Name: Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Lernen Sie die 2D-dSTORM-Bildgebung von Mikrotubuli und Intermediärfilamenten in fixierten U373-Zellen. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Visualisierung zytoskelettaler Netzwerke, die mit konventioneller Fluoreszenzmikroskopie nicht auflösbar sind.

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Wir danken Mickael Lelek, Orestis Faklaris und Nicolas Bourg für fruchtbare Diskussionen, Andrey Aristov und Elena Rensen für Hilfe mit der Super-Resolution-Technik und Shailaja Seetharaman für sorgfältige Lektüre des Manuskripts. Wir erkennen dankbar UtechS photonische BioImaging (Imagopole) Citech des Institut Pasteur (Paris, Frankreich) sowie der Frankreich-BioImaging-Infrastruktur-Netzwerk unterstützt durch die französische National Research Agency (ANR-10-INSB-04; Investitionen für die Zukunft), und der Region Ile de France (Programmieren Domaine d'Intérêt Gewalt-Malinf) für den Einsatz des Mikroskops Elyra. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Ligue Contre le Cancer und der französischen nationalen Forschungsstelle (ANR-16-CE13-0019).

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<li>Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+buffers+for+3D+STORM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Simple buffers for 3D STORM microscopy.</a> Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).</li>
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<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).</li>
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<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
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<li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nat Commun. 6, 7933(2015).</li>
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<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nprot.2017.024">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Wichtige Schritte im Protokoll
Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, das Artefakte in den dSTORM Bildern von Mikrotubuli und IFs in Gliazellen minimiert. Artefakte können erstellt werden, bei jedem Schritt der Probenvorbereitung und Bildgebung: Fixierung, Blockierung, Immunolabeling, treiben während der Akquisition, suboptimale blinkende Bedingungen23. Nachfolgend die wichtigsten Schritte auflisten
Reinigung der Deckgläsern i...

Zytoplasmatischen intermediate Filamente (IFs) sind 10 nm Durchmesser Homo- oder Heteropolymers einer Zelle Art spezifische Teilmenge von IF-Proteine. IFs Teilnahme an einer Vielzahl von zellulären Funktionen wie Zell-Motilität, Verbreitung und Stress-Reaktionen. Ihre wichtige Rolle wird durch die Tatsache hervorgehoben, die mehr als 90 Krankheiten beim Menschen direkt durch Mutationen im IF-Proteine verursacht werden; zum Beispiel Veränderungen in der Zusammensetzung der IF begleitet Tumorwachstum und Ausbreitung1,2,3. Es wächst Beweise, die die drei Zytoskelett-Systeme zusammen, um zelluläre Funktionen wie Zelle Polarisation, Teilung und Migration2,3 arbeiten. Da gibt es eine enge Kopplung zwischen Raumarchitektur und Funktionen, ist es entscheidend, erhalten Einblicke in die strukturelle Organisation des IF mit den anderen Filamenten und ein besseres Verständnis des Zytoskeletts Übersprechen. Dieser Artikel enthält ein Protokoll zur Durchführung der Super-Resolution Technik zweifarbige dSTORM (direkte stochastische optische Rekonstruktion Microscopy)4 und wie es verwendet wird, um die Interaktion zwischen wenn zu untersuchen und Mikrotubuli in feste, kultiviert Zellen in 2 Dimensionen (2D).
Mehrere Super-Resolution-Techniken wurden in den vergangenen zehn Jahren und es gibt Entdeckungen wurden am Ursprung der Nobelpreis für Chemie im Jahr 20145. Unter all diesen Techniken liegt die Einzelmolekül Lokalisierung-basierte Methoden wie PALM6 (Photo-Activated Localization Microscopy) die photoschaltbare fluoreszierende Proteine verwendet STORM7 mit paar Fluorophore oder dSTORM4 mit konventionellen Fluorophore. Alle diese Methoden basieren auf dem gleichen Prinzip besteht aus (i) den Schalter für den Großteil der fluoreszierenden Reporter in einem "off" Zustand"(nicht-fluoreszierende), (Ii) die stochastische Aktivierung einer Teilmenge davon in einem fluoreszierenden Zustand um lokalisieren ihre räumliche Lage mit Nanometer-Genauigkeit und (Iii) die Wiederholung dieses Prozesses um so viele Teilmengen des Fluorophore wie möglich zu aktivieren. Eine endgültige Bild wird rekonstruiert, mit alle Lokalisierungen der aktivierten Moleküle, bietet einen lateralen Auflösung bis zu ~ 20-40 nm. Mehrere kommerzialisierten optische Systeme, so dass PALM/Sturm stehen jetzt für Biologen für routinemäßige Experimente. Hier wurde ein solches System verwendet, um die strukturellen Vereinigung von Mikrotubuli und IFs zu studieren. Unter all den Einzelmolekül-Lokalisierung-basierte Methoden, die zweifarbige dSTORM Technik wurde ausgewählt, weil es gut geeignet, um sehr dünne lamellare Bereiche zu beobachten ist (< 1 µm) von adhärenten Zellen und bieten signifikante Verbesserung der Bildauflösung mit minimale Investition von Zeit und Geld. DSTORM ist in der Tat eine sehr bequeme und vielseitige Technik, die kompatibel mit den standard organischen Farbstoffen zum zellulären Beizen und Immunfluoreszenz routinemäßig eingesetzt.
Während einer Farbe dSTORM Bilder relativ einfach sind zu erhalten, mit dem Fluorophor Alexa6478, erfordert doppelte Farbe dSTORM die Versuchsbedingungen so optimieren, dass zwei Farbstoffen richtig im gewählten Puffer blinken können, vor allem, wenn es begrenzt ist Laserleistung. Ausgezeichnete Papiere sind bereits auf die Methoden zum Einrichten von Multi-Color-Bildgebung mit dSTORM9,10,11,12,13, und diese Papiere im Detail erklären, die möglichen Fehlerquellen Artefakte und degradierten Bildauflösung sowie zu deren Überwindung. In diesem Artikel, der optimalen experimentellen Bedingungen in Bezug auf Zellen Fixierung, Immunostaining, Probenvorbereitung sind bildgebende Erwerb und Bildrekonstruktion beschrieben um Bilder von dichten zytoplasmatischen IF Netze und Mikrotubuli in erlangen Gliazellen mit zweifarbige dSTORM. Kurz, die Extraktion/Fixierung in Chazeau Et Al12 beschriebene Methode wurde an Gliazellen angepasst und mit einem Post-Fixierung Schritt optimierte Antikörper Konzentration verwendet, ein Sturm-Puffer mit 10 mM MEA beschrieben in Dempsey9 Et Al. optimal für den experimentellen Aufbau und Probentyp zu finden.
Gliazellen express vor allem drei Typen von IF-Proteine: Vimentin, nestin und GFAP (glial fibrillary sauren Protein). Diese drei Proteine erwiesen sich in Astrozyten14Co polymerisieren. Wir haben bisher gezeigt, mit Höchstauflösung strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SR-SIM), dass diese drei IF-Proteine in der gleichen einzelnen IF Faden zu finden und sie ähnliche Verteilung und Dynamik in Gliazellen 15anzeigen. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den drei IF-Proteinen Vimentin Färbung als Reporter für das gesamte Netzwerk IF diente. Mit dSTORM, konnten wir zu beheben, wie IF Form Bündel entlang der Mikrotubuli, die war nicht möglich mit Beugung Mikroskopie-Techniken15begrenzt. Diese Beobachtungen können helfen, zu verstehen wie Vimentin IFs Vorlage Mikrotubuli und regulieren ihren Wachstumskurs, Förderung der Aufrechterhaltung einer Polarität Achse während Zelle Migration16. Super-Auflösung Schlüsselinformationen auf die gegenseitige Interaktion der beiden Zellskelett Subsysteme zur Verfügung gestellt und brachte einen Einblick in die Verbindung zwischen räumlichen Zuordnung und lokale Funktion Zelltyp spezifische17sein könnte. Im Allgemeinen kann zweifarbige dSTORM das Übersprechen zwischen Zellskelett Elemente oder andere Arten von Organellen, studieren verwendet werden, vorausgesetzt, dass gute Immunostaining Bedingungen in Bezug auf Dichte und Spezifität erreicht werden. Diese Technik nützlich sein wird, die Zytoskelett Änderungen beobachtet, während Astrogliosis und Glioblastom besser zu charakterisieren, die häufigste und bösartigste Tumor des zentralen Nervensystems, wo der Ausdruck von IF-Proteinen ist verändert 18 ,19,20,21.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Media (MEM)</td><td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>nicht essentielle Aminosäure</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>Zellkultur 1/100e</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Zellkultur 1/100e</td></tr><tr><td>F&oelig; tal Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Zellkultur 1/10e</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>fischer scientific</td><td>11540486</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Deckglas 18 mm n&deg; 1,5H</td><td>Marienfield/Dominic Dutcher</td><td>900556</td><td>Deckgläser</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA) Lösung</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Zellfixierung</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>Zellfixierung</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>nichtionisches Tensid. Verwendet für die Zellfixierung</td></tr>, <tr><td>Natriumborhydrid (NaBH4)</td><td>Sigma</td><td>452904-25ML</td>, <td>Zellfixierung</td></tr>, <tr><td>BSA</td>, <td></td><td>Sigma A7906</td>, <td>Probenpassivierung, 3% in PBS,</td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-Vimentin (V9)-Antikörper, hergestellt in der Maus</td>, <td>Sigma</td><td>V6630</td>, <td>Primärantikörper</td></tr><tr><td>Ratte, Anti-Alpha-Tubulin</td>, <td>Biorad</td><td>MCA77G,</td><td>Primärantikörper</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>10635923</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>10226162</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>TetraSpeck Mikrosphären, 0,1 & Mikro; m, fluoreszierend blau/grün/orange/dunkelrot</td><td>Fisher scientific</td><td>T7279</td><td>fluoreszierende Kügelchen</td></tr><tr><td>Chamlide Magnetkammer</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CM-B18-1</td><td>magnetischer Probenhalter, maximales Volumen 1,2 mL</td></tr><tr><td>Cysteamine (MEA)</td><td>Sigma</td><td>30070</td><td>für den blinkenden Puffer</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase aus Aspergillus</td><td>niger Sigma</td><td>G0543</td><td>für den blinkenden Puffer</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td></td><td>für den blinkenden Puffer</td></tr><tr><td>Katalase aus Rinderleber</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td>für den blinkenden Puffer</td></tr><tr><td>Tris (trizma)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>für den blinkenden</td></tr><tr><td>Puffer Wash-N-Dry Deckglasgestell</td><td>Sigma</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>Paraffinfilm</td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Fisher scientific</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging-intermediate filamenten und mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische rekonstruktion mikroskopie

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Das Zellskelett, bestehend aus Aktin beschäftigt, Mikrotubuli und fortgeschrittene Filamente (IF), spielt eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Zellform, Polarität und Motilität. Die Organisation der Aktin und Mikrotubuli Netzwerke wurde ausgiebig studiert, aber der IFs ist noch nicht vollständig charakterisiert. IFs haben einen Durchmesser von 10 nm und bilden ein Netzwerk erweitern in der gesamten Zelle Zytoplasma. Sie sind physisch verbunden mit Aktin und Mikrotubuli durch molekulare Motoren und Zytoskeletts linker. Diese enge Verbindung ist das Herzstück der Regulationsmechanismen, die für die koordinierte Regulierung der drei Zellskelett Netze erforderlich für die meisten Zellfunktionen sorgen. Es ist daher entscheidend für IFs allein und auch gemeinsam mit den jeweiligen anderen Zellskelett Netzwerke zu visualisieren. IF-Netzwerke sind jedoch extrem dicht in den meisten Zelltypen, vor allem in Gliazellen, wodurch seine Auflösung sehr schwer zu erreichen mit standard Fluoreszenz-Mikroskopie (laterale Auflösung von ~ 250 nm). Direkte stochastische Wiederaufbau Lichtmikroskopie (dSTORM) ist eine Technik, so dass einen Gewinn in lateraler Auflösung um eine Größenordnung. Hier zeigen wir, dass seitliche dSTORM Auflösung ausreichend, um die dichten Organisation der IF Netze und vor allem IF-Bundles rund um Mikrotubuli zu beheben ist. Solche engen Assoziation wird voraussichtlich in der koordinierten Verordnung dieser zwei Netzwerke und Mai teilnehmen, erklären wie Vimentin IFs Vorlage und stabilisieren Mikrotubuli Organisation sowie Mikrotubuli abhängigen vesikuläre Menschenhandel beeinflussen könnten. Ganz allgemein zeigen wir, wie die Beobachtung des Zytoskeletts Zweikomponenten mit zweifarbige dSTORM Technik bringt neue Einblicke in ihren Wechselwirkungen.

Ein Mikroskop mit 50 mW 405 nm und 100 mW 488, 561 und 642 nm Festkörperlaser, einer EMCCD Kamera 512 x 512, Alpha Plan Apo 100 X / 1,46 Ziel und Band Pass 570-650 / lange Pass 655 Emission Filter diente für die repräsentativen Ergebnisse dargestellt.
Abbildung 1A gibt ein Beispiel für Molekül Dichte und Signal Rauschabstand, die während der raw-Bildakquisition verwendet werden sollte. Bilder in gut...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optimalen Versuchsbedingungen von Probenvorbereitung zur Bildaufnahme und zum Wiederaufbau zu geben, um 2D dual dSTORM Farbbilder von Mikrotubuli und fortgeschrittene Filamente in festen Zellen durchführen

Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optimalen experimentellen Bedingungen von der Probenvorbereitung über die Bildaufnahme bis hin zur Rekonstruktion zu schaffen, um eine zweifarbige 2D-D-STORM-Bildgebung von Mikrotubuli und intermediären Filamenten in fixierten Zellen durchzuführen. Diese Methode kann helfen, die physikalischen Wechselwirkungen zwischen dichten und komplexen Zytoskelettnetzwerken wie z.B. intermediären Filamenten und Mikrotubuli zu charakterisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Beobachtung zellulärer Strukturen ermöglicht, die mit der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie nicht aufgelöst werden.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Kontrolle der Probenvorbereitung und der Erfassung von Robe-Linking-Daten von entscheidender Bedeutung ist, um die Erzeugung von Artefakten zu begrenzen. Nachdem Sie U373-Zellen gemäß dem Textprotokoll gezüchtet haben, fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie zuerst einmal mit PBS waschen. Entfernen Sie dann das PBS und fügen Sie einen Milliliter pro Vertiefung vorgewärmte Extraktionsfixierlösung hinzu.Inkubieren Sie die Zellen 60 Sekunden lang bei R

imaging-intermediate-filaments-microtubules-with-2-dimensional-direct

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Raumzeitliche Informationen über dynamische Proteine in lebenden Zellen sind entscheidend für das Verständnis der Biologie. Eine Art von hochauflösender Mikroskopie, die als schnelle 3D-strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (f3D-SIM) bezeichnet wird, enthüllt einzigartige Informationen über den zytokinetischen Z-Ring in Bakterien: sowohl sein kügelchenartiges Aussehen als auch die schnelle Dynamik von FtsZ innerhalb des Rings.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Um die Strömungsgeschwindigkeiten und die Richtungsabhängigkeit von filamentösem Aktin an der immunologischen T-Zell-Synapse zu untersuchen, wird die hochauflösende Bildgebung lebender Zellen mit Totalreflexionsfluoreszenz kombiniert und mit räumlich-zeitlicher Bildkorrelationsspektroskopie quantifiziert.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Wir präsentieren ein Protokoll für die Anwendung von interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm), einer 3-dimensionalen Einzelmoleküllokalisierung Super Resolution Mikroskopie-Methode, um die Abbildung des Aktin-Zytoskelett in adhärenten Säugerzellen. Dieser Ansatz ermöglicht es Licht-basierte Visualisierung von Nanostrukturmerkmale, die sonst mit herkömmlichen beugungsbegrenzten optischen Mikroskopie ungelöst bleiben würde.

Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

Dieses Protokoll ist eine Anleitung zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie auf einem Standardfluoreszenzmikroskop für etikettenfreie, kontrastreiche Hochgeschwindigkeitsaufnahmen von Mikrotubuli mit In-vitro-Oberflächen-Assays.

Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie für etikettenfreie High-Speed-Bildgebung von Mikrotubuli

Die chipbasierte optische Superauflösungsmikroskopie ist ein neuartiger Ansatz in der Fluoreszenzmikroskopie und bietet Vorteile in Bezug auf Wirtschaftlichkeit und Durchsatz. Hier werden die Protokolle für die Chipvorbereitung und -bildgebung gezeigt für die TIRF-Mikroskopie und die lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie.

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) wird verwendet, um die typische Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu umgehen und Exosomen auf der Nanometerskala zu betrachten. Es kann sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen eingesetzt werden, um Exosomen zu charakterisieren.

Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie extrazellulärer Vesikel in drei Dimensionen

Hier wird ein TIRF-Mikroskopie-basierter  In-vitro-Rekonstitutionsassay vorgestellt, um gleichzeitig die Dynamik zweier Mikrotubulipopulationen zu quantifizieren und zu vergleichen. Es wird ein Verfahren beschrieben, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer Mikrotubuli-assoziierter Proteine auf vernetzten Mikrotubulibündeln und einzelnen Mikrotubuli zu betrachten.

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Die differentielle dynamische Mikroskopie (DDM) kombiniert Merkmale der dynamischen Lichtstreuung und Mikroskopie. Hier wird der Prozess der Verwendung von DDM zur Charakterisierung rekonstituierter Zytoskelettnetzwerke durch Quantifizierung der subdiffusiven und eingesperrten Dynamik von Partikeln in Vimentin-Netzwerken und der ballistischen Bewegung von aktiven Myosin-getriebenen Aktin-Mikrotubuli-Kompositen vorgestellt.

Quantifizierung der Zytoskelettdynamik mittels differentieller dynamischer Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie man ein Ein-Objektiv-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop baut und wie es zur Visualisierung von Zytoskelettnetzwerken verwendet wird.

Design und Bau eines anpassbaren, einobjektiven Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops zur Visualisierung von Zytoskelettnetzwerken

Lernen Sie die 2D-dSTORM-Bildgebung von Mikrotubuli und Intermediärfilamenten in fixierten U373-Zellen. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Visualisierung zytoskelettaler Netzwerke, die mit konventioneller Fluoreszenzmikroskopie nicht auflösbar sind.

Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie

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