Eine Blut-basierte Test zum Nachweis von ROS1 und RET Fusion Transkripte von zirkulierenden Ribonukleinsäure mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Isolierung und Charakterisierung von tumorabgeleiteter zirkulierender Ribonukleinsäure aus Vollblutproben mittels digitaler Tröpfchen-PCR. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der onkologischen Diagnostik zu beantworten. Zum Beispiel, wie man aus Tumoren stammende Genfusionstranskulate aus zirkulierenden RNA- und Blutproben nachweisen kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hochoptimierte Methoden zur Stabilisierung, Extraktion und Detektion von RNA-Varianten mit niedriger Frequenz und Blutproben verwendet. Blutbasierte Tests sind eine Ergänzung zu herkömmlichen Gewebebiopsien mit dem Vorteil, dass eine minimalinvasive Technik verwendet wird, die schnelle Ergebnisse liefern kann. Obwohl diese Methode Einblicke in klinisch signifikante Mutationen und NSCLC geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen die zugängliche und schnelle Identifizierung von zirkulierenden RNA-Molekülen im Vollblut erforderlich ist.

Zirkulierende RNA für die reverse Transkriptionsreaktion wird aus Blutproben von Spendern isoliert, wie im Textprotokoll beschrieben. Konvertieren Sie die konzentrierte zirkulierte RNA-Probe in cDNA mit einem kommerziell erhältlichen Reverse-Transkriptionsreaktionskit, einschließlich zufälliger Primer. Enthalten Sie eine Kontrollprobe ohne reverse Transziptase und eine Kontrollprobe ohne RNA

Wenn die reverse Transkriptionsreaktion abgeschlossen ist, isolieren Sie cDNA aus dem Reaktionsgemisch mit einer kommerziell erhältlichen DNA-Konzentrator-Spin-Säule. Dieser Schritt erleichtert die Entfernung von Enzymen, Primern und freien Desoxynukleotidtriphosphaten. Wenn die cDNA nicht sofort in PCR-Reaktionen verwendet wird, bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Tragen Sie während dieses Verfahrens einen Entsorgungskittel und Nitrilhandschuhe sowie einen speziellen Bereich für die Reagenzienvorbereitung. Decken Sie die Sonden ab, um sie vor Licht zu schützen, da nachfolgendes Licht den an der Sonde angebrachten Fluoreszenzfarbstoff photobleichen kann. Bereiten Sie zunächst die PCR-Mischungen für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 20 Mikrolitern vor, wie in dieser Tabelle angegeben, jedoch ohne Zugabe der cDNA.

Transportieren Sie anschließend die Mischungen abgedeckt und lichtgeschützt zu einer PCR-Reinhaube, die sich in einem separaten Voramplifikationsbereich befindet. Verteilen Sie die Mischungen auf eine PCR-Platte. Fügen Sie die zu testende cDNA zum PCR-Mix hinzu.

Decken Sie die Platte mit einem abnehmbaren Plattenversiegeler ab. Zentrifugieren Sie die Platten kurz, um die Proben am Boden der Vertiefungen zu sammeln. Auf einem Tellerschüttler auf niedriger Stufe 10 Sekunden lang mixen.

Zentrifugieren Sie die Platten noch einmal kurz, um die Proben am Boden der Vertiefung zu sammeln. Entfernen Sie die Plattenversiegelung, bevor Sie die manuelle Tröpfchenerzeugung durchführen. Es ist wichtig, Blasen in der Pipettenspitze beim Laden der Proben zu minimieren und später die Tröpfchen langsam von der Kartusche auf die Platte zu übertragen, um Tröpfchenschäden zu vermeiden.

Übertragen Sie vorsichtig 20 Mikroliter der PCR-Mischung in die Probenvertiefungen auf der Tröpfchenerzeugungspatrone. Fügen Sie 70 Mikroliter Öl zur Tropfenerzeugung hinzu. Decken Sie die Kartusche mit einer Gummidichtung ab und übertragen Sie sie auf einen manuellen Tröpfchengenerator, um die Tröpfchenerzeugung zu starten.

Verwenden Sie nach der Tröpfchengenerierung die vom Hersteller empfohlenen Tipps, um die Tröpfchen auf eine frische PCR-Platte zu übertragen. Aspirieren und dosieren Sie die Tröpfchen langsam, jeweils über 5 bis 6 Sekunden, ohne das Ende der Spitze mit der Tröpfchenpatrone oder -platte zu berühren. Versiegeln Sie die Platte mit einem Folienversiegeler.

Führen Sie die PCR im Thermocycler mit den folgenden Einstellungen durch. Nachdem der Thermocyclerlauf abgeschlossen ist, lesen Sie die Platte mit einem Tröpfchenleser ab. Erstellen Sie ein Plattenlayout für die Lesesoftware, das die Position der Kontrollen und Proben identifiziert, und laden Sie es in die Software, um die Ablesung zu starten.

Die Ergebnisse des Plattenlesens werden mit kommerziell erhältlicher Software analysiert. Navigieren Sie zunächst zum Menü "Analysieren", um 2-dimensionale oder 2D-Amplitudendiagramme anzuzeigen. Bewerten Sie die Gesamtqualität der Daten, indem Sie die Tröpfchendaten untersuchen.

Werten Sie über das Ereignismenü die Daten für die Gesamtzahl der akzeptierten Ereignisse aus. Es sollte über 10.000 Ereignisse pro Well geben. Ist dies nicht der Fall, müssen die Daten sorgfältig auf zusätzliche Probleme überprüft werden.

Überprüfen Sie als Nächstes die Daten auf abscheuliche Fluoreszenzamplituden. Signifikante Amplitudenunterschiede und Konzentrationsunterschiede zwischen den Replikatproben deuten auf eine schlechte Handhabung oder Vermischung der Proben hin. Achten Sie auf Tröpfchencluster mit Sprühmustern auf einer 45-Grad-Achse, die auf Tröpfchen von schlechter Qualität oder problematische Proben hinweisen.

Untersuchen Sie zuerst die Daten für die Positivkontrolle, keine Reverse-Transkriptase-Kontrolle und keine RNA-Kontrolle. Wählen Sie alle Kontrollproben aus und untersuchen Sie die Clusterqualität durch ein 2D-Diagramm für die richtige Schwellenwertierung, eine klare Trennung zwischen den Tröpfchenclustern sollte offensichtlich sein. Legen Sie für jede Assay-Variante den Schwellenwert basierend auf den Kontroll-Wells fest.

Legen Sie Schwellenwerte in 2D-Diagrammen mit den Fadenkreuzwerkzeugen fest, um die doppelt negative Tröpfchenpopulation von der Kontrollgenpopulation auf der x-Achse und die variante Genpopulation, falls vorhanden, auf der y-Achse zu trennen. Einige Kopien von jedem Replikanten für eine einzelne Probe. Geben Sie abschließend die Testergebnisse als Anzahl der erkannten Variantenkopien an.

Unter Verwendung von Zelllinien, die die SDC4-ROS1-Fusion und die CCDC6-RET-Fusion exprimieren, verdünnt im Hintergrund der gesamten humanen Wildtyp-RNA, wird die Nachweisgrenze bei 0,2 Prozent der Variantenfrequenz mit jeder Fusionsvariante festgelegt. Eine Präparation von 5 Prozent von RNA aus der Zielzelllinie wurde nicht nachgewiesen, was die Assay-Spezifität zeigt. Analytische Multiplex-RNA-Standards wurden in hohen, mittleren und niedrigen Konzentrationen über drei Durchläufe am selben Tag gemessen.

Drei Fahrten an drei aufeinanderfolgenden Tagen und mit zwei unabhängigen Betreibern. Die Ergebnisse zeigen einen genauen Nachweis sowohl des interessierenden Fusionstranskripts als auch eines internen Kontrollgens GUSB. Jeder Bach klinischer Proben wurde ebenfalls mit einer Positivkontrolle, einer Kontrolle ohne reverse Transkriptase und einer Kontrolle ohne RNA-Template durchgeführt.

Fusionsvarianten werden entlang der y-Achse dargestellt, während GUSB auf der x-Achse dargestellt wird. Bei der Beurteilung der Chargenkontrollen über einen Zeitraum von 21 Tagen wurden in allen Durchläufen fusionspositive Tröpfchen und GUSB-Kontrollgentröpfchen für ROS1 und RET beobachtet. Vertreter suboptimaler Ergebnisse werden gezeigt, wenn es eine Kontamination innerhalb der Kontrolle ohne reverse Transkriptase, eine Kontamination innerhalb der Kontrolle ohne RNA, die gemeinsame Nutzung und Koaleszenz von Tröpfchen und schlecht optimierte PCR-Bedingungen oder PCR-Inhibition gibt.

Einmal gemeistert, kann dieses gesamte Protokoll in etwa 12 Stunden durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Best Practices für den Umgang mit RNA und menschlichen Blutproben zu verwenden. Nach der Isolierung von RNA könnten weitere Methoden wie Next Generation Sequencing durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung neuer Fusionsvarianten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zirkulierende RNA aus Vollblut und Plasma isoliert und dann die zurückgewonnene RNA verarbeitet, um seltene Varianten im Umlauf wie RET und ROS1 zu identifizieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für den Nachweis klinisch verwertbarer Mutationen aus Vollblut. Und wir haben diese Methoden erweitert, um überexprimierte Transkripte im Umlauf zu untersuchen.