Name: Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Fraktionierung löslicher und unlöslicher Huntingtin-Proteine aus Maushirn und Zellkulturen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse des Proteinflusses und liefert Einblicke in die Proteinhomöostase bei Huntington und anderen neurodegenerativen Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde durch das NIH (RO1-NS090390) unterstützt. Wir möchten auch danke Dr. Joan Steffanfor technische Hilfe und Diskussion während der Entwicklung des Assays.

Tier-Ethik-Anweisung - Experimente wurden durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health und einer genehmigten Tierversuche-Protokoll von der institutionellen Animal Care und Use Committee ( IACUC) an der University of California, Irvine, ein AAALAC akkreditierte Institution. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Leiden der Tiere zu minimieren.
1. Vorbereitung der Lyse Puffer
<ol><li>Vorbereiten "Wasserlöslich" Lyse-Puffer (10 mM Tris pH 7.4, 1 % Triton X 100, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin) und Sterilfilter durch 0,22 µm-Filter.<ol>
<li>Für eine funktionierende "Wasserlöslich" Lyse Puffer messen N-Ethylmaleimide (NEM) und gründlich lösen sich in 100 mM Phenylmethysulfonyl Fluorid (PMSF) aufgelöst in 100 % EtOH. Hinweis: Lysis Puffer-Hemmer: (i) 20 mM N-Ethylmaleimide (NEM); (Ii) 0,2 mM PMSF; (Iii) 1 mM Natrium Orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL Leupeptin; (V) 1 µg/mL Aprotinin; (vi) 20 mM Natriumfluorid (NaF). Achtung: Tragen Sie eine Gesichtsmaske bei der Arbeit mit NEM im gesamten Protokoll. Lyse Puffer arbeiten muss frische, aktive Inhibitoren zu gewährleisten erfolgen.</li>
		<li>Für lösliche Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren, fügen Inhibitoren in der folgenden Reihenfolge: Natriumfluorid (NaF), Volumen mit kalten Lyse Puffer, Natrium Orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin und Leupeptin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für "Unlösbaren" Lyse Puffer Ergänzung zu 4 % SDS durch Zugabe von 500 µL 20 % SDS auf 2 mL "Lösliche" Lyse Puffer. Lassen Sie bei Raumtemperatur. Hinweis: SDS wird sich überstürzen, wenn bei 4 ° C aufbewahrt; Beachten Sie dies bei Raumtemp. Endgültige Lysis Puffer Zusammensetzung: 10 mM Tris (pH 7,4); 1 % Triton x-100; 150 mM NaCl; 10 % Glycerin; 4 % SDS (nur unlösliche).</li>
</ol>(2) lösliche/unlösliche Fraktionierung Protokoll
Hinweis: Siehe Abbildung 1 für einen Schaltplan.
<ol><li>Zwei Sätze von Rohren für jede Probe zu kennzeichnen: "Lösliche" und "Unlöslich."</li>
	<li>Fügen Sie X µL eiskalte arbeiten lösliche Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren (siehe 1.1.1) Gewebe ergänzt hinzu. Hinweis: X = Volumen variiert je nach Gewebe; Siehe Tabelle 1.</li>
	<li>Für die Maus Hirngewebe (d.h. Striatum) beschriftet Dounce langsam 30 Mal in Glas 1 mL Douncer und Pipettieren in "Unlöslich" Rohr (halten auf Eis). Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht zu brechen Oberfläche der Flüssigkeit nach dem Start von Douncing, wie Luftblasen bilden und möglicherweise unvollständig Homogenisierung führen.</li>
	<li>Zellen (d.h., HeLa, HEK293T) Spülen Sie in Zellen einmal mit kalten, 1 X PBS. Entfernen Sie PBS und minimalem Volumen der Lyse Puffer auf Zellen anwenden und heben mit Zelle Schaber. Hinweis: Für über Zell-Linien, Zellen waren vergoldet 5 x 105 Zellen pro 6-well-Platte und Konfluenz in der Nähe von gewachsen. Man ist gut vergleichbar mit Volumen für Maus Striatum verwendet.</li>
	<li>Transfer Homogenat oder Zelle lysate in beschriftet, "Unlösbaren" Röhren und lyse auf Eis 1 h (Startuhr nach letzten Rohr verarbeitet wird). Hinweis: Für die Zelle Lysates genannte mehrmals Zelle Klumpen vor Beginn der Inkubation aufzubrechen. Vermeidung von Blasenbildung. Vortex Puls kurz jede Probe für 1 s auf halbem Weg durch Lyse.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei 4 ° C bei 15.000 x g für 20 Minuten.</li>
	<li>Überstand als "Lösliche" Bruch zu erholen.<ol>
<li>Entfernen Sie mit pipettieren, achten Sie darauf, Pellet/trübe Schicht zu stören, da dies den Bruchteil verunreinigen wird. Pipettieren löslichen Anteil in "Lösliche" mit der Bezeichnung Rohr. Halten Sie auf dem Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie nach jedem Waschen Pellet mit 500 µL Puffer lyse (x2) und Zentrifuge bei 4 ° C bei 15.000 x g für 5 min; Es ist okay, wenn einige der trübe Schicht ist aus pipettiert.</li>
	<li>Nach dem letzten Waschen entfernen Sie alle verbleibenden Waschpuffer verlassen nur das Gewebe Pellet. Hinweis: Ab diesem Zeitpunkt sind unlösliche Proben jetzt bei Zimmertemperatur aufzubewahren.</li>
	<li>Aufschwemmen Pellet mit X-µL-Lyse-Puffer mit 4 % SDS ergänzt (Lautstärke kann eingestellt werden, je nach Größe der Pellets; siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Beschallen Sie jede Probe für 30 s bei Raumtemperatur mit einer Sonde Sonikator (125 Watt, 20 kHz, Puls, Amplitude 40 %, siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Kochen Sie Proben (rollende Kochen) für 30 min; Zentrifugieren Sie kurz (15 s) bei 6.000 x g, jede Probe nicht zu verlieren.</li>
	<li>DC (Reinigungsmittel kompatibel) Protein Assay durchzuführen (siehe Tabelle der Materialien) oder Lowry Protein Assay, Proteinkonzentration (empfohlen begann Verdünnungen von 1/5 der Probe im jeweiligen Lyse Puffer für die Zellkultur und 1/10 für Gewebe Lysates) zu messen. Hinweis: Proteinkonzentrationen müssen mit einen DC oder Lowry-Assay aufgrund der hohen Konzentration Waschmittel gelesen werden.</li>
	<li>Aliquoten Proben in 50 µL Batches, Frost-Tausalz-Probleme zu vermeiden. Hinweis: Protokoll kann hier vor weiteren biochemischen Analyse angehalten werden, indem Sie speichern beide Fraktionen bei-20 ° C.</li>
</ol>3. Western-Blot und Quantifizierung
<ol><li>Führen Sie westliche Flecken wie berichtet an anderer Stelle1,13 durch Verdünnung 30 µg Probe 1:1 im Ladepuffer (1.6 x laden Farbstoff, 1 x Reduzierung). Hinweis: 30 µg Protein pro angebrochene reicht jedoch für optimale Auflösung eingestellt werden. 3 - 8 % Tris-Acetat Poly-Acrylamid Gele sollten für den unlöslichen Anteil verwendet werden. 4 - 12 % Bis-Tris Gele sind für die löslichen Fraktion empfohlen.</li>
	<li>Proben (rollende Kochen) für 5 min. Zentrifuge kurz kochen (15 s) bei 6.000 x g Probe zu sammeln.</li>
	<li>Bruchteile von SDS-PAGE und western-Blot, laut Protokoll des Herstellers für reduzierte Proben zu analysieren. Hinweis: Unlösliche Fraktion löst am besten, wenn auf 0,45 µM Nitrozellulose-Membran übertragen. 0,45 oder 0,2 µM Nitrozellulose einsetzbar für die löslichen Fraktion, abhängig von der Größe des Proteins des Interesses. Einige Optimierungen sein für beste Übertragung der HMW Materialien erforderlich.</li>
	<li>Färben Sie Membran mit ganzen Protein Fleck (z. B.MEMcode, siehe die Tabelle der Materialien), Protein laden Effizienz zu visualisieren. Hinweis: Westliche Flecken können durch mittlere Pixel Intensität analysiert werden. Löslichen Brüche können zu einem Haus-halten Protein am besten geeignet für das experimentelle System normalisiert werden. Unlösliche Bruch als relative Protein Fülle wurde durch reversible Protein beflecken oder Histon 3 Normalisierung auf separaten Blot überprüft.</li>
</ol>

<ol><li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington%27s+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li>
<li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+expansion+disease%3A+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li>
<li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li>
<li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington%27s+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington%27s+disease+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li>
<li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington%27s+Disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Trends+Neurol%22%5BJournal%5D)">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li>
<li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrantly+spliced+HTT%2C+a+new+player+in+Huntington%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li>
<li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).</li>
<li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Concepts%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li>
<li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li>
<li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li>
<li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li>
<li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li>
<li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Huntingtons+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li>
<li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li>
<li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73(2009).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23853712">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710(2013).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li>
<li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Für die oben genannten Protokolle, konsistente und quantitative Ergebnisse zu gewährleisten sind einige Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Erstens mHTT in beiden Fraktionen bilden spontan Aggregate im Laufe der Zeit auf mehrere Einfrieren-Tau-Zyklen, insbesondere in hoher Konzentration. Es ist also entscheidend für Aliquote die Protein-Preps Einfrieren und Auftauen nur das benötigte Volumen vor dem Ausführen des Tests, wie im obigen Protokoll beschrieben. Wenn unlösliche Fraktion weiß Fällungsmittel beim Auftauen ergibt, k...

Die Unterbrechung der Protein-Qualitätskontrolle-Netzwerke, die korrekte Faltung sicherstellen und Abbau von zellulären Proteinen ist wahrscheinlich im Zentrum Pathologie in der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und anderen "Protein misfolding" 2,3-Störungen. Ein detailliertes Verständnis der Proteostase-Netzwerk-Komponenten und ihre Beiträge zur Pathologie sind daher entscheidend für verbesserte therapeutische Interventionen zu entwickeln. HD wird durch die abnorme Erweiterung des CAG-Wiederholung innerhalb des Huntington-Gens, wodurch eine erweiterte Strecke der Polyglutamines (PolyQ) im Huntingtin (HTT) Protein4verursacht. Konsequente zeichnet pathologischen HD Pathogenese sich der daraus resultierenden Fehlfaltung, Anhäufung und Aggregation von HTT in Regionen des Gehirns und in peripheren Geweben, die nachweislich in mehrfacher Hinsicht stören normale Zelle Homöostase und Funktion 5 , 6. während HTT drückt sich ubiquitär, mittelgroße bedornten Neuronen im Striatum sind selektiv anfällig und meist offen betroffenen mit bemerkenswerten kortikale Atrophie, die auch im Zusammenhang mit HD Pathogenese.
Die Bildung von Aggregaten des HTT in das Gehirn von Huntington-Patienten und Tiermodellen hat in der Regel als Proxy-Marker für die Progression der Erkrankung und Dominant-Negative Verstärkung der Funktion für mHTT7serviert. Obwohl die genauen Mechanismen, durch welche, die Protein misfolding und Aggregation mHTT-induzierten Toxizität beitragen können, unklar bleiben, ist die Bildung dieser Einschlüsse im Gehirn von Huntington-Patienten und verschiedenen Tiermodellen eine Invariante und unvermeidbare Funktion. Einschlüsse auftreten, besteht weitgehend aus angesammelten HTT-Fragmente mit der N-terminalen erweitert PolyQ, darauf hinweist, dass Proteolyse und Verarbeitung von Full-length HTT sowie Alternative Spleißen8,9 spielen kann eine wichtige Rolle in der Pathogenese der HD. N-terminale HTT Fragmente kann eine pathologische Form der HTT darstellen, die schnell zu aggregieren, Siedelinie, und beschleunigen oder propagieren die Aggregation Prozess10.
Das Vorhandensein dieser Einschlüsse korreliert jedoch nicht unbedingt mit HTT-induzierten Toxizität oder Zelle Tod11. HTT ist vorgeschlagen worden, eine Aggregation von einem löslichen Monomer durch lösliche Oligomere Arten und β-Sheet Fibrillen unlösliche Aggregate und Einschlüsse12durchlaufen. Diese verschiedenen Protein-Arten über standard biochemischen Assays zu lösen ist eine Herausforderung im Bereich aufgrund ihrer Stabilität in niedrig-Reinigungsmittel-Lyse Puffer und Schwierigkeiten bei der Visualisierung mit standard biochemischen Assays gewesen. Somit sind methodische Überlegungen entscheidend bei der Aufdeckung der Grad und die Muster der kumulierten und aggregierte mHTT.
Die hier vorgestellten Protokoll stellt eine Methode zum mehrere Zwischenprodukte der HTT, speziell die Bildung einer unlöslichen HMW HTT-Spezies zu visualisieren, die offenbar eng mit HD Pathogenese und Krankheit Fortschreiten1,13 verfolgen ,14. In der Lage, zu beheben und verfolgen Sie mehrere Arten von mHTT bietet Forschern eine biochemische Tool zur Pathogenese der Krankheit untersuchen und bewerten mögliche therapeutische Interventionen durch Modulation und Auswirkungen auf die Pathogenese der Krankheit.

<table><tbody><tr><td>Sterilfilter</td><td>Millipore</td><td>SCGP505RE</td><td>Schraubverschluss, steriler Vakuumfilter</td></tr><tr><td>1 mL Tissue Grinder, Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Modell Q125</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Biorad</td><td>5000111</td><td>Vergleichbar mit Lowry Assay</td></tr><tr><td>Tris 1M Pufferlösung</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M Lösung</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS-Lösung</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimid</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonfluorid</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Herstellung einer 100mM Stammlösung in 100% EtOH, lagern bei 4°; C</td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>0,5 M Stammlösung in Wasser herstellen</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>10 mg/ml Stammlösung in Wasser</td></tr><tr><td>herstellen Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>10 mg/ml Stammlösung in Wasser herstellen</td></tr><tr><td>Natriumfluorid</td><td>Sigma</td><td>S4504</td><td>500 mM Stammlösung in Wasser</td></tr><tr><td>herstellen Anti-HTT</td><td>Millipore</td><td>MAB5492</td><td>Verwenden Sie 1:1000 für Western Blot, 1:500 für den Filterretardierungsassay</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>Verwenden Sie 1:1000 für löslichen Western Blot</td></tr></tbody></table>

fraktionierung für auflösung von löslichen und unlöslichen huntingtin-arten

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Die Anhäufung von fehlgefaltete Proteine ist zentral für Pathologie bei Chorea Huntington (HD) und vielen anderen neurodegenerativen Erkrankungen. Insbesondere eine pathologische Hauptmerkmal der Huntington-Krankheit ist die anomale Ansammlung von mutierten HTT (mHTT) Protein in hochmolekularen komplexe und intrazelluläre Einschlusskörperchen bestehend aus Fragmenten und andere Proteine. Herkömmliche Methoden zu messen und zu verstehen, dass die Beiträge der verschiedenen Formen der mHTT-haltige Aggregate Fluoreszenz-Mikroskopie, western-Blot Analyse und Filter enthalten trap Assays.
Die meisten dieser Methoden sind jedoch bestimmte Konformation, und können daher nicht die volle staatliche mHTT Protein Wandel aufgrund der komplexen Natur der aggregierten Löslichkeit und Auflösung lösen.
Für die Identifizierung der aggregierten mHTT und verschiedene modifizierte Formen und komplexe ist Trennung und Solubilisierung der zellulären Aggregate und Fragmente obligatorisch. Hier beschreiben wir eine Methode um zu isolieren und zu visualisieren, lösliche mHTT, Monomere, Oligomere, Fragmente und eine unlösliche hochmolekularen (HMW) angesammelt mHTT Arten. HMW mHTT tracks mit Fortschreiten der Erkrankung mit Maus Verhalten anzeigen entspricht, und hat durch bestimmte therapeutische Interventionen1nutzbringend moduliert wurden. Dieser Ansatz kann mit Mausgehirn, peripheren Geweben und Zellkulturen verwendet werden aber kann auf andere Modellsysteme oder Krankheit zusammenhängen angepasst werden.

Auflösung von löslichen und unlöslichen Zelle Lysates nach Fraktionierung kann mit westlichen Analyse und Filter Retardierung Assays (Abbildung 2) erkannt werden. Als Beispiel HEK293T Zellen wurden transfiziert mit Transfection Reagens (z.B. Lipofectamine 2000), mit HTT Exon 1 Codierung cDNA enthält 97 Glutamin wiederholt15 gefolgt von Poly Prolin reiche Region und durften diese Zellen Express für 44 h. Zellen behandelt wurden...

Ein Verfahren ist für die Fraktionierung von löslichen und unlöslichen mutierte Huntingtin Arten aus Maus Gehirn und Zelle Kultur beschrieben. Die beschriebene Methode eignet sich zur Charakterisierung und Quantifizierung des Huntingtin-Proteins Flussmittel und hilft bei der Analyse von Protein-Homöostase in der Pathogenese der Krankheit und in Anwesenheit von Störungen

Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein nützliches Werkzeug zur Visualisierung, Charakterisierung und Quantifizierung des Huntingtin-Proteinflusses für die Analyse der Proteinhomöostase in den Modellsystemen der Huntington-Krankheit zu beschreiben. Diese Methode kann uns helfen, Fragen in den Bereichen Proteinhomöostase und neurodegenerative Erkrankungen zu verstehen, wie z.B. das Verständnis des Einflusses bestimmter therapeutischer Interventionen auf die Krankheitspathogenese. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, unlösliche Proteinspezies für die quantitative Analyse zu isolieren und aufzulösen.Obwohl diese Methode Einblicke in biochemische Veränderungen während der Pathogenese der Huntington-Krankheit geben kann, kann sie auch auf andere Proteinfehlfaltungskrankheiten wie Parkinson und Alzheimer angewendet werden. Um dieses Verfahren zu starten, beschriften Sie zwei Röhrchensätze für jede Probe als löslich und unlöslich. Bereiten Sie unmittelbar vor der Probenlyse im löslichen Röhrchen einen Lysepuffer vor, indem Sie die entsprechende Menge an Inhibitoren hinzufügen.Als nächstes fügen Sie dem Gewebe eiskalt wirkenden l

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung von hochaktiven Hsp104, ein hexameren AAA +-Protein aus Hefe, die Paare ATP-Hydrolyse, um Protein Disaggregation. Dieses Schema nutzt eine His6-markierten Konstruktes zur Affinitätsreinigung...

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Quelle: Mackler, R. M., et al. Herstellung und Reinigung von Prototyp-Foamy-Virus-Intasomen. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Reinigung von Prototyp-Foamy-Virus-(PFV)-Intasomen aus einer gemischten Protein-DNA-Suspension mittels Salzextraktion und Größenauschlusschromatographie, wodurch aktive Komplexe für die nachgeschaltete Analyse erhalten werden.

Reinigung von Prototype-Foamy-Virus-Intasomen mittels Größenausschlusschromatographie

Dieses Video zeigt das Protokoll zur Isolierung von Amyloidfibrillen aus Maushirngewebeextrakt mittels Dichtegradientenzentrifugation und Verdauung von Nicht-Amyloid-Proteinen.

Isolierung von Amyloid-Fibrillen aus Hirngewebeextrakt

Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

Eine Prozedur wird vorgestellt, für die Umfaltung der dCACHE periplasmatischen Liganden-bindende Domäne von Campylobacter Jejuni Chemorezeptor Tlp3 Einschlusskörperchen und die Reinigung zu Milligramm-Mengen des Proteins führen.

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Hier präsentieren wir Ihnen eine robuste und optimierte Protokoll zur Herstellung von Milligramm-Mengen von native, Tag-freie Monomere und Fibrillen von der exon1 des Huntingtin-Proteins (Httex1), basierend auf die vorübergehende Verschmelzung von kleinen Ubiquitin Verwandte Modifikator (SUMO).

Erzeugung von nativen, unmarkierten Huntingtin Exon1 Monomer und Fibrillen mit einem SUMO-Fusion-Strategie

Die Expression und Reinigung von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen wird anhand von Beispielen beschrieben (Expression in E. coli, FPLC). Gereinigte Proteine werden zur Kristallisation und Antikörperproduktion verwendet und für Enzym-Assays eingesetzt. Ausgewählte fotometrische Assays werden vorgestellt, um die Multifunktionalität von FAHD1 als Oxaloacetat-Decarboxylase und Acylpyruvathydrolase darzustellen.

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Wir bieten skalierbare Protokolle, die das Konstruktdesign, die transiente Transfektion sowie die Expression und Reinigung von humanen Huntingtin-Proteinvarianten in voller Länge in HEK293-Zellen abdecken.

Effiziente und skalierbare Produktion von humanen Huntingtin-Varianten in voller Länge in Säugetierzellen unter Verwendung eines transienten Expressionssystems

Dieses Protokoll beschreibt, wie das domänenhaltige Fumarylacetoacetat-Hydrolase-haltige Protein 1 (FAHD1) aus Schweineniere und Mausleber extrahiert werden kann. Die aufgeführten Methoden können an andere Proteine von Interesse angepasst und für andere Gewebe modifiziert werden.

Extraktion und Reinigung von FAHD1-Protein aus Schweineniere und Mausleber

Erfahren Sie die Fraktionierung löslicher und unlöslicher Huntingtin-Proteine aus Maushirn und Zellkulturen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse des Proteinflusses und liefert Einblicke in die Proteinhomöostase bei Huntington und anderen neurodegenerativen Erkrankungen.

Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten

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