Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein nützliches Werkzeug zur Visualisierung, Charakterisierung und Quantifizierung des Huntingtin-Proteinflusses für die Analyse der Proteinhomöostase in den Modellsystemen der Huntington-Krankheit zu beschreiben. Diese Methode kann uns helfen, Fragen in den Bereichen Proteinhomöostase und neurodegenerative Erkrankungen zu verstehen, wie z.B. das Verständnis des Einflusses bestimmter therapeutischer Interventionen auf die Krankheitspathogenese. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, unlösliche Proteinspezies für die quantitative Analyse zu isolieren und aufzulösen.

Obwohl diese Methode Einblicke in biochemische Veränderungen während der Pathogenese der Huntington-Krankheit geben kann, kann sie auch auf andere Proteinfehlfaltungskrankheiten wie Parkinson und Alzheimer angewendet werden. Um dieses Verfahren zu starten, beschriften Sie zwei Röhrchensätze für jede Probe als löslich und unlöslich. Bereiten Sie unmittelbar vor der Probenlyse im löslichen Röhrchen einen Lysepuffer vor, indem Sie die entsprechende Menge an Inhibitoren hinzufügen.

Als nächstes fügen Sie dem Gewebe eiskalt wirkenden löslichen Lysepuffer hinzu, der mit Proteaseinhibitoren ergänzt ist. Für Maushirngewebe 30 Mal langsam in einen Ein-Milliliter-Glasdouncer geben. Achten Sie darauf, die Oberfläche der Flüssigkeit nicht zu beschädigen, da sich Blasen bilden und zu einer unvollständigen Homogenisierung führen können.

Pipettieren Sie es dann in das unlöslich markierte Röhrchen auf Eis. Bei Zelllinien wurden die Zellen in jeder Sechs-Well-Platte fünfmal 10 bis zur fünften Zelle plattiert und nahezu konfluenzfähig gezüchtet. Spülen Sie anschließend die Zellen einmal mit kaltem 1X PBS aus und entfernen Sie es.

Tragen Sie dann ein minimales Volumen an Lysepuffer auf die Zellen auf und heben Sie sie mit einem Zellschaber an. Als nächstes wird das Homogenat oder das Zelllysat in das markierte unlösliche Röhrchen überführt und eine Stunde lang auf Eis lysiert. Bei Zelllysaten sollten Sie vor Beginn der Inkubation mehrmals trituieren, um die Zellklumpen aufzubrechen und die Bildung von Blasen zu vermeiden.

Jede Probe wird nach der Hälfte der Lysierung eine Sekunde lang kurz gepulst. Danach zentrifugieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius bei 15.000 x g für 20 Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand.

Achten Sie darauf, das Pellet oder die trübe Schicht nicht zu stören, da dies die Fraktion verunreinigt. Pipettieren Sie den Überstand als lösliche Fraktion in das löslich markierte Röhrchen und halten Sie ihn auf Eis. Es ist wichtig, den Überblick über die löslichen und unlöslichen Lysepuffer zu behalten.

Das Wechseln der Puffer oder das Platzieren des unlöslichen Puffers oder der Proben auf Eis wirkt sich nachteilig auf das Ergebnis des Protokolls aus. Waschen Sie das Pellet mit 500 Mikrolitern Lysepuffer und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 15.000 x g. Wiederholen Sie den Waschgang noch einmal.

Entfernen Sie anschließend den restlichen Waschpuffer, sodass nur das Tissue-Pellet übrig bleibt. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet mit Lysepuffer, der mit 4% SDS ergänzt ist. Beschallen Sie jede Probe 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur mit einem Sonden-Ultraschallgerät.

Die Beschallung kleiner Volumina über einen langen Zeitraum ist eine technische Herausforderung. Achten Sie darauf, dass keine Probe durch Emulgieren oder Sprühen verloren geht, während Sie diesen Schritt ausführen. Anschließend die Proben 30 Minuten kochen lassen.

Anschließend kurz bei 6.000 x g zentrifugieren. Führen Sie anschließend einen Detergenz-kompatiblen Protein-Assay oder einen Lowry-Protein-Assay durch, um die Proteinkonzentration zu messen. Anschließend aliquotieren Sie die Proben in 50-Mikroliter-Chargen, um Gefrier-/Auftauprobleme zu vermeiden.

In diesem Schritt werden Western Blots durchgeführt, indem 30 Mikrogramm der Probe im Verhältnis eins zu eins im Ladepuffer verdünnt werden. Kochen Sie die Proben fünf Minuten lang und zentrifugieren Sie sie kurz bei 6.000 x g. Analysieren Sie als Nächstes die Brüche nach SDS-Seite und Western Blot.

Färben Sie die Membran mit einer Ganzproteinfärbung, um die Effizienz der Proteinbeladung zu visualisieren. Hier sind die löslichen und unlöslichen Fraktionen aus HEK 293T-Zelllysaten, die auf einem 4-12%Bis-Tris- bzw. 3-8%Tris-Acetat-Seitengel aufgelöst wurden. Die auf die GAPDH-Belastungskontrolle normierte lösliche Fraktion zeigt eine Fluktuation des mutierten löslichen Huntingtin-Exon-1-Monomers basierend auf der Exposition gegenüber dem Proteaseinhibitor MG132.

Die unlösliche Fraktion zeigt, dass auch hochmolekulare akkumulierte Spezies von mutiertem Huntingtin durch die Behandlung mit MG132 moduliert werden. Und hier sind die Proben von löslichen und unlöslichen Fraktionen aus HeLA-Zelllysaten mittels Western-Blot- und Filterverzögerungsanalyse. Die Daten zeigen, dass das Vorhandensein einer überexprimierten SUMO-Isoform sowohl die hochmolekulare Mutante als auch die fibrilläre unlösliche Mutante Huntingtin in der unlöslichen Fraktion erhöht.

Diese Abbildung zeigt die Regulation der hochmolekularen mutierten Huntingtin-Akkumulation nach Modulation eines potentiellen Therapeutikums in der unlöslichen Fraktionierung von HeLa-Zellen über die Expression von 97Q Huntingtin Exon 1. Das therapeutische Ziel PIAS1 wurde entweder mit einer siRNA gegenüber PIAS1 zum Schweigen gebracht oder überexprimiert. Unlösliche Fraktionen aus Maus-Striata, die mit microRNA gegen PIAS1 behandelt und auf 3-8%-Tris-Acetat-Seitengelen aufgelöst wurden, zeigen eine Modulation von unlöslichem Huntingtin mit hohem Molekulargewicht.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit NEM äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Protokolls immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Gesichtsmaske getroffen werden sollten. Einmal gemeistert, kann diese Technik vom Lysat bis zum Ende der Fraktionierung je nach Anzahl der Proben in etwa drei bis vier Stunden durchgeführt werden. Für die Proteinquantifizierung und -aliquotierung sollte eine zusätzliche Stunde eingeplant werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Agarose-Gelelektrophorese oder die Filterverzögerung durchgeführt werden, um lösliche Oligomere bzw. unlösliche Fibrillen nachzuweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man unlösliche fehlgefaltete Proteine für die quantitative Analyse isoliert und auflöst.