Name: Eine Blut-basierte Test zum Nachweis von ROS1 und RET Fusion Transkripte von zirkulierenden Ribonukleinsäure mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Charakterisierung von zirkulierender RNA aus Blutproben mittels digitaler PCR. Diese Methode ermöglicht den Nachweis seltener Genfusions-Transkripte wie ROS1 und RET bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.

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Wir bedanken uns bei unseren Mitarbeitern, Stephen Jones, Nia Charrington, Dr. Dianna Maar und Dr. Samantha Cooper aus der Digital-Biologiezentrum (Bio-Rad Inc. CA) für ihre Test-Design zu unterstützen; Nezar Rghei und Dr. Moemen Abdalla (Norgen Biotek, Kanada) für kritische Beratung bei der Optimierung der RNA-Extraktion-Protokoll; und Shannon Campbell, Scott Thurston, Jeff Fensterer, Shannon Martello und Joellyn Enos Unterstützung bei testen Sie Anforderungen und kommerziellen Überwachung.

Den Anweisungen des Herstellers Folgen für die unten aufgeführten, Reagenzien, sofern nicht anders beschrieben. Die PCR-Assays sind im Handel erhältliche Produkte entwickelt, um ROS1 und RET Fusionen zu erkennen.
1. Arbeiten mit RNA in Vorbereitung auf Reverse Transkription (RT)-dPCR: beste Laborpraxis
<ol><li>Erstellen Sie eine RNase-freie Umgebung, beim Arbeiten mit RNA.<ol>
<li>Verwenden Sie handelsübliche Sprays kontaminierenden RNases inaktivieren sollen.</li>
		<li>Verwendung zertifizierter RNase-freie Reagenzien, Tipps und Röhren. Verwenden Sie Barriere Tipps für Nadeln, um Einführung von RNases oder Kreuz-Kontamination der Proben zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tragen Sie immer einen Laborkittel verhindern, dass Partikel von Kleidung in Ihrer Probe fallen. Benennen Sie eine Labor Mantel spezifische mit RNA-Verarbeitung verwenden.</li>
	<li>Tragen Sie Handschuhe um Probe Verunreinigungen von RNases in der Haut zu verhindern. Ändern Sie häufig Handschuhe. Hinweis: Davon ausgehen Sie, dass Labor Oberflächen mit RNase verschmutzt sind, da sie die Umwelt ausgesetzt sind. Handschuhe, die Berührung der Haut, Haare, Türklinken, Gefrierschrank Griffe, Stifte/Marker, etc. werden als nicht mehr RNase-freie angesehen.</li>
	<li>Nadeln, Arbeitsplatte, Zentrifugen und andere Arbeitsflächen mit einem RNase Inaktivierung Spray vor dem Gebrauch zu dekontaminieren.</li>
	<li>Wenn möglich, pflegen Sie eine Reihe von Geräten für den Einsatz mit RNA nur.</li>
	<li>Minimieren Sie Unterbrechung des Luftstroms in den Bereichen Labor, beim Arbeiten mit RNA-Proben, Partikel fallen in Proben oder Verunreinigung des Arbeitsbereichs zu verhindern.</li>
	<li>Store gereinigt RNA bei-80 ° c.</li>
	<li>Vermeiden Sie mehrere Einfrieren-Taut der RNA-Proben, da dies Verschlechterung führen kann.</li>
</ol>2. Generation der analytischen RNA-Material für die Positivkontrollen
<ol><li>Entwerfen Sie synthetischen DNA veröffentlichten mRNA-Sequenzen für Fusion Varianten von Interesse10verwenden.<ol>
<li>Wählen Sie für einen gegebenen Fusion-Variante eine mRNA-Fusion-Sequenz, die die Fusion Website plus ausreichend lang auf jeder Seite zur Deckung der PCR-Amplifikate flankierende enthält.</li>
		<li>Wählen Sie Nukleotidsequenzen zwischen 50-250 nt, die Größe des zirkulierenden RNA mit Thrombozyten angereichertem Plasma erfasst zu imitieren.</li>
		<li>Hinzufügen eine T7-Promotor-Sequenz (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 "), 5'-Ende der Zielsequenz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestellen Sie synthetische Sequenzen, wie doppelte gestrandete Desoxyribonukleinsäure (DNA) Fragmente.</li>
	<li>Bereiten Sie synthetischen DNA in Tris-EDTA (TE)-Puffer auf eine Endkonzentration von 10 ng/µL.</li>
	<li>Konvertieren Sie 60 ng synthetische DNA in RNA mit in-vitro- Transkription.</li>
	<li>RNA-Transkripte mit Phenol/Guanidin-basierte Reagenz12zu reinigen.<ol>
<li>Enthalten DNase I, RNase-freie, restliche Vorlage DNA zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konzentration des gereinigten in Vitro RNA mit einem handelsüblichen Fluorometer mit RNA-spezifische Farbstoffe und Standards zu messen. Sicherstellen Sie, dass die RNA innerhalb des Bereichs für den gewählten Standards akzeptabel ist. Verdünnung kann erforderlich sein.</li>
	<li>Bestätigen Sie erfolgreiche Transkription durch Gelelektrophorese mit ein 2 % Agarose-Gel gemischt mit RNA Gel Fleck und eine hohe Reichweite RNA Leiter einschließlich 50-250 nt Größenbereich.<ol>
<li>Belastung 500 ng des einzelnen in-vitro- RNA auf ein Gel.</li>
		<li>Führen Sie das Gel mit 5 V/cm.</li>
		<li>Visualisieren Sie einzelne Bands mit Beleuchtung zu und dokumentieren Sie die Ergebnisse.</li>
		<li>Bestätigen Sie die erwartete Transkript Größe für jede der Fusion-Varianten (basierend auf Design im Schritt 2.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erkennung von jedes in-vitro- RNA durch RT-dPCR mit aufeinander abgestimmten Variante-spezifische PCR Assay zu bestätigen (siehe Schritte 5 bis 8 des Protokolls).</li>
	<li>Optional: Bereiten Sie eine äquimolaren Mischung aus in-vitro- RNA, die jeweils von der Fusion-Varianten und die Kontrolle gen GUSB enthält.</li>
	<li>Wenn Schritt 2,9 durchgeführt wird: Erkennung von jeder der Fusion Varianten enthalten in der Steuerelement-Mischung von dPCR mit Variante-spezifische PCR-Assays (siehe Schritte 5 bis 8 dieses Protokolls) zu bestätigen.</li>
	<li>Ermitteln Sie gewünschte Eingabe Konzentration für analytische Positivkontrollen durch Konzentrationen von 0,25 bis 2,5 fg10Tests. Wählen Sie anhand der gewünschten Nummer Ausgabe Konzentration.</li>
	<li>Bereiten Sie nach der Bestätigung 10 µL Einweg-Aliquote analytische RNA für die Verwendung in der Positivkontrolle (Schritt 4.4) und bei-80 ° c vor.</li>
</ol>(3) Spender Exemplare
<ol><li>Sammeln Sie 10 mL menschlichen Vollblut-Proben in 10 mL Blutentnahmeröhrchen (BCT) mit Konservierungsstoff zellfreie RNA. Hinweis: Alle menschliche Spendern werden Einwilligung zur Nutzung zu erforschen und keine Spender-spezifischen identifizierenden Informationen werden gesammelt oder verwendet während des Tests.</li>
	<li>Vollblut-Proben vom BCT Hersteller angegebenen Zeitrahmen zu verarbeiten.</li>
	<li>Gepoolte normales Humanplasma kann eine kommerzielle Quelle für die Verwendung innerhalb der analytischen Positivkontrolle erhältlich. Bereiten Sie Einweg-, 1 mL Aliquots der gepoolten normales Humanplasma und bei-80 ° c für den Einsatz mit der Positivkontrolle (Schritt 4.4).</li>
</ol>4. Wiederherstellung des zirkulierenden RNA aus Plasma
Hinweis: Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, während dieses Vorgangs.
<ol><li>Zentrifugieren Sie Vollblut-Rohre bei 200 X g für 20 min.</li>
	<li>Sammeln Sie bis zu 4 mL Plasma aus zentrifugiert Blut Sammelrohr mit einer serologischen Pipette. Achten Sie darauf, nicht zu stören oder zu Aspirieren die buffy Coat-Schicht.</li>
	<li>Isolieren Sie zirkulierende RNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit, die exosomen, Thrombozyten und zellfreie RNA aus Plasma erfassen können. Isolieren Sie RNA von positive Kontrollprobe neben jeder Charge.</li>
	<li>
Bereiten Sie die positiv-Kontrolle für jede Charge von klinischen Proben wie folgt:
	<ol>
<li>Tauen Sie 1 mL gebündelt normales Humanplasma aliquoten (Schritt 3.3).</li>
		<li>Tauen Sie 10 µL analytische RNA aliquoten (Schritt 2,12).</li>
		<li>Bereiten Sie positive Kontrolle durch Zugabe von 10 µL analytische RNA in die normalen menschlichen Plasma-Probe, sobald das Plasma lysate Äthanol hinzugefügt worden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluieren Sie Proben mit 100 µL Nuklease-freies Wasser. Gehen Sie sofort Aufräumen mit RNA und Konzentration.<ol>
<li>Proben können auf nassem Eis gespeichert und für bis zu eine Stunde abgedeckt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA mit Spalte basierend Methode zu konzentrieren und eluieren in 9 µL RNase-freies Wasser.<ol>
<li>Gehen Sie sofort zu Schritt 5, oder halten Sie Proben auf nassem Eis bis zu einer Stunde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) reverse Transkription von RNA in cDNA
<ol><li>Konvertieren Sie konzentrierten zirkulierenden RNS-Probe in cDNA mit einem handelsüblichen reversen Transkription Reaktion Kit, einschließlich zufällige Primer (siehe Tabelle 1 für Komponenten). Hinweis: Gen-spezifische Primer sind optional und können für Testvarianten ausgelegt werden. Primer sind anhand der Ziel-RNA-Sequenz ausgelegt. Verwenden Sie Fusion Variante Sequenzen aus Schritt 2.1.<ol>
<li>Enthalten keine Reverse-Transkriptase-Kontrollprobe und keine RNA-Kontrollprobe (siehe Tabelle 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>CDNA aus reverse Transkription Reaktion unter Verwendung einer handelsüblichen DNA-Konzentrator Spin Spalte zu isolieren. Hinweis: Dieser Schritt erleichtert die Entfernung von Enzymen, Primer und kostenlose Deoxynucleotide Triphosphate (dNTPs).</li>
	<li>CDNA in PCR-Reaktionen sofort verwenden oder bei-80 ° c lagern.</li>
</ol>6. digitale PCR
Hinweis: Diese PCR ist spezifisch für Tröpfchen digitale PCR (siehe Tabelle der Materialien).
<ol><li>
PCR Mischung Vorsichtsmaßnahmen.
	<ol>
<li>Tragen Sie ein Einweg-Labor Mantel und Nitril-Handschuhe.</li>
		<li>Verwendung PCR mix Reagenzien in einem dedizierten Reagenz-Vorbereitungsbereich. Umgehen Sie cDNA in der nur-Reagenz-Vorbereitungsbereich nicht.</li>
		<li>Decken Sie Sonden beim Arbeiten, um sie vor Licht zu schützen. Übermäßig viel Licht kann Foto bleichen die fluoreszierenden Farbstoff an der Sonde befestigt.</li>
		<li>Mixe, abgedeckt und vor Licht geschützt, in einem separaten Bereich der Vorverstärkung vor cDNA ist hinzugefügt werden.</li>
		<li>Fügen Sie cDNA zu prüfenden PCR Mischung in einer PCR cleane Motorhaube in Vorverstärkung Gegend gelegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eine abschließende Reaktionsvolumen von 20 µL nach Tabelle 2PCR Mischungen vorbereiten.</li>
	<li>Verteilen Sie PCR Mischungen + cDNA, PCR-Platten. Hinweis: Verwenden der Layoutbreite Platte wie ein Reiseführer empfohlen wird.</li>
	<li>Decken Sie die Platte mit einer abnehmbaren Platte Versiegelung ab.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Platten kurz zum Proben an der Unterseite der Brunnen zu sammeln.</li>
	<li>Mix auf Platte Shaker auf eine niedrige Einstellung für 10 s.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Platten kurz zur Probe an der Unterseite des Brunnens zu sammeln.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte Sealer. Durchführen Sie Tröpfchen-Generation für PCR cDNA-Mix mit entweder eine manuelle oder automatisierte Droplet-Generation-System.<ol>
<li>Übertragen Sie für manuelle Tröpfchen Generation 20 µL PCR Mischung zum Beispiel Brunnen auf das Droplet Generation Patrone. 70 µL Tröpfchen Generation Öl hinzufügen. Deckel mit Kautschuk Dichtung und Transfer Patrone, manuelle tropfengenerators, Tröpfchen Generation zu initiieren. Übertragen Sie nach Tröpfchen Generation Tröpfchen auf ein frisches PCR-Platte mit Tipps vom Hersteller empfohlenen. Aspirieren und verzichten die Tröpfchen langsam, über 5 bis 6 s jeweils ohne die Öffnung der Spitze an den Tröpfchen Patrone oder Platte.</li>
		<li>Für automatisierte Droplet-Generation die Dichtplatte mit folienversiegelung und Übertragung auf das Droplet-Generator. Alle Tipps, Patronen, zu gewährleisten und Platten sind vor Beginn der Tröpfchen-Generation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Folgenden Tröpfchen Erzeugung und Übertragung von Tröpfchen mit einer frischen PCR Platte Siegel mit Folie Platte Siegler und thermischen Zyklus Platten mit den Einstellungen in Tabelle 3.</li>
	<li>Nach der Thermocycler läuft komplett, die Platte mit einem Tröpfchen-Reader zu lesen. Erstellen Sie eine Platte Layout für Reader-Software, die die Position der Steuerelemente, Proben, etc., identifiziert und Last in Software zu lesen beginnen.</li>
</ol>7. Daten Analyse und Überprüfung und Generierung von Ergebnissen
<ol><li>Analysieren Sie Platte lesen Ergebnisse mit im Handel erhältlichen Software.</li>
	<li>Navigieren Sie zum Menü "Analyze" zweidimensionale (2D) Amplitude Grundstücke anzeigen.</li>
	<li>Bewerten Sie die Qualität der Daten anhand der Tröpfchen-Daten.<ol>
<li>Werten Sie die Daten für insgesamt akzeptierten Ereignis-IDs über Menü "Veranstaltungen". Wenn es weniger als 10.000 Ereignisse pro Bohrloch, prüfen Sie sorgfältig die Daten für zusätzliche Probleme.</li>
		<li>Überprüfen Sie Daten für aberrante Fluoreszenz Amplituden. Bedeutende Amplitude und Konzentrationsunterschiede zwischen replizieren Proben zeigen schlechte Verarbeitung oder Vermischung der Proben.</li>
		<li>Machen Sie sich Notizen von Tröpfchen Clustern mit Spritzbilder auf einer 45-Grad-Achse, was bezeichnend für schlechte Qualität Tröpfchen oder problematische Proben.</li>
		<li>Untersuchen Sie zunächst Positivkontrolle, No Reverse Transkriptase (No RT) und No-RNA-Kontrolle (NRC) Daten. Wählen Sie alle Kontrollproben und untersuchen Sie Cluster Qualität von 2D Grundstück. Für richtige Schnittstellenüberwachung sollte eine klare Trennung zwischen den Clustern Tröpfchen ersichtlich sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für jede Probe setzen Variante, Sie den Schwellenwert basierend auf Kontroll-Vertiefungen.<ol>
<li>Festgelegten Schwellenwerte auf 2D Plots mit dem Fadenkreuz-Werkzeug, um die doppelte Verneinung Tröpfchen Bevölkerung aus der Kontrollgruppe gen (beschriftet mit 5'-Hexachloro-Fluorescein-CE phosphoramidit-Sonde), y-Achse und variant gen Bevölkerung zu trennen wenn präsentieren) beschriftet mit Fluorescein Amidite OR 6-Carboxyfluorescein Sonde), x-Achse.</li>
		<li>Summe aus jedes Replicate gut für ein einzelnes Sample kopiert.</li>
		<li>Express-Testergebnisse als die Anzahl der Varianten Kopien erkannt. Hinweis: Den analytischen cutoff Wert für den Aufruf einer positiven oder negativen Probe bestimmen ein normales laufen gesunden Spenders Probe (mindestens 10 Einzelproben) über das abgeschlossene Verfahren festgelegt und etablieren die Cutoff über nachweisbaren Hintergrundsignal für die Mutation von Interesse. Darüber hinaus legen Sie die Anzahl der Kontrolle gen Kopien benötigt, um ein positives oder negatives Ergebnis nennen. Kontrolle gen Grenzwertes fungiert als eine interne Qualitätskontrolle (QC) zu bewerten, die Quantität und Qualität jeder einzelnen RNA-Probe, die verarbeitet wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Überprüfung der RT-dPCR Reaktionsbedingungen mit Zelllinien (Optional)
<ol><li>Zur Erkennung von Fusion Varianten zu überprüfen, verwenden handelsübliche Zelllinien mit dem Ausdruck der ROS1 oder RET Fusion mRNA von Interesse. Gehen Sie folgendermaßen vor:<ol>
<li>Blitz-gefrorenen Zellen in einer Lyse Guanidinium-basierte Lösung direkt aus dem gefrorenen Zustand zu homogenisieren. Sogar kurze Auftauen vor der Homogenisierung kann dazu führen, dass RNA-Abbau und Verlust.</li>
		<li>Isolieren Sie RNA mit Silikon-Membran Spin Spalten für RNA konzipiert.</li>
		<li>Messen Sie die Konzentration von RNA-Proben mit einem Fluorometer mit RNA-spezifischen Reagenzien und Standards.</li>
		<li>Verdünnen Sie isolierten RNA in einen Hintergrund der Wildtyp RNA aus Plasma oder eine andere kommerzielle Quelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Schritte aus Reverse Transkription von RNA in cDNA, digitale PCR und Datenanalyse und Überprüfung und Generation der Ergebnisse aufgelistet in diesem Protokoll Erkennung der gewünschten Variante zu bestätigen.</li>
</ol>

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</ol>

H.M, l.j., k.a. und g.a.p. sind Mitarbeiter und Aktien in Biodesix, Inc. H.M, L.J und g.a.p. sind Co-Erfinder auf eine Patentanmeldung durch Biodesix, für ein diagnostisches Testsystem zum Nachweis von zirkulierenden genetische Varianten in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.

RET und ROS1 Rearrangements bilden zusammen ~ 3 % der Mutationen innerhalb der NSCLC Bevölkerung18Fahrer. Obwohl selten, ist die Erkennung dieser genetischen Veränderungen entscheidend. NSCLC-Patienten mit diesen Änderungen können profitieren von zielgerichteten Therapeutika, die speziell die aberrante Kinase-Aktivität hemmen, die ergibt sich aus der Onko-Protein-13. Einige solcher Therapien sind bereits zugelassen von der FDA für den Einsatz in ROS1 positiven NSCLC, während andere nachgewiesen wirksam gegen RET in klinischen Studien19sein.
PCR-Digitaltechnik bietet Sensibilität, die ideal für flüssigbiopsie Anwendungen20ist. Es gab erhebliche Verbreitung dieser Technologie für den Einsatz mit zirkulierenden zellfreie DNA für die Messung von Tumor-Mutationen bei Patienten mit NSCLC4,6,21,22,23 . Neben Blut entwickelten wir ein Protokoll für robuste Messung der am weitesten verbreitete Fusion Varianten bei Patienten mit NSCLC von zirkulierenden Tumor RNA (Abb. 1A)10.
Unsere etablierte Protokoll ermöglicht analytischen Grenzen der Erkennung auf 0,2 % (Abbildung 2). Während der RT-dPCR sehr spezifisch und sensitiv ist, beschränken sich die Assays auf das Panel von bekannten Fusion-Varianten, die ausgewählt und gemultiplext zur Erkennung in der PCR-Test. Fusionen in Multiplex-Assays aufgenommen werden müssen so sorgfältig ausgewählt werden, um eine ordnungsgemäße Abdeckung innerhalb der Population von Patienten mit NSCLC gewährleisten. Wir haben erfolgreich Assays für RET und ROS1, die gleichzeitig acht Fusion Varianten Resultante von Umstellungen der RET oder ROS1 Loci zu erkennen und decken 99 % und 88 % der RET und ROS1 positiven Bevölkerung, bzw. entwickelt (Abbildung 1B-C )17.
Der Abschlusstest Workflow wie in dieser Studie beschrieben umfasst Batch Kontrollen zur Gewährleistung der Konsistenz der Ergebnisse. Diese Steuerelemente umfassen einen positiven analytische Standard sowie zwei negative Kontrollen, die gemeinsam dafür, dass es keine Kontamination oder PCR-Hemmung sorgen, die innerhalb der Charge (Abbildung 3). Um die Robustheit des Tests zu gewährleisten, wurde eine Studie durchgeführt mit der Batch-Steuerung über einen Zeitraum von 21 Tagen (Abbildung 3D, H). Diese Daten zeigen die Konsistenz des RNA-Prozesses, da innerhalb dieses Protokolls eingerichtet.
Gute Laborpraxis und angemessenen Umgang mit RNA sind Schlüsselkomponenten robuste und exakte Ergebnisse zu gewährleisten. Laborfläche und spezielle Ausrüstung mit RNA, Reinigung der Geräte nach jedem Gebrauch, mit RNase-freie Reagenzien und Verbrauchsmaterialien und eine RNase-Inaktivierung-Spray auf der Arbeitsoberfläche, die alle dazu beitragen, kontaminierenden RNases anzuwenden. Gewissenhafter Umgang mit RNA-Proben von Technikern, einschließlich einen dedizierten Laborkittel, häufige Handschuh, schnell durch die RNA-Extraktion-Verfahren arbeiten und halten Proben auf Eis sind von größter Bedeutung für die Erhaltung der Integrität der Probe. Sobald RNA transkribiert, cDNA umgekehrte gewesen ist, wird die Probe in stabiler Form, die weniger anfällig für Abbau. Neben der Praktiken, die Integrität der RNA zu unterstützen, werden PCR-Komponenten und Proben aufrechterhalten in getrennten Bereichen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, die zu falsch positiven Ergebnissen führen könnte. Lager PCR Reagenzien und Vorbereitung der PCR master Mix sollte getrennt von PCR Vorlagen gehalten werden und großer Sorgfalt ergriffen werden aus allen vorverstärkt Materialien einschließlich Reagenzien, RNA und DNA-Proben, verstärkte Vorlage (Post-PCR) zu trennen. Zu guter Letzt ist korrekte Generierung und Abwicklung von emulgierten PCR Mischungen vor Verstärkung von zentraler Bedeutung zur Erhaltung Tröpfchen Integrität und optimale dPCR Bedingungen. Während der Ausführung dieses Protokolls, konsistente und genaue Ergebnisse zu erzielen sind Vorsichtsmaßnahmen wie diese kritisch. Alle Daten sollten sicher sein durch geschultes Personal vor der Veröffentlichung der Ergebnisse untersucht werden, traf alle QC-Metriken. Bei suboptimalen Ergebnissen (Abbildung 4) die Charge überprüft werden, durch technisches Personal und der Laborleiter und erneute Verarbeitung erfordern.
RT-dPCR Ergebnisse können bereits 24 Stunden nach Probeneingang und 95 % der Ergebnisse in das Testset in dieser Studie verwendeten hergestellt werden (n = 984) wurde berichtet, der Bestellung Arzt in weniger als 72 Stunden ab dem Zeitpunkt des Eingangs (Abbildung 5). Dieser Turn-around-Zeit bietet Ärzten mit viel benötigt molekularen Informationen in einem Zeitrahmen, die Einleitung einer entsprechenden Therapie ermöglicht. Diese Ergebnisse stehen in der Regel früher als jene, die mit einem herkömmlichen Gewebeentnahme. Weitere Biomarker für NSCLC und anderen Krebsarten mit ähnlichen zirkulierenden RNA-basierten Ansätzen entwickelt werden könnte und würde profitieren von den gleichen schnellen Zeit-zu-Ergebnissen. Messung der programmierten Tod Liganden 1 (PD-L1) mRNA Abschrift mit RT-dPCR konnten beispielsweise Ärzte über Immuntherapie Optionen informieren. Außerdem gibt es ein wachsendes Interesse an den Nutzen des flüssigen Biopsie und dPCR bei der Überwachung der therapeutischen Wirksamkeit. Früheren Angaben von Wiederauftreten des Tumors mit genomischen Tests für bestimmte Varianten könnte Ärzten erlauben, Behandlungsschemata anpassen, bevor Patienten vom Standard der Pflegemaßnahmen wie imaging24symptomatisch sind. Protokolle wie berichtet in dieser Studie sind ideal für Überwachung aufgrund ihrer nicht-Invasivität, Empfindlichkeit, schnelle Turn-around-Zeit und Preis-/Leistungsverhältnis. Die hier beschriebene Test liefert Ergebnisse innerhalb von 72 Stunden nach Probeneingang, mit minimalen falsch-Positive Erkennungsraten, die rasche Behandlungsentscheidungen erleichtert und umgeht einige Einschränkungen mit Gewebe-basierten Test4erlebt.
Unser Protokoll und Daten zeigen eine robuste Testsystem zur Identifizierung von niedrigen Fülle RNA Varianten sowie das Potenzial für blutbasierte Mutation Tests in der klinischen Praxis. Für jene Patienten, die nicht über eine nachvollziehbare Fahrer nähert Mutation identifiziert durch schnelle gezielte flüssigbiopsie wie dieser, die Zugabe von umfassender Genom und Proteom aus Gewebe und Blut testen noch breiteren klinische Informationen liefern kann Behandlungsplanung zu unterstützen.

Bis zu 25 % der nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) können Patienten nicht ausreichend Gewebe für den Test zum Zeitpunkt der Diagnose haben. Selbst in Fällen, in denen Gewebe verfügbar ist, kann es nicht genügend Quantität oder Qualität durchführen molekularbiologische Tests1,2empfohlen werden. In Fällen wo es genügend Gewebe aus einer Biopsie für die molekulare Profilierung, Patienten müssen mehrere Wochen oder länger auf Ergebnisse warten, oder beginnen Sie die Behandlung ohne Molekulare Ergebnisse3,4. Allerdings ist es wichtig, dass informative molekulargenetische Diagnostik zur Verfügung gegeben das Aufkommen von mehrere gezielte Behandlungsmöglichkeiten für Patienten mit NSCLC. Testen der zirkulierenden zellfreie DNA (Blut) aus flüssigen Biopsie ist eine Lösung für die Herausforderungen der traditionellen Gewebe testen4,5,6. Aktuelle Testoptionen für umsetzbare Mutationen in NSCLC mit Blut und eine ähnliche dPCR-basierten Workflow für schnelles Ergebnis Generation gehören die epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) Sensibilisierung der Mutationen ΔE746-A750 und L858R, EGFR Widerstand Mutation T790M , KRAS protoonkogenproduktes (KRAS) Varianten und B-Raf protoonkogenproduktes (BRAF) Variante V600E. Obwohl nicht so weit vom Feld verabschiedet, bieten im Umlauf Tumor-abgeleitete Boten-RNA (mRNA) isoliert aus flüssigen Biopsie auch wichtige klinische Informationen7,8,9. Wir haben zuvor entwickelt und berichtete über Multiplex Nachweismethoden der Echinodermen Mikrotubuli Associated Protein wie 4-anaplastische Lymphom-Rezeptor-Tyrosin-Kinase (EML4-ALK) Fusion Varianten von Blutplasma10. In dieser Studie haben wir diese Methoden, um höherer Ordnung gemultiplexten RNA ROS1 und RET, für acht Fusion Varianten innerhalb jedes Assay gehören erweitert. Ziel war es, eine schnelle, sensitive, spezifische und reproduzierbare Technik zum Nachweis dieser Fusion-Varianten aus dem Plasma von zuvor diagnostizierten Patienten mit NSCLC zu entwickeln.
Der Test wird in einer Arztpraxis mit RNA stabilisiert Blut Sammlung Röhren11eingeleitet. Diese Rohre enthalten eine Zelle Konservierungsmittel sowie RNase-Hemmer. Proben sind gelieferte Priorität über Nacht auf die zentralisierte College der amerikanischen Pathologen CAP akkreditiert/klinische Labor Verbesserung Änderungsanträge (CLIA)-zertifizierten Labor (Clinical Laboratory) für die Verarbeitung durch kompetentes Personal. Sobald das klinische Labor erhalten, wird jeder Schritt der Verarbeitung unter zugelassenen Standard Operating Procedures (SOP) durchgeführt. Vollblut wird zentrifugiert, um Plasma, zu erholen, die dann verwendet wird, zu isolieren, zirkulierenden RNA, die entweder frei im Blut oder in Kapseln Moieties, z. B. exosomen und Blutplättchen7,8,9. Zur Isolierung von RNA aus diesen Fächern wählten wir das System für die RNA-Wiederherstellung basiert auf dem Vergleich der verschiedenen Extraktionsmethoden. Die isolierte RNA ist konzentriert und umgekehrt in cDNA umgeschrieben. Verschiedene Enzyme Reverse Transkriptase und gen-spezifische Primer wurden bei der Optimierung der cDNA Synthese Methode, um zu maximieren ROS1 und RET Ziel Transkript Konvertierung10bewertet. Dies ist wichtig für niedrige Fülle Protokolle, wie z. B. Tumor-abgeleitete Fusion Varianten im Umlauf. Zu guter Letzt haben wir optimiert dPCR Primer und Sonde Konzentrationen für Multiplex Erkennung von RET oder ROS1 Fusion-Varianten und das Steuerelement gen, Glucuronidase-β (GUSB) ermöglichen. Vor der Durchführung der analytische Validierungsstudien in diesem Bericht beschriebenen wird dann die besten Bedingungen von jedem der Optimierungsstudien zu gesperrten Schlussprotokolls zusammengefasst. Dieses Protokoll und diese Ergebnisse bilden die Grundlage für eine rasche und sensible Workflow für den routinemäßigen Nachweis von seltenen Fusion Varianten im Umlauf.

eine blut-basierte test zum nachweis von ros1 und ret fusion transkripte von zirkulierenden ribonukleinsäure mit digitalen polymerase-kettenreaktion

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

Wir haben neue Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von Tumor-abgeleitete zirkulierenden Ribonukleinsäure (cRNA) für Blut-basierten flüssigen Biopsie entwickelt. Robuste Erkennung von cRNA erholte sich von Blut stellt eine Lösung für ein kritischer ungedeckter Bedarf in der klinischen Diagnostik. Der Test beginnt mit der Sammlung von Vollblut in Blutentnahmeröhrchen, enthält Konservierungsstoffe, die cRNA stabilisieren. Zellfreie, Exosomal und Thrombozyten-assoziierter RNA ist in diesem Testsystem aus dem Plasma isoliert. Die cRNA ist umgekehrt zu komplementären DNA (cDNA) transkribiert und verstärkt mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR). Proben werden für die Ziel-Biomarker sowie ein Steuerelement gen ausgewertet. Testvalidierung enthalten maximal Erkennung, Genauigkeit und Robustheitsstudien mit analytischen Proben. Als Ergebnis dieser Studien reproduzierbar entwickelte Methode erkennen mehrere Fusion Varianten für ROS1 (C-Ros protoonkogenproduktes 1; 8 Varianten) und RET (neu geordnet, während Transfektion protoonkogenproduktes; 8 Varianten). Die Beispiel-Verarbeitung-Workflow wurde optimiert, damit Testergebnisse konsequent innerhalb von 72 Stunden nach Probeneingang generiert werden können.

Dieses Protokoll beschreibt ein Testsystem zum Nachweis von RNA-Fusion-Varianten für den Einsatz bei der Messung der Fahrer Mutationen innerhalb des Plasmas von NSCLC-Patienten (Abb. 1A) entwickelt. Fusion-mRNA, die Produkte aus dem Ausdruck der häufigsten RET und ROS1 Umstellungen in der NSCLC Bevölkerung wurden identifiziert,13,14,15,16,17. Multiplex PCR-Assays wurden dann entwickelt, um die acht am häufigsten Transkript Varianten für jedes Ziel in NSCLC innerhalb einer einzelnen Reaktion zu erkennen. Die am häufigsten verwendeten Translokationen bei ROS1 Locus generieren Assoziationen an die 5' Teile der CD74, SDC4, SLC34A2, EZR oder TPM3 Gene (Abbildung 1B). Die am häufigsten verwendeten Translokationen bei der RET -Lokus führen zu Gegenüberstellung mit KIF5B, wofür deckt der Test sechs Exon Kreuzungen. Weitere RET -Partner, die behandelt werden sind diejenigen mit CCDC6 und TRIM33 (Abbildung 1C). Insgesamt decken die Assays ca. 88 % der ROS1 und 99 % der RET-Änderungen in der NSCLC Patientenpopulation17verbreitet.
Die Spezifität des Assays Komponenten war zunächst mit acht einzelnen in-vitro- RNAs, die die mRNA-Sequenz enthalten, für die Fusion Protokolle fallenden ROS1 oder RET Assays gemultiplext ausgewertet. Jede RNA-Spezies wurde gegen jede einzelne Variante Assay getestet, die die gebündelte Version umfasst. Gab es keine Kreuzreaktivität diese Assays, bewiesen damit 100 % analytische Spezifität innerhalb des gestalteten gemultiplext Assays (Daten nicht gezeigt). Um die untere Grenze der Erkennung von Prüfprotokoll zu ermitteln, wurden Gesamt-RNS abgeleitet von Zell-Linien mit dem Ausdruck einer Fusion-Variante in der Probe enthalten in einen Hintergrund des normalen RNA bei 5 %, 1 %, 0,2 % und 0,04 % Konzentrationen gemischt. Die Multiplex RET und ROS1 Variante PCR-Assays weniger als 0,2 % Fusion Variante (Abbildung 2A-B) erkannt. Darüber hinaus eine Vorbereitung von 5 % Ziel Zelllinie abgeleiteten RNA (Ausdruck eine EML4-ALK-Fusion-Transkript) nicht mit der gemultiplexten ROS1 und RET Assays erkannt wurde weiter demonstrieren Spezifität (Abbildung 2A-B).
Präzision des RT-dPCR Prozesses Tests wurden für beide ROS1 und RET Analytic Kontrollmaterial bestehend aus äquimolaren in-vitro- RNAs in drei Konzentrationen (hoch, Mittel und niedrig) durch reverse Transkription und dPCR auf drei verarbeitet wurde verschiedene Anlässe innerhalb des gleichen Tages (Intra-Day), an drei aufeinanderfolgenden Tagen (Inter-Tag) und mit zwei Operatoren (Inter-Operator). Ergebnisse aus Präzision Tests zeigten präzise Erkennung von der Fusion Abschrift von Interesse sowie eine Kontrolle gen, GUSB, die als eine interne QC-Metrik (Abbildung 2-D) enthalten ist.
Neben der internen Steuerung GUSB wurde jede Charge von klinischen Proben mit einem Satz von Steuerelementen Batch ausgeführt. Positivkontrolle wurde aus einer Mischung von analytischen in Vitro RNA, die jede der Fusion-Varianten getestet in RT-dPCR vertreten, sowie analytische in Vitro RNA für entwickelt GUSB. Diese RNA in normalen menschlichen Plasma lysate während der RNA-Extraktion gespickt war und neben der klinischen Proben im gesamten Protokoll verarbeitet wurde. Die keine Reverse Transkriptase (No RT) Kontrolle wurde eine Negativkontrolle zu bestätigen das Fehlen von kontaminierenden Material in der RNA-Extraktion-Workflow und demonstrieren die Spezifität der Primer für RNA. Das No RT-Steuerelement generiert wurde, mit dem gleichen Material wie die positive Kontrolle, aber Enzym innerhalb der cDNA Synthese Reaktion ist nicht enthalten. Der keine RNA-Steuerelement (NRC) ist ein negativ, das Fehlen einer Kontaminierung Transkripte in der reversen Transkription reaktionskomponenten zu bestätigen. Dieses Steuerelement in den Workflow bei der cDNA Synthese Schritt eingeführt wurde, und Wasser war in der Reaktion statt einer RNA-Vorlage hinzugefügt. Nr. RT und NRC Steuerelemente müssen negativ sein, in beiden Kanälen, wenn genaue Ergebnisse geliefert werden sollen. In Tabelle 1 sind die reverse Transkription reaktionskomponenten für jedes Steuerelement. Beispiele für die 2D Grundstücke für jedes dieser Steuerelemente sind für die ROS1 (Abbildung 3 A-C) und RET (Abbildung 3 E-G) Multiplex-Assays. Fusion-Varianten wurden mittels Fluorescein Amidite (FAM) Sonde erkannt und werden entlang der y-Achse dargestellt, während das Steuerelement gen, GUSB, mittels 5'-Hexachloro-Fluorescein-CE phosphoramidit (HEX) Sonde erkannt wurde und ist auf der x-Achse. Diese Batch-Steuerelemente wurden im Laufe der 21 Tage, um festzustellen, Assay Robustheit bewertet. Fusion positive Tröpfchen und GUSB Kontrolle gen Tropfen wurden ROS1 und RET in allen 21 Läufen ausgeführt im Laufe der Studie (Abbildung 3D, H) beobachtet. Alle Negativkontrollen (No RT und NRC) hat negative Ergebnisse ergeben, über die ganzen 21 Tage (Daten nicht gezeigt).
Die Fähigkeit zu beheben ist ein wichtiger Bestandteil jeder Test-Protokoll in der klinischen Laborumgebung ausgeführt werden. Hier bieten wir praktische Beispiele von Sub-optimale Ergebnisse mit dem RT-dPCR Protokoll. Die erste ist eine Beispiel-2D-Handlung zeugt von der Bedeutung des keine Reverse-Transkriptase-Steuerelements (Abb. 4A). In diesem Beispiel waren mutierte positive Tröpfchen anwesend, obwohl gab es keine cDNA-Konvertierung aufgrund des Fehlens von Enzym. Dieses Ergebnis war wahrscheinlich wegen dPCR Primer Ziel genomischen DNA verstärken. In diesem Fall wird Design ein Intron-spanning Assay Amplifikation genomischer DNA verhindern. Alternativ ein RNase-freie DNase-Enzym kann verwendet werden, um die kontaminierende DNA zu beseitigen, aber dies wird nicht empfohlen für die Erkennung von seltenen Ziele, wie einige RNA-Abbau während der Inkubation mit dem Enzym auftreten. Das nächste Beispiel 2D Grundstück war ein NRC mit positiven Tröpfchen in beiden Kanälen (Abbildung 4B). Dies Kontamination zu einem bestimmten Zeitpunkt in der RT-dPCR Einrichtung. In diesem Fall empfiehlt es sich, alle potentiell kontaminierten Reagenzien in der Prüfung zu verwerfen, gründlich alle Geräte zu dekontaminieren und Testwiederholungen mit frischen reaktionskomponenten. Das dritte Beispiel 2D Grundstück als ein Spray von Tröpfchen entlang einer 45°-Linie (Abb. 4C) dargestellt. Dies wird oft durch Schneiden und Zusammenfügen von Tröpfchen verursacht. Sorgfältige Handhabung vor Temperaturzyklen Tröpfchen ist wichtig, da Tröpfchen anfällig für Beschädigungen sind. Wir empfehlen die Verwendung von automatisierten Droplet-Generation, wenn verfügbar. Wenn Tröpfchen Übertragung manuell generiert werden, seien Sie sicher, wählen die empfohlene weite Bohrung Tipps und vorsichtig pipettieren Technik zu beschäftigen. Tröpfchen-Übertragung erfordert langsam Aspiration und Dosieren, mit jeder statt mehr als 5-6 Sekunden, und es ist wichtig, dass die Pipette Tipp Öffnung nicht die Tröpfchen-Patrone berühren oder gut. Bei der Abgabe, halten Sie die Pipettenspitze auf den Flüssigkeitsstand und erhöhen Sie es langsam zu, wie Tröpfchen verzichtet (Demo video ansehen). Das endgültige 2D Plot-Beispiel zeigt einen Mangel an Trennung zwischen den positiven und negativen Droplet-Populationen (Abbildung 4). Dies kann mehrere Ursachen haben. Strong PCR-Inhibitoren, wie z. B. Waschmittel in Lyse Puffer und ein Übermaß an stark geschädigter DNA, können der Trennung verloren gehen. In diesem Fall erwägen Sie, einen Bereinigung Schritt zwischen cDNA Synthese und dPCR (wie in Schritt 5 dieses Protokolls beschrieben). Zu guter Letzt kann fehlende Trennung auch sub-optimale Verstärkung bedingt, und Optimierung der PCR Schritt sollten ebenfalls berücksichtigt werden.
Daten in Abbildung 5 sind 984 realen Patienten probieren Sie Turn-around-Zeiten und zeigt die schnelle Natur dieses Test-Workflows. Ergebnisse wurden an den behandelnden Arzt so früh als innerhalb von 48 Stunden (79 % der Fälle) von Probeneingang und in 95 % der Fälle innerhalb von 72 Stunden berichtet. Zusammenfassend kann die Verwendung von bieten stabilisiert zirkulierenden RNA Blutentnahmeröhrchen, optimierte RNA-Extraktionsverfahren aus Blut und RT-dPCR laufen nach ein optimiertes Protokoll mit den entsprechenden internen und Batch-Steuerung, ein Schnelltest-System für die präzise Erkennung von Fusion RNA Varianten bei NSCLC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2.jpg"> Abbildung 1 : Überblick über Blut Verarbeitung Beispielschritte für Fusion Variante Erkennung bei NSCLC spezifisch Assays für die am meisten verbreiteten RET und ROS1 Varianten. (A) Stichproben wird eingeleitet, wenn Vollblut gezogen und ein BCT ist innerhalb der Probe Sammlung Kit im klinischen Labor versandt. Zirkulierenden RNA wird aus mehreren Quellen innerhalb der Thrombozyten angereichertem Plasma gewonnen, Rückseite mit Gen spezifische Priming transkribiert und für den Einsatz in dPCR gereinigt. Proben werden verarbeitet, mit einem im Handel erhältlichen System bestehend aus Tröpfchen Generation (Emulsion), Verstärkung und Tropfen zu zählen. Daten werden unter Verwendung handelsüblichen Software analysiert. Die Testergebnisse sind dann dokumentiert und berichtet an den Arzt Test anfordern. Der Prozess soll innerhalb eines Zeitraums von 72 Stunden nach Probeneingang Ergebnis Version arbeiten. Acht Varianten für ROS1 (B) und (C) RET sind innerhalb der Multiplex-Assays gedeckt. Adaptiert von Biodesix Website mit Erlaubnis. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig2.jpg"> Abbildung 2 : Analytische Validierung. Zelllinien mit dem Ausdruck (A) SDC4 ROS1 Fusion und (B) CCDC6-RET Fusion wurden in einem Hintergrund der gesamten menschlichen Wildtyp RNA (WT-RNA) verdünnt. Mit jeder Fusion-Variante wurde der Nachweisgrenze bei 0,2 % Variante Frequenz mit vordefinierten Kriterien für jede Variante Assay gegründet. Alle Proben oberhalb dieser Schwelle enthielt auch mindestens 21 Kopien des Gens Kontrolle. 5 % EML4-ALK (ALK) Standard in einem Hintergrund von Wildtyp RNA wurde getestet, um die Spezifität des Assays, unter Beweis zu stellen, die durch ein negatives Ergebnis bestätigt wurde. Analytische gemultiplexten RNA-Standards wurden gemessen am hohen, mittleren und niedrige Konzentrationen für ROS1 (C) und (D) i.r. Präzision wurde über drei Testläufe am selben Tag (Intra-Day), drei Runs an drei aufeinanderfolgenden Tagen (Inter-Tag) und mit ausgewertet zwei unabhängige Marktbeteiligte (Inter-Operator). Die Mittel der Kopienzahl und Standardabweichungen werden angezeigt. Adaptiert von Biodesix Website mit Erlaubnis. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig3.jpg"> Abbildung 3 : Batch-Verarbeitung Kontrolle Beispiele und Robustheit Daten. 2D Grundstück ROS1 gemultiplext Assay dPCR ergibt sich für positive Kontrolle (A), (B) keine Reverse-Transkriptase-Steuerelement, und (C) keine RNA-Vorlage-Kontrolle. (D) Kontrollen wurden an 21 aufeinanderfolgenden Tagen (außer an Wochenenden und Feiertagen) ausgeführt. Bedeuten Sie Exemplarzahl +/-Standardabweichung für positive Kontrolle wurden 439 + / 141 ROS1. Kein Reverse-Transkriptase und keine Vorlagensteuerelemente wurden auch jeden Tag laufen, und diese waren alle negativ (Daten nicht gezeigt). 2D Grundstück von RET gemultiplext Assay dPCR ergibt sich für Positivkontrolle (E), (F) keine Reverse-Transkriptase-Kontrolle und (G) keine RNA-Vorlage-Kontrolle. (H) Kontrollen wurden an 21 aufeinanderfolgenden Tagen (außer an Wochenenden und Feiertagen) ausgeführt. Bedeuten Sie Kopien + / Standardabweichungen für positive Kontrolle wurden 586 + 182 / RET. Nicht gezeigt werden keine Reverse-Transkriptase und keine Vorlagensteuerelemente, die waren auch jeden Tag laufen und waren alle negativ. Adaptiert von Biodesix Website mit Erlaubnis. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig4.jpg"> Abbildung 4 : RT dPCR Fehlerbehebung. 2D plots vertreten suboptimalen dPCR Ergebnisse erzielt, wenn (A) innerhalb der keine reverse-Transkriptase-Kontrolle, (B) Kontamination innerhalb der keine RNA-Kontrolle, (C Kontamination) schneiden und Zusammenfügen von Tröpfchen und (D ) schlecht optimiert PCR-Zustände oder PCR-Hemmung. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig5.jpg"> Abbildung 5 : Turnaround-Zeit (TAT). TAT (in Stunden) für Tests anfordern eine RNA-Variante zusammengestellt wurde (n = 984). Daten ausschließt, Wochenenden, Feiertagen und Proben für statt &gt; 24 h aufgrund von unvollständigen klinischen Informationen über Labor Testformen anfordern. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57079/57079table1.jpg"> Tabelle 1: Vorbereitung der reversen Transkription Reagenzien für Prozess-Steuerungen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x dPCR Supermix für Sonden (keine 2' Deoxyuridine 5'-Triphosphat)</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 X Variante Ziel Primer/Sonden eingestellt (450 Nmol/L Primer, 250 Nmol/L FAM Sonde)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x Kontrolle Zielsatz Primer/Sonden (450 Nmol/L Primer, 250 Nmol/L HEX Sonde)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nuklease-freies Wasser</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA</td>
			<td>7 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Vorbereitung der master-Mix für dPCR.
<table border="1" fo:display-align="center" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Radfahren Schritt</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td># Zyklen</td>
			<td>Ramp-Rate</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym-Aktivierung</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="4">~ 2 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturierung</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glühen/Verlängerung</td>
			<td>55 ° C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym-Deaktivierung</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Halten (optional)</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>unendliche</td>
			<td>1</td>
			<td>~ 1 oC/s</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Radsport Thermik.

Nachweis von zirkulierenden Ribonukleinsäure (cRNA) aus Blut besteht ein ungedeckter Bedarf in der klinischen Diagnostik. Hier beschreiben wir Methoden, die cRNA von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs-Patienten mit empfindlichen und spezifischen digitalen Polymerase-Kettenreaktion zu charakterisieren. Die Tests treffen Entwurfsanforderungen zu Fusion Varianten innerhalb von 72 Stunden zu erkennen.

Eine Blut-basierte Test zum Nachweis von ROS1 und RET Fusion Transkripte von zirkulierenden Ribonukleinsäure mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Isolierung und Charakterisierung von tumorabgeleiteter zirkulierender Ribonukleinsäure aus Vollblutproben mittels digitaler Tröpfchen-PCR. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der onkologischen Diagnostik zu beantworten. Zum Beispiel, wie man aus Tumoren stammende Genfusionstranskulate aus zirkulierenden RNA- und Blutproben nachweisen kann.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hochoptimierte Methoden zur Stabilisierung, Extraktion und Detektion von RNA-Varianten mit niedriger Frequenz und Blutproben verwendet. Blutbasierte Tests sind eine Ergänzung zu herkömmlichen Gewebebiopsien mit dem Vorteil, dass eine minimalinvasive Technik verwendet wird, die schnelle Ergebnisse liefern kann. Obwohl diese Methode Einblicke in klinisch signifikante Mutationen und NSCLC geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen die zugängliche und schnelle Identifizierung von zirkulierenden RNA-Molekülen im Vollblut erforderlich ist.Zirkulierende RNA für die reverse Transkriptionsreaktion wird aus Blutproben von Spendern isoliert, wie im Textprotokoll beschrieben. Konvertieren Sie die konzentrierte zirkulierte RNA-Probe in cDNA mit einem kommerziell erhältlichen Reverse-Transkriptionsreaktionskit, einschließlich zufälliger Primer. Enthalten Sie eine Kontrollprobe ohne reverse Transziptase und eine Kontrollprobe ohne RNA.Wenn die reverse Transkriptionsreaktion abgeschlossen ist, isolieren Sie cDNA aus dem Reaktionsgemisch mit einer kommerziell erhältlichen DNA-Konzentrator-Spin-Säule. Dieser Schritt erleichtert die Entfernung von Enzymen, Primern und freien Desoxynukleotidtriphosphaten. Wenn die cDNA nicht sofort in PCR-Reaktionen verwendet wird, bei minus 80 Grad Celsius lagern.Tragen Sie während dieses Verfahrens einen Entsorgungskittel und Nitrilhandschuhe sowie einen speziellen Bereich für die Reagenzienvorbereitung. Decken Sie die Sonden ab, um sie vor Licht zu schützen, da nachfolgendes Licht den an der Sonde angebrachten Fluoreszenzfarbstoff photobleichen kann. Bereiten Sie zunächst die PCR-Mischungen für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 20 Mikrolitern vor, wie in dieser Tabelle angegeben, jedoch ohne Zugabe der cDNA.Transportieren Sie anschließend die Mischungen abgedeckt und lichtgeschützt zu einer PCR-Reinhaube, die sich in einem separaten Voramplifikationsbereich befindet. Verteilen Sie die Mischungen auf eine PCR-Platte. Fügen Sie die zu testende cDNA zum PCR-Mix hinzu.Decken Sie die Platte mit einem abnehmbaren Plattenversiegeler ab. Zentrifugieren Sie die Platten kurz, um die Proben am Boden der Vertiefungen zu sammeln. Auf einem Tellerschüttler auf niedriger Stufe 10 Sekunden lang mixen.Zentrifugieren Sie die Platten noch einmal kurz, um die Proben am Boden der Vertiefung zu sammeln. Entfernen Sie die Plattenversiegelung, bevor Sie die manuelle Tröpfchenerzeugung durchführen. Es ist wichtig, Blasen in der Pipettenspitze beim Laden der Proben zu minimieren und später die Tröpfchen langsam von der Kartusche auf die Platte zu übertragen, um Tröpfchenschäden zu vermeiden.Übertragen Sie vorsichtig 20 Mikroliter der PCR-Mischung in die Probenvertiefungen auf der Tröpfchenerzeugungspatrone. Fügen Sie 70 Mikroliter Öl zur Tropfenerzeugung hinzu. Decken Sie die Kartusche mit einer Gummidichtung ab und übertragen Sie sie auf einen manuellen Tröpfchengenerator, um die Tröpfchenerzeugung zu starten.Verwenden Sie nach der Tröpfchengenerierung die vom Hersteller empfohlenen Tipps, um die Tröpfchen auf eine frische PCR-Platte zu übertragen. Aspirieren und dosieren Sie die Tröpfchen langsam, jeweils über 5 bis 6 Sekunden, ohne das Ende der Spitze mit der Tröpfchenpatrone oder -platte zu berühren. Versiegeln Sie die Platte mit einem Folienversiegeler.Führen Sie die PCR im Thermocycler mit den folgenden Einstellungen durch. Nachdem der Thermocyclerlauf abgeschlossen ist, lesen Sie die Platte mit einem Tröpfchenleser ab. Erstellen Sie ein Plattenlayout für die Lesesoftware, das die Position der Kontrollen und Proben identifiziert, und laden Sie es in die Software, um die Ablesung zu starten.Die Ergebnisse des Plattenlesens werden mit kommerziell erhältlicher Software analysiert. Navigieren Sie zunächst zum Menü "Analysieren", um 2-dimensionale oder 2D-Amplitudendiagramme anzuzeigen. Bewerten Sie die Gesamtqualität der Daten, indem Sie die Tröpfchendaten untersuchen.Werten Sie über das Ereignismenü die Daten für die Gesamtzahl der akzeptierten Ereignisse aus. Es sollte über 10.000 Ereignisse pro Well geben. Ist dies nicht der Fall, müssen die Daten sorgfältig auf zusätzliche Probleme überprüft werden.Überprüfen Sie als Nächstes die Daten auf abscheuliche Fluoreszenzamplituden. Signifikante Amplitudenunterschiede und Konzentrationsunterschiede zwischen den Replikatproben deuten auf eine schlechte Handhabung oder Vermischung der Proben hin. Achten Sie auf Tröpfchencluster mit Sprühmustern auf einer 45-Grad-Achse, die auf Tröpfchen von schlechter Qualität oder problematische Proben hinweisen.Untersuchen Sie zuerst die Daten für die Positivkontrolle, keine Reverse-Transkriptase-Kontrolle und keine RNA-Kontrolle. Wählen Sie alle Kontrollproben aus und untersuchen Sie die Clusterqualität durch ein 2D-Diagramm für die richtige Schwellenwertierung, eine klare Trennung zwischen den Tröpfchenclustern sollte offensichtlich sein. Legen Sie für jede Assay-Variante den Schwellenwert basierend auf den Kontroll-Wells fest.Legen Sie Schwellenwerte in 2D-Diagrammen mit den Fadenkreuzwerkzeugen fest, um die doppelt negative Tröpfchenpopulation von der Kontrollgenpopulation auf der x-Achse und die variante Genpopulation, falls vorhanden, auf der y-Achse zu trennen. Einige Kopien von jedem Replikanten für eine einzelne Probe. Geben Sie abschließend die Testergebnisse als Anzahl der erkannten Variantenkopien an.Unter Verwendung von Zelllinien, die die SDC4-ROS1-Fusion und die CCDC6-RET-Fusion exprimieren, verdünnt im Hintergrund der gesamten humanen Wildtyp-RNA, wird die Nachweisgrenze bei 0,2 Prozent der Variantenfrequenz mit jeder Fusionsvariante festgelegt. Eine Präparation von 5 Prozent von RNA aus der Zielzelllinie wurde nicht nachgewiesen, was die Assay-Spezifität zeigt. Analytische Multiplex-RNA-Standards wurden in hohen, mittleren und niedrigen Konzentrationen über drei Durchläufe am selben Tag gemessen.Drei Fahrten an drei aufeinanderfolgenden Tagen und mit zwei unabhängigen Betreibern. Die Ergebnisse zeigen einen genauen Nachweis sowohl des interessierenden Fusionstranskripts als auch eines internen Kontrollgens GUSB. Jeder Bach klinischer Proben wurde ebenfalls mit einer Positivkontrolle, einer Kontrolle ohne reverse Transkriptase und einer Kontrolle ohne RNA-Template durchgeführt.Fusionsvarianten werden entlang der y-Achse dargestellt, während GUSB auf der x-Achse dargestellt wird. Bei der Beurteilung der Chargenkontrollen über einen Zeitraum von 21 Tagen wurden in allen Durchläufen fusionspositive Tröpfchen und GUSB-Kontrollgentröpfchen für ROS1 und RET beobachtet. Vertreter suboptimaler Ergebnisse werden gezeigt, wenn es eine Kontamination innerhalb der Kontrolle ohne reverse Transkriptase, eine Kontamination innerhalb der Kontrolle ohne RNA, die gemeinsame Nutzung und Koaleszenz von Tröpfchen und schlecht optimierte PCR-Bedingungen oder PCR-Inhibition gibt.Einmal gemeistert, kann dieses gesamte Protokoll in etwa 12 Stunden durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Best Practices für den Umgang mit RNA und menschlichen Blutproben zu verwenden. Nach der Isolierung von RNA könnten weitere Methoden wie Next Generation Sequencing durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung neuer Fusionsvarianten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zirkulierende RNA aus Vollblut und Plasma isoliert und dann die zurückgewonnene RNA verarbeitet, um seltene Varianten im Umlauf wie RET und ROS1 zu identifizieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für den Nachweis klinisch verwertbarer Mutationen aus Vollblut. Und wir haben diese Methoden erweitert, um überexprimierte Transkripte im Umlauf zu untersuchen.

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Forschung

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Medizin

In diesem Video präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung von emulgierten Nanotröpfchen zum Nachweis von Zielnukleinsäuren durch digitale Polymerase-Kettenreaktion oder dPCR.

Tröpfchen-Digitalpolymerase-Kettenreaktion: Eine Methode zur Erzeugung von Nanotröpfchen-PCR-Reaktionen zum Nachweis seltener Tumormutationen

Dieses Video demonstriert die chipbasierte digitale PCR — eine Variation der digitalen PCR-Technik, die bei der Erkennung seltener Transkriptvarianten nützlich ist. Die PCR-Reaktion wird in die Kammern eines nanofluidischen Chips aufgeteilt, von denen jede als unabhängige Reaktion wirkt. Die Detektion von Fluoreszenzsignalen aus den Kammern mit amplifizierten Targets bestätigt das Vorhandensein seltener Transkriptvarianten in der Probe.

Chipbasierte digitale PCR zum Nachweis seltener Transkriptvarianten mit einem nanofluidischen Chip

Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster

Das Ziel dieses Video ist zu zeigen, wie automatisierte DNA-Extraktion aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien und digitale Tröpfchen PCR (ddPCR) Analyse seltene Mutationen in einer klinischen Umgebung detektieren auszuführen. Nachweis von Mutationen in FFPE-Proben zeigt, die den klinischen Nutzen ddPCR in FFPE-Proben.

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

Es wird eine empfindliche und genaue Methode zur Quantifizierung zellfreier microRNAs unter Verwendung einer farbstoffbasierten Chemie und einer digitalen Tröpfchen-PCR-Technologie beschrieben.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Das Manuskript beschreibt einen Chip-basierte digitale PCR-Assay zu erkennen, eine seltene CDH1 Transkript Variante (CDH1a) in Tiefkühlfrische normalen und Tumorgewebe von Patienten mit Magenkrebs erhalten.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Zirkulierenden MicroRNAs haben Versprechen als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen und akute Myokardinfarkte gezeigt. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll für die MiRNA-Extraktion, reverse Transkription und digitale PCR für die absolute Quantifizierung von MiRNAs im Serum von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen.

Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Isolierung seltener Krebszellen aus einer künstlichen Probe mit Vollblut und Spitzen in Lungenkrebszellen veranschaulicht. Das Protokoll nutzt eine halbautomatisierte, labelfreie Zellisolationsplattform. Angereicherte Zellen werden anschließend mittels Tropfen-Digital-PCR auf Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors untersucht.

Profilierung von DNA-Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors in zirkulierenden seltenen Zellen mittels eines Zellisolationssystems und der digitalen PCR des Tröpfchens

Erfahren Sie die Isolierung und Charakterisierung von zirkulierender RNA aus Blutproben mittels digitaler PCR. Diese Methode ermöglicht den Nachweis seltener Genfusions-Transkripte wie ROS1 und RET bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.

Eine Blut-basierte Test zum Nachweis von ROS1 und RET Fusion Transkripte von zirkulierenden Ribonukleinsäure mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion (Video) | JoVE Journal

Eine Blut-basierte Test zum Nachweis von ROS1 und RET Fusion Transkripte von zirkulierenden Ribonukleinsäure mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion

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