Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel dieses Chromatin-Immunpräzipationsprotokolls ist es, die Häufigkeit und Lokalisation von Histonmodifikationen an definierten Regionen im gesamten knospenden Hefegenom zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Chromatinregulation zu beantworten, z. B. wie Histonmodifikationen mit der Genexpressionskontrolle zusammenhängen und wie sich diese Modifikationen als Reaktion auf unterschiedliche Umweltbedingungen verändern. Ein äußerst vielseitiges Protokoll, mit dem viele verschiedene Histonmodifikationen und mehrere E-Stämme gleichzeitig untersucht werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in Histonmodifikationen geben kann, kann sie auch zur Untersuchung anderer Chromatinbindungsproteine durch die Verwendung von Epitop-Tags oder verfügbaren Antikörpern angewendet werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Hefezellen züchten, 10 Milliliter YPD-Medium mit einer einzigen Kolonie jedes geeigneten Stammes impfen und es über Nacht in einem Schüttelbrutkasten bei 220 U/min auf 30 Grad Celsius züchten. Am folgenden Tag nach Messung der optischen Dichte bei 600 Nanometern oder OD600 der Kultur wird die Kultur in einem neuen Kolben auf einen OD600 von 0,2 in 100 ml YPD verdünnt.

Züchten Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius in einem Schüttelbrutkasten bei 220 U/min, bis sie die mittlere logarithmische Phase erreichen. Wenn die Kulturen die mittlere logarithmische Phase erreicht haben, werden 2,7 Milliliter 37 % Formaldehyd direkt in das Medium in jedem Kolben gegeben, um eine Endkonzentration von 1 % Formaldehyd zu erreichen. Die Kolben werden bei Raumtemperatur in einen Shaker gegeben und 15 Minuten lang bei 50 U/min geschüttelt.

Geben Sie fünf Milliliter 2,5 molares Glycin in das Medium und schütteln Sie das Schütteln bei 50 U/min bei Raumtemperatur fünf Minuten lang weiter, um das Formaldehyd zu löschen. Anschließend schleudern Sie die Zellen herunter und waschen sie wie im Textprotokoll beschrieben. Entfernen Sie den Überstand nach dem letzten Schleudern und fahren Sie mit der Herstellung von Hefelysaten fort.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter kalter Chromatin-Amino-Fällung oder ChIP-Lysepuffer mit 1 Millimolar PMSF und 1:1000 Verdünnung eines Hefeprotease-Inhibitor-Cocktails. Übertragen Sie die Suspension in ein 2,0-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen mit 200 Mikrolitern Glasperlen. Übertragen Sie die Zellen in eine Bead-Beat-Apparatur für ein Hochgeschwindigkeitsrühren bei vier Grad Celsius.

30 Sekunden lang mit Perlen schlagen und eine Minute lang eiskalt lassen. Schlagen Sie insgesamt sechs Mal und halten Sie die Zellen zwischen jeweils 30 Sekunden Schlagschlag mindestens eine Minute lang auf Eis. Übertragen Sie das Lysat mit einer Gelladespitze in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie das Lysat bei 15.500 g bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 250 Mikrolitern Mikrokokken-Nuklease-Aufschlusspuffer, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Fügen Sie jeder Reaktion 2,5 Mikroliter Mikrokokken-Nuklease hinzu.

Mischen Sie vorsichtig, indem Sie vier- bis sechsmal umdrehen und sofort 20 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubieren. Nach 20 Minuten stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Röhrchen auf Eis legen, fünf Milliliter 0,5 molare EDTA für eine Endkonzentration von 10 μmolar EDTA hinzufügen und vorsichtig durch Inversion mischen. Bei 15.500 g bei vier Grad Celsius 15 Minuten zentrifugieren.

Übertragen Sie dann jeden Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Für die konsistentesten Ergebnisse ist es wichtig sicherzustellen, dass in jeder Aminofällung die gleiche Proteinkonzentration verwendet wird. Abhängig von der Anzahl der Aminofällungen oder IP-Reaktionen wird ein Mastermix aus jeder freigesetzten Mikrokokkennuklease-Chromatinfraktion und jedem ChIP-Lysepuffer hergestellt und ein Milliliter mit 50 Mikrogramm Gesamtprotein den einzelnen Röhrchen zugeteilt.

Entnehmen Sie 100 Mikroliter aus jeder IP-Mischung, um sie als Eingangsprobe zu verarbeiten. Frieren Sie die Eingabeproben für die spätere Verwendung bei 20 Grad Celsius ein. Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass für jede Immunpräzipitation die gleiche Menge an an den Antikörper gebundenen Kügelchen verwendet wird.

Geben Sie mit einer Pipettenspitze aus breiter Platte 20 Mikroliter magnetische Protein AG-Kügelchen, die mit Antikörpern vorgebunden sind, zu jeder IP-Probe. Drehen Sie die Proben drei Stunden lang bei acht Umdrehungen pro Minute bei vier Grad Celsius. Wenn die IP fertig ist, legen Sie die Röhren in einen Magnetständer und lassen Sie die Perlen an der Seite der Röhre sammeln.

Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. Geben Sie einen Milliliter ChIP-Lysepuffer zu den Kügelchen und drehen Sie sie fünf Minuten lang bei acht Umdrehungen pro Minute bei vier Grad Celsius. Legen Sie dann die Röhrchen auf den Magnetständer und entfernen Sie den Überstand.

Waschen Sie die Kügelchen auf diese Weise nacheinander mit den folgenden Puffern für die angegebene Häufigkeit. ChIP Lysis Buffer, High Salt Wash Buffer, LiCl/detergent Wash Buffer und TE. Bei der letzten TE-Wäsche verwenden Sie 0,5 Milliliter TE, um die meisten Kügelchen in eine neue Tube zu übertragen, und verwenden Sie dann weitere 0,5 Milliliter TE, um die Tube zu waschen und die restlichen Kügelchen zu übertragen. Geben Sie 250 Mikroliter frisch hergestellten ChIP-Elutionspuffer in jedes Röhrchen und wirbeln Sie die Lösung kurz ein.

Drehen Sie die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit acht U/min. Legen Sie die Röhren in den Magnetständer. Den Überstand vorsichtig in ein neues Röhrchen umfüllen und die Kügelchen vermeiden.

Geben Sie weitere 250 Mikroliter ChIP-Elutionspuffer zu den Kügelchen. Drehen Sie die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit acht U/min. Übertragen Sie vorsichtig und ohne die Kügelchen zu stören, den Überstand in das Röhrchen mit der ersten Elution.

Tauen Sie die zuvor entnommenen Eingangsproben auf und fügen Sie jeder Eingabeprobe 400 Mikroliter ChIP-Elutionspuffer hinzu. Um Protein-DNA-Quervernetzungen umzukehren, fügen Sie sowohl den Eingangs- als auch den IP-Proben 20 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid, fünf Mikroliter Glykogen und 12,5 Mikroliter Proteinase K hinzu. Inkubieren Sie die Proben über Nacht in einem 65 Grad heißen Wasserbad.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, stellen Sie für jeden Satz Primer einen QPCR-Mastermix her, indem Sie die entsprechenden Volumina der QPCR-Mischung, den Forward-Primer und den Reverse-Primer kombinieren. Erstellen Sie DNA-Mastermixe für jede DNA-Probe, bei der eine Reaktion 0,5 Mikroliter DNA und 4,0 Mikroliter nukleasefreies Wasser enthält. Geben Sie 5,5 Mikroliter des entsprechenden Primer-Mastermixes in eine 384-Well-QPCR-Platte. Den Teller bei 200 g Raumtemperatur eine Minute lang drehen.

Geben Sie dann 4,5 Mikroliter des entsprechenden DNA-Mastermixes in jede Vertiefung. Den Teller verschließen und bei 200 g bei Raumtemperatur eine Minute lang schleudern. Führen Sie die QPCR mit einem Echtzeit-QPCR-System unter den folgenden Bedingungen durch: 95 Grad Celsius für drei Minuten, 40 Zyklen von 95 Grad Celsius für 10 Sekunden und 55 Grad Celsius für 30 Sekunden und eine Schmelzkurve von 65 Grad Celsius bis 95 Grad Celsius in Schritten von 0,5 Grad Celsius für fünf Sekunden.

Eine Schlüsselkomponente dieses Protokolls ist die Optimierung der Konzentration der Mikrokokken-Nuklease, die zum Verdau des Chromatins in lösliche Fragmente verwendet wird. Dieses Beispielergebnis aus der Agarose-Gelelektrophorese von DNA, die nach dem Verdau des Chromatin-Pellets mit unterschiedlichen Mengen an Mikrokokken-Nuklease isoliert wurde, zeigt, dass 2,5 Mikroliter Enzym bei 20 Einheiten pro Mikroliter überwiegend Mononukleosomen produzierten. In diesem repräsentativen ChIP-Experiment wurden Antikörper gegen einen Histon-Methylmarker H3K4me2 und Histon H3 in Wildtyp- und set1-Knockout-Zellen verwendet.

Set1-Knockout-Zellen fehlt die Methyltransferase, die die Markierung katalysiert. Die Balken zeigen die relative Anreicherung von H3K4me2 bei der angegebenen niedrigen sci an. Der Wildtyp-Stamm zeigte eine deutliche Anreicherung für H3K4me2 am fünf primalen Ende von zwei Genen, von denen bekannt ist, dass sie direkte Ziele von set1, PMA1 und ERG11 sind, während in set1-Knockout-Zellen kein Signal beobachtet wurde. Wie erwartet gab es keine Anreicherung der H3K4me2-Markierung an TEL07L, es wurde auch berichtet, dass die Expression von SPR3 durch set1 reguliert wird, aber diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Regulation wahrscheinlich durch einen anderen Mechanismus als an PMA1 oder ERG11 erfolgt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den verwendeten Antikörper sorgfältig mit den richtigen Kontrollen auf Spezifität zu testen. Falls verfügbar, sollten sowohl positive als auch negative Kontrollregionen in der QPCR untersucht werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können auch andere Methoden wie die GP-Sequenzierung durchgeführt werden, um das Genom durch Verteilung von Histonmodifikationen zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit gut kontrollierten Experimenten die Niveaus verschiedener Histonmodifikationen in einzigartigen genomischen Regionen konsistent nachweisen können.