Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

Diese Technik kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der zellulären Infektion und Mikrobiologie zu beantworten, z. B. wie Hämozyten zur allgemeinen Immunantwort bei Fruchtfliegen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Labor mit zuvor infizierten Larven durchgeführt werden kann. Alternativ können Hämozyten von nicht infizierten Larven für die ex vivo-Infektion verwendet werden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Bildgebungsschritte aufgrund der Komplexität des konfokalen Mikroskops und der Möglichkeiten zur Rekonstruktion des 3D-Modells schwer zu erlernen sind. Um das Protokoll zu beginnen, schichten Sie zwei bis drei Stücke eines zehn mal zehn Zentimeter großen Paraffinfilms unter ein Stereomikroskop. Bereiten Sie anschließend die Glaskapillare vor, indem Sie die Kapillarpolarheizung auf maximal 55 % einstellen.

Pole das Kapillarrohr auf eine scharfe Spitze von etwa zehn Mikrometern. Füllen Sie die Kapillare mit Mineralöl auf. Setzen Sie das gefüllte Kapillarrohr auf den Nanoinjektor.

Und öffnen Sie die Spitze des verschmolzenen Kapillarrohrs, indem Sie die Spitze mit einer Pinzette abbrechen. Stoßen Sie so viel Öl wie möglich aus der Spitze des Kapillarröhrchens aus und füllen Sie das Röhrchen dann mit Drosophila-Hämozyten-Isoliermedium (DHIM). Um die Grenze des hämolymphanischen Öls leicht sichtbar zu machen, fügen Sie eine Luftblase zwischen dem Öl und dem DHIM ein.

Entnehmen Sie mit einer Pinzette vorsichtig zehn Drosophila-Larven des dritten Stadiums von der Innenwand der Futterfläschchen und geben Sie sie in ein 100-Mikrometer-Sieb. Gießen Sie fünf Milliliter steriles Wasser auf die Larven und schütteln Sie das Sieb fünf Sekunden lang. Legen Sie das Sieb auf ein Tuch, um das überschüssige Wasser zu entfernen.

Übertragen Sie die Larven in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, betäuben Sie sie fünf Sekunden lang mit CO2-Gas. Legen Sie dann die Larven mit der Rückenseite nach oben auf einen Paraffinfilm unter dem Stereomikroskop. Legen Sie die Glaskapillare leicht auf den hinteren Körper der Larve, um sie an Ort und Stelle zu halten, und brechen Sie die hintere Kutikula mit einer feinen Zange auf.

Lassen Sie die Hämolymphe auf den Paraffinfilm fließen. Machen Sie einen Pool von Hämolymphe, einschließlich Hämozyten, von 20 bis 50 Larven auf einmal, auf dem Paraffinfilm. Verwenden Sie die Glaskapillare am Nanoinjektor, um die gepoolte Hämolymphe aufzunehmen.

Werfen Sie die Hämolymphe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern DHIM. Gib die Hefepaste auf eine Traubensaft-Agarplatte. Machen Sie einen feinen Schnitt in den Agar, wo die Larven wandern können, um ein Austrocknen zu vermeiden.

Montieren Sie eine 0,001 Millimeter lange spitze Wolframnadel mit Haltezange aus Paraffinfolie. Pipettieren Sie 50 Mikroliter mit hohem Titer, mCherry-exprimierendem C.Burnetii auf den Paraffinfilm unter dem Stereomikroskop und legen Sie die Larven in den Bakterienpool. Stechen Sie die Larven mit einer Wolframnadel ein.

Übertragen Sie die Larven auf eine Agarplatte. Übertragen Sie das restliche Erregermedium auf die Agarplatte und verschließen Sie die Platte mit Paraffinfilm. Halten Sie die Larven bis zur gewünschten Zeit nach der Infektion in feuchter Luft auf dem Teller.

Lassen Sie die mit C.Burnetii infizierten Larven 24 Stunden lang auf dem Teller. Platzieren Sie ein rundes 12-Millimeter-Deckglas in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte. Pipettieren Sie 500 Mikroliter DHIM in die Vertiefung.

Extrahieren und nehmen Sie Hämolymphe aus zuvor infizierten Larven auf, dann werfen Sie die Hämolymphe in die Vertiefung. Die Platte fünf Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren. Konfigurieren Sie das konfokale Mikroskop für die dreifarbige Bildgebung von DAPI, EGFP und mCherry.

Legen Sie die Probe auf das Mikroskop und fokussieren Sie die Probe mit einem Objektiv mit 63x 1,4 numerischer Apertur. Lokalisieren Sie die gewünschten Hämozyten im Sichtfeld für die Bildgebung. Passen Sie dann die Laserleistung und die Detektorverstärkung an, um die entsprechende Belichtung der Probe zu erreichen.

Überprüfen Sie mehrere Z-Ebenen, um sicherzustellen, dass die Belichtungsstufe für die gesamte Probendicke geeignet ist. Finden Sie als Nächstes die obere und untere Position auf der Z-Achse eines ganzen Hämozyten. Legen Sie diese Positionen als Start- und Endpositionen für den Z-Schnitt fest.

Verwenden Sie den Scan-Zoom, um den Bereich abzubilden, in dem sich der Hämozyten befindet. Erfassen Sie die Bildserien mit der entsprechenden Auflösung, z. B. 1024 x 1024 Pixel in der X-Y-Ebene und einem Abstand von 0,3 Mikrometern in der Z-Dimension. Importieren Sie die Datei mit den Z-Schnitten in die Software, die mit dem Konfokalmikroskop verknüpft ist, um das 3D-Modell zu rekonstruieren.

Wählen Sie eine Zell-Co-Lokalisation von Zellkernen, die mit DAPI und mCherry-exprimierendem C.Burnetii gefärbt wurden, in einem EGFP-exprimierenden Hämozyten. Schneiden Sie die Bildserie so zu, dass sie nur die einzelne Zelle enthält. Wählen Sie die Option 3D-Viewer, die das 3D-Modell mit dem vorgefertigten Algorithmus der Software rekonstruiert.

Wählen Sie den gewünschten Bildgebungstyp für die 3D-Darstellung zwischen den Optionen "Verschmelzen", "Oberfläche" und "Gemischt" aus. Bei dieser Methode werden Hämozyten, Zellkerne und C.Burnetii anhand von Oberflächenmodellen dargestellt. Betrachten Sie die rekonstruierte 3D-Zelle aus verschiedenen Betrachtungspositionen, indem Sie die Maustaste gedrückt halten und den Cursor über den Bildschirm ziehen.

Passen Sie die Zellenausrichtung und die Position der modellierten Lichtquelle an, um das Bild zu optimieren. Nehmen Sie schließlich Querschnitte durch das Modell mit Hilfe von Clipping- und Schnittbefehlen, um den inneren Inhalt des Hämozyten zu visualisieren. Die Visualisierung der extrahierten lebenden Hämozyten, die EGFP unter Kontrolle des Hämolektintreibers exprimieren, aus mehreren Bildern zeigt, dass die meisten DAPI-positiven Zellen auch EGFP-positiv sind.

Querschnitte von Coxiella Burnetii-infizierten Hämozyten bestätigen das Vorhandensein von mCherry-exprimierenden Bakterien im Inneren der Zelle. Die Bilder wurden in 3D-Modelle rekonstruiert und wir beobachteten, dass in vivo infizierte Hämozyten größere zytoplasmatische Ausdehnungen aufwiesen und flacher waren. Während ex vivo infizierte Hämozyten kugelförmiger waren.

Querschnitte beider Modelle bestätigen das Vorhandensein von mCherry-exprimierender Coxiella im Inneren der Zelle. Extrahierte Hämozyten wurden mit IIV6 infiziert und auf die qRT-PCR-Analyse angewendet, die signifikant höhere Spiegel des IIV6-193R-Transkripts zwischen Schein- und IIV6-infizierten Zellen zeigte. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Medien im Voraus vorzubereiten und auf Raumtemperatur auszugleichen, damit die Zellen nicht zu lange ohne die richtigen Nährstoffe sind.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die einzellige RNA-Suche, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Gesamtreaktion des Wirts auf eine Infektion. Nach ihrer Entwicklung hilft diese Technik Forschern in der Immunologie und Mikrobiologie, die Invasion von Krankheitserregern und die Wirtsreaktionen bei Fruchtfliegen oder anderen Tieren mit offenem Kreislaufsystem zu untersuchen.