Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, eine ex vivo-extrazelluläre Matrix zu schaffen, die als Bruchsches Membrankultursystem bekannt ist und die Wirkung der Bruchschen Membran auf überlagernde retinale Pigmentepithelzellen beobachtet. Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen in der RPE-Subbiologie im Bereich der AMD-Ätiologie zu beantworten, z. B. ob die Veränderungen an gealterten Bruch-Membranen zu Fehlfunktionen der überlagernden RPE-Zellen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es Forschern ermöglicht, native Bruch-Membran aus einem menschlichen Spenderauge unterschiedlichen Alters zu isolieren und sie für Proteomik-Studien in RPE-Zellkulturen zu verwenden.

Isolierung der Bruch-Membran und die Herstellung eines echten vivo-Kultursystems mit minimaler Schädigung der nativen Bruch-Membran ist eine Herausforderung, aber ich zeige Ihnen in diesem Video, wie es geht. Legen Sie zunächst eine 1,5 Quadratzoll große Gaze, die in CO2-unabhängigem DMEM getränkt ist, in eine 100-Millimeter-Schale. Laden Sie dann den Augengloben auf die Gaze.

Verwenden Sie anschließend eine chirurgische Klinge, um einen Schnitt durch die Sklera drei Millimeter hinter dem Limbus zu machen. Verwenden Sie dann eine Schere mit feiner Klinge, um einen Schnitt in voller Dicke zu machen, und verlängern Sie den Schnitt in beide Richtungen um das Auge herum. Entfernen und entsorgen Sie dann das vordere Segment einschließlich Hornhaut, Linse und Iris.

Entsorgen Sie auch den Glaskörper und die Netzhaut. Anschließend wird der Membran-Aderhautkomplex des RPE-Bruchs vorsichtig mit einem teflonbeschichteten Spatel von der Sklera von der Peripherie bis zum Sehnerv abgezogen. Dies muss sehr vorsichtig erfolgen, um den Membrankomplex nicht zu zerreißen.

Machen Sie nun mit einer feinen chirurgischen Schere vier radiale Schnitte in der Sklera und schälen Sie die Sklera ab. Schneiden Sie dann die Bruchsche Membran-Aderhaut-Explantat vom Sehnerv ab und übertragen Sie diese Explantat in eine 60-Millimeter-Schale, die 0,02 molares Ammoniumhydroxid in DPBS enthält. Um die nativen RPE-Zellen zu entfernen, inkubieren Sie dieses Explantat 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie das Explantat nach der Inkubation dreimal mit DPBS, indem Sie die Stelle des Sehnervs auf der Bruch-Membran mit einer teflonbeschichteten Pinzette sichern, während Sie die Lösung um das Gewebe fließen lassen. Als nächstes schwimmen Sie das Explantat mit der Lamininseite nach oben in kohlendioxidfreiem Medium. Machen Sie vier Schnitte in der Bruch-Membran und übertragen Sie dann eine unlaminierte, hydrophobe, 65 Mikrometer dicke PTFE-Membran mit 0,2 Mikron Poren über das Explantat.

Richten Sie diese mit der Basallamina gegen die PTFE-Membran ein. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Schüssel und bringen Sie die Baugruppe dann in ein Glasmikroanalyse-Vakuumfilterhaltersystem, wo sie auf einer Frittenglashalterung sitzen sollte. Vermeiden Sie anschließend den Kontakt mit der Basallamina und glätten Sie die gekräuselten Ränder der Aderhautseite mit einer teflonbeschichteten Pinzette.

Verflüssigen Sie nun 15 Milliliter 4%Agarose in DPBS und kühlen Sie es auf 37 Grad Celsius ab. Gießen Sie dann die Agarose langsam über die Aderhautseite des Explantats, während Sie leicht daran saugen, um es flach zu halten. Sobald das Gel zu erstarren beginnt, überführen Sie es mit der Membran in eine 60-Millimeter-Schale auf Eis.

Lassen Sie das Gel zwei bis drei Minuten lang fest werden und ziehen Sie dann die PTFE-Membran ab. Tauchen Sie dann das Explantat in DPBS und lagern Sie es bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Wenn Sie das Explantat auf einer 60-Millimeter-Schale kultivieren, die mit flüssiger 4%iger Agarose ausgelegt ist, zeigen Sie mit der Bruch-Membran nach oben.

Bei der Kultivierung mit einer mit Polystyrol ausgekleideten 96-Well-Platte legen Sie das gelummantelte Bruch-Membranexplantat mit der Lamininseite nach oben auf eine flache Teflonplatte. Schneiden Sie dann mit einem Trepan sechs bis acht sechs Millimeter große Knöpfe aus dem Explantat heraus und übertragen Sie die Gewebeknöpfe in Vertiefungen, die mit flüssiger Agarose beladen sind. Richten Sie zunächst den Augengloben wie zuvor auf einer DPBS-getränkten Gaze ein.

Anschließend wird fünf Millimeter unterhalb des Iris-Sklera-Kontaktpunktes, der Pars plana, ein umlaufender Schnitt in den subretinalen Raum gesetzt. Entsorgen Sie das innere Segment, den Glaskörper und die Netzhaut. Waschen Sie anschließend die Augenmuschel mit einer Transferpipette mit zwei bis drei Millilitern kaltem DPBS.

Waschen Sie die Augenmuschel insgesamt dreimal. Um die RPE-Zellen zu dissoziieren, behandeln Sie die Augenmuschel bis zu 10 Minuten lang mit Trypsin. Übertragen Sie dann trypsinisierte RPE-Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie zum Abschrecken der Reaktion 25 Milliliter Medium mit FBS bei 37 Grad Celsius hinzu.

Zentrifugieren Sie nun das Gewebe und die Lösung bei 200 g für 10 Minuten bei 24 Grad Celsius. Anschließend resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern DMEM-Vollmedium mit 15 % FBS. Zählen Sie nun die Zellen und setzen Sie 15.000 lebensfähige RPE-Zellen in 200 Mikroliter serumfreies, mindestens essentielles Medium mit Antibiotika auf jeden Knopf der Bruch-Membran in der 96-Well-Platte.

Kulturieren Sie die Zellen mindestens 24 Stunden lang für die Anhaftung. Wechseln Sie später vorsichtig das Medium, um vollständiges DMEM zu erwärmen, und fahren Sie mit der Kultivierung der Zellen fort. Mit diesem Protokoll können gealterte und erkrankte menschliche Bruch-Membranen untersucht werden, indem RPE-Zellen auf ihnen gezüchtet werden.

Typischerweise verringern gealterte Explantate die Wiederanhaftung von RPE-Zellen. RPE-Zellen, die auf einer gealterten menschlichen Bruch-Membran kultiviert werden, sind auch weniger in der Lage, die äußeren Segmente der Stäbchen zu phagozytieren, eine wichtige RPE-Funktion. Unter Verwendung von Microarrays wurde festgestellt, dass sich die Genexpression von RPE-Zellen unterscheidet, wenn die Zellen älterer Individuen auf der Bruch-Membran kultiviert werden, verglichen mit Zellen, die von jüngeren Individuen auf Membran kultiviert werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Bruch-Membran aus menschlichen Spenderaugen isoliert und Explantate herstellt, in denen RPE-Zellen kultiviert werden können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Lamininseite des Bruch-Membranexplantats nicht mit Präparierwerkzeugen zu berühren, um eine Beschädigung der Oberfläche zu vermeiden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie RPE-Phagozytose und RPE-Zell-Genexpressionsstudien durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob eine Bruch-Membran von einem Spender unterschiedlichen Alters oder von Spendern mit altersbedingter Makuladegeneration die überlagernden RPE-Zellfunktionen beeinflusst. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der altersbedingten Makuladegeneration, um den Ätiologiemechanismus der AMD in einem Ex-vivo-Modellsystem der Bruchschen Membran zu erforschen.