zelluläre Antwort können diese Daten Aufschluss über der Wirtsantwort zur Infektion und die zellularen Organellen die Mikrobe interagiert. 3D-Modell Wiederaufbau nach Bildgebung durch Mikroskopie kann hilfreich, um die genaue Lage von Krankheitserregern in Wirtszellen zu bestimmen. In dieser Studie visualisieren wir die Invasion von Coxiella Burnetii (C. Burnetii), dem Erreger der q-Fieber, eine Zoonose, die eine ernsthafte für die menschliche und tierische Gesundheit in primären Drosophila Hemocytes Bedrohung. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Drosophila sind anfällig für die Sicherheitsstufe 2 Nine Mile Phase II (NMII) Klon 4 Stamm von C. Burnetii und, dass diese Sorte in Drosophila4replizieren kann darauf hinweist, dass Drosophila einsetzbar als Modellorganismus C. Burnetii Pathogenese zu studieren.
Frühere Studien haben Hemocytes verwendet, um angeborene Immunantwort des Wirtes zu untersuchen. Hemocytes wurden verwendet für morphologische Beobachtungen5,6,7, morphometrische Analyse2,8, Phagozytose Analyse2,3, qRT-PCR-2 , 9, Immunopräzipitation10,11, immunofluorescent Analyse10,12, Immunostaining13, Immunoblotting3,10, 11 und Immunohistochemistry9,14. Obwohl Drosophila S2 Zellen auch für verschiedene in-vitro- Experimente zur Verfügung stehen, ändern Immortalisierung und potenzielle bereits bestehende Virusinfektion ihr Verhalten15,16. Die Verwendung von Primärzellen im Gegensatz zu einer immortalisierte Zelllinie wie S2-Zellen, kann für das Studium der angeborene immune Funktion in einem System repräsentativer für den gesamten Organismus. Darüber hinaus kann die Infektion von Hemocytes in Vivo, vor der Extraktion, die Zellen, die Interaktion mit anderen Host Proteine und Gewebe, einen Vorteil gegenüber der Gewinnung von Hemocytes vor der ex-Vivo -Infektion. Eine Reihe von verschiedenen Methoden wurden genutzt, um eine ausreichende Anzahl von Hemocytes in kurzer Zeit zu den Hemocytes lebendig8,17,18,19zu erhalten.
In dieser Studie stellen wir Ihnen eine Methode zur Hemocytes von Drosophila 3rd Instar Larven für pathogene mikrobielle Infektion mit C. Burnetii, Listeria Monocytogenes (Listerien) oder Wirbellosen schillernden extrahieren Virus 6 (IIV6). Wir beschreiben die Methoden zur in Vivo und ex Vivo Hemocyte Infektionen. In Vivound ex Vivo-infizierten Hemocytes waren mit der konfokalen Mikroskopie visualisiert und verwendet zum Erstellen von 3D Modellen von C. Burnetii Invasion. Darüber hinaus verwenden die Extraktion Protokoll, ex-Vivo-infizierten Hemocytes dienten für gen- und Protein-Expression Assays. Insbesondere war um zu prüfen, inwieweit der Infektion mit IIV6 und Listeria, total RNA oder Protein isoliert aus den Zellen zur qRT-PCR oder Western-Blot Analyse. Zusammen genommen, das Protokoll bietet Methoden, um schnell hohe Zahl von Hemocytes von 3rd Instar Larven und Beweise, dass primäre Hemocytes infiziert, in Vivo und Ex Vivosammeln, sind eine geeignete Plattform für mikrobielle Erreger Infektion Studien und anwendbaren nachgeschalteten Analysen wie Mikroskopie, Transkriptom und Proteomik.

<table><tbody><tr><td>Schneider's Drosophila Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>GE Healthcare Life Sciences&nbsp; (HyClone)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Filter (0.22 &micro; L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>Sieb (100 & Mikro; m)</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Glaskapillare</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr><tr><td>Kapillarabzieher</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO2 Verabreichungsapparat</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Coxiella burnetii - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Drosophila Fruchtsaftplatten</td><td>Cold Spring Harbor Protokolle</td><td></td><td>2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>Methylparaben</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Welch's 100% Traubensaft gefrorenes Konzentrat, 340 mL</td><td>Amazon</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>Petrischale, 10 x 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr><tr><td>Hefe, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) 2 Teile Wasser hinzufügen zu 1 Teil Hefe (v/v)</td></tr><tr><td>Wolframnadel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Haltezange</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>Antifading-Eindeckmedium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Konfokales Mikrosope</td><td>Leica</td><td>TCS SP8-X Konfokales Weißlicht-Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>3D-Bildgebungs-Rekonstruktionssoftware</td><td>Leica</td><td>LASX mit 3D-Visualisierungsmodul</td><td>3.3)</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Irisierendes Virus der Wirbellosen 6 (IIV6)</td><td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>Stamm: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes Stamm 10403S (Bishop und Hinrichs, 1987) wurde in Difco Brain-Heart Infusion (BHI) Bouillon (BD Biosciences) mit 50 &; micro; g/ml Streptomycin bei 30 μC.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>gDNA-Abbau</td></tr><tr><td>cDNA-Synthesekit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA-Synthese</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R</td></tr> <tr><td></td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd</td></tr> <tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr> RpII_qRTPCR_rev <tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Green qRT-PCR Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, 7500 Software v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Listeria monocytogenes Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>Western-Blot-Anti-Aktin-Antikörper</td></tr>, <tr><td>hergestellt in Kaninchen</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>Western-Blot</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG (H+L), HRP-Konjugat</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>Western-Blot</td></tr></tbody></table>

extraktion von hemocytes aus drosophila melanogaster larven für mikrobielle infektionen und analyse

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Während die pathogenen Infektion von Drosophila Melanogaster, Rolle Hemocytes eine wichtige bei der Immunantwort in die Infektion. Ziel dieses Protokolls ist es daher, Entwicklung eine Methode um die Invasion der Erreger in einem bestimmten immun Fach fliegen, nämlich Hemocytes zu visualisieren. Mit der Methode, die hier vorgestellten, bis zu 3 × 106 live Hemocytes von 200 Drosophila 3rd Instar Larven in 30 min für Ex-Vivo -Infektion erhalten. Alternativ kann die Hemocytes infizierte in Vivo durch Injektion von 3rd Instar Larven gefolgt von Hemocyte Extraktion bis zu 24 h nach der Infektion. Diese infizierten Primärzellen gefixt, gebeizt und abgebildet mit der konfokalen Mikroskopie. Dann wurden aus den Bildern endgültig Erreger Invasion zeigen 3D-Darstellungen generiert. Darüber hinaus hochwertige RNA für die qRT-PCR für den Nachweis des Erregers mRNA folgenden erhalten werden Infektionen und ausreichend Protein aus diesen Zellen für Western-Blot Analyse extrahiert werden können. Zusammengenommen, präsentieren wir Ihnen eine Methode zur definitiven Versöhnung der Erreger Invasion und Bestätigung der Infektion mit bakterieller und viraler Erreger-Typen und eine effiziente Methode für die Extraktion von Hemocyte genug live Hemocytes von Drosophila zu erhalten Larven für ex-Vivo - und in-Vivo -Infektions-Experimente.

Zu sammeln Hemocytes für Ex-Vivo -Infektion, Leben bis zu 3 × 10 wurden 200 Drosophila 3rd Instar Larven6 Hemocytes entzogen. Um unsere Methode zu entwickeln, wurden eine Reihe von verschiedenen Techniken versucht. Einzelne Larven Dissektion bis zu 1,5 Stunden dauern würde wurden, und durchschnittlich ~ 8000 Zellen mit dieser Methode18, von denen meisten nicht bis zum Jahresende Sammlung noch am Leben waren. Als nächstes wir ...

Diese Methode zeigt, wie Erreger Invasion in Insektenzellen mit dreidimensionalen (3D) Modellen zu visualisieren. Hemocytes von Drosophila Larven infiziert wurden mit viralen oder bakteriellen Erregern, Ex Vivo oder in Vivo. Infizierte Hemocytes wurden dann fixiert und für die Bildgebung mit einem confocal Mikroskop und anschließende zelluläre 3D-Rekonstruktion befleckt.

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Diese Technik kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der zellulären Infektion und Mikrobiologie zu beantworten, z. B. wie Hämozyten zur allgemeinen Immunantwort bei Fruchtfliegen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Labor mit zuvor infizierten Larven durchgeführt werden kann. Alternativ können Hämozyten von nicht infizierten Larven für die ex vivo-Infektion verwendet werden.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Bildgebungsschritte aufgrund der Komplexität des konfokalen Mikroskops und der Möglichkeiten zur Rekonstruktion des 3D-Modells schwer zu erlernen sind. Um das Protokoll zu beginnen, schichten Sie zwei bis drei Stücke eines zehn mal zehn Zentimeter großen Paraffinfilms unter ein Stereomikroskop. Bereiten Sie anschließend die Glaskapillare vor, indem Sie die Kapillarpolarheizung auf maximal 55 % einstellen.Pole das Kapillarrohr auf eine scharfe Spitze von etwa zehn Mikrometern. Füllen Sie die Kapillare mit Mineralöl auf. Setzen Sie das gefüllte Kapillarrohr auf den Nanoinjektor.Und öffnen Sie die Spitze des verschmolzenen Kapillarrohrs, indem Sie die Spitze mit einer Pinzette abbrechen. Stoß

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Die Drosophila-Hämolymphe dient sowohl als Blut als auch als interstitielle Flüssigkeit und zirkuliert während des Larven- und Erwachsenenstadiums durch den Körper. Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Entnahme von Hämolymphlarven, um die zirkulierenden Zellen zu quantifizieren.

Störung der Nagelhaut: Eine Methode zum Sammeln von Hämolymphe aus Drosophila-Larven

Quelle: Hiroyasu, A., D et al., Extraktion von Hämozyten aus Drosophila melanogaster-Larven zur mikrobiellen Infektion und Analyse. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt das Verfahren, um eine bakterielle Infektion bei Drosophila-Larven zu etablieren, indem sie in einen bakteriellen Tropfen gesetzt und mit einer Wolframnadel gesticht werden. Die Larven werden dann auf einer gerillten, nährstoffreichen Agarplatte inkubiert, um die Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen zu untersuchen.

Etablierung einer bakteriellen Infektion bei Drosophila-Larven

Quelle: Hiroyasu, A., et al. Extraktion von Hämozyten aus Drosophila melanogaster-Larven zur mikrobiellen Infektion und Analyse. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert hochauflösende konfokale Bildgebung von Drosophila melanogaster-Hämozyten , die mit Coxiella burnetii infiziert sind, um die Lokalisierung von Erregern in 3D zu visualisieren und so eine detaillierte Analyse intrazellulärer Infektionsdynamiken und Wirts-Erreger-Interaktionen zu ermöglichen.

Hochauflösende konfokale Bildgebung von pathogen-infizierten Drosophila-Hämozyten

Dieses Video zeigt den Hämozytenstörungstest, der die erneute Adhäsion von Hämozyten in den hämatopoetischen Taschen von Drosophila-Larven bewertet. Mechanische Störungen setzen residente Hämozyten frei, wodurch die Anzahl der zirkulierenden Hämozyten erhöht wird. Nach der Genesung wird die erneute Adhärenz der residenten Hämozyten bestätigt, was die Reversibilität verdeutlicht.

Ein Hämozytenstörungstest zur Beurteilung der Readhäsion von Hämozyten an hämatopoetische Taschen

Drosophila melanogaster ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung des angeborenen Immunsystems und der physiologischen Folgen von Infektionen und Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt, wie robuste und quantitativ wiederholbare bakterielle Infektionen an D. melanogaster verabreicht werden können und wie der Schweregrad der Infektion anschließend gemessen und die Immunantwort des Wirts quantifiziert werden kann.

Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila-Blutzellen oder Hämozyten zirkulieren zwischen den ansässigen Stellen und der Zirkulation.  In der Larve sind residente (sitzende) Hämozyten in induktiven Mikroumgebungen, den hämatopoetischen Taschen, lokalisiert, während sich zirkulierende Hämozyten frei in der Hämolymphe bewegen. Das Ziel dieses Protokolls ist die standardisierte Isolierung und Quantifizierung dieser beiden verhaltensverschiedenen, aber sich gegenseitig verändernden Hämozytenpopulationen.

Untersuchung von Blut Zellpopulationen des<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Drosophila und Säugetieren hämatopoetischen Systeme haben viele gemeinsame Merkmale, Drosophila ein attraktives genetisches Modell machen Hämatopoese zu studieren. Hier zeigen wir Präparation und Lagerung des großen Larven hämatopoetischen Organ für die Immunhistochemie. Wir beschreiben Methoden auch verschiedene Larven hämatopoetischen Fächer einschließlich zirkulierenden Blutzellen und sessile-Zellen zu untersuchen.

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Dieses Protokoll beschreibt einen in-vivo Phagozytose Assay in Erwachsenen Drosophila Melanogaster , Phagozyten Anerkennung und Räumung von mikrobiellen Infektionen zu quantifizieren.

Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay

Dieses Protokoll beschreibt einen In-vivo-Test der Phagozytose zur Beurteilung und Quantifizierung der Fähigkeit junger und alter Drosophila melanogaster Hämozyten an Phagozytosebakterien..

Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay

Drosophila melanogaster erwachsene Fliegen wurden ausgiebig als Modellorganismen verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die antimikrobiellen angeborenen Immunantworten des Wirts und mikrobiellen Infektionsstrategien zugrunde liegen. Um das Larvenstadium von D. melanogaster als zusätzliches oder alternatives Modellsystem zu fördern, wird eine Larveninjektionstechnik beschrieben.

Drosophila melanogaster Larven-Injektionsprotokoll

Lernen Sie die Extraktion von Hämozyten aus Drosophila-Larven für mikrobielle Infektionsstudien. Diese Methode ermöglicht die 3D-Visualisierung von Pathogen-Invasionen in Immunzellen mittels konfokaler Mikroskopie.

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

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