Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie
6. März 2018
Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optimalen Versuchsbedingungen von Probenvorbereitung zur Bildaufnahme und zum Wiederaufbau zu geben, um 2D dual dSTORM Farbbilder von Mikrotubuli und fortgeschrittene Filamente in festen Zellen durchführen
Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optimalen experimentellen Bedingungen von der Probenvorbereitung über die Bildaufnahme bis hin zur Rekonstruktion zu schaffen, um eine zweifarbige 2D-D-STORM-Bildgebung von Mikrotubuli und intermediären Filamenten in fixierten Zellen durchzuführen. Diese Methode kann helfen, die physikalischen Wechselwirkungen zwischen dichten und komplexen Zytoskelettnetzwerken wie z.B. intermediären Filamenten und Mikrotubuli zu charakterisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Beobachtung zellulärer Strukturen ermöglicht, die mit der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie nicht aufgelöst werden.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Kontrolle der Probenvorbereitung und der Erfassung von Robe-Linking-Daten von entscheidender Bedeutung ist, um die Erzeugung von Artefakten zu begrenzen. Nachdem Sie U373-Zellen gemäß dem Textprotokoll gezüchtet haben, fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie zuerst einmal mit PBS waschen. Entfernen Sie dann das PBS und fügen Sie einen Milliliter pro Vertiefung vorgewärmte Extraktionsfixierlösung hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Lösung und fügen Sie pro Mulde einen Milliliter frisch zubereitetes und vorgewärmtes 4%PFA hinzu, das in Zytoskelettpuffer verdünnt ist. Legen Sie die 12-Well-Platte wieder für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in den Inkubator.
Entfernen Sie dann das PFA und fügen Sie drei Milliliter PBS pro Vertiefung hinzu. Verwenden Sie PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Entfernen Sie dann das PBS und fügen Sie frisch zubereitetes 10 Millimolar Natriumborhydrid hinzu, das in PBS verdünnt ist, um die Autofluoreszenz des Glutaraldehyds zu löschen.
Inkubieren Sie die Zellen sieben Minuten lang bei Raumtemperatur und geben Sie das recycelte Natriumborhydrid in einen speziellen Behälter. Verwenden Sie PBS, um die Vertiefungen dreimal für jeweils fünf Minuten zu waschen. Entfernen Sie dann den PSB und fügen Sie 5%BSA in PBS als Blockierungslösung hinzu.
Nach der Immunfärbung der Proben und der Vorbereitung der Lösungen in Puffern gemäß dem Textprotokoll wird das Deckglas mit den markierten Zellen auf einen magnetischen Probenhalter montiert. Fügen Sie den Bildgebungspuffer hinzu, um die Kammer vollständig zu füllen. Setzen Sie den Deckel auf und stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen zwischen dem Bildpuffer und dem Deckel befinden.
Reinigen Sie den Boden der Probe mit absolutem Ethanol und stellen Sie sicher, dass keine Lecks vorhanden sind. Verwenden Sie dann bei Bedarf Fett, um den Probenhalter richtig abzudichten. Um die Bildgebung durchzuführen, schalten Sie das Mikroskop und die Erfassungssoftware ein.
Richten Sie die Erfassungsparameter gemäß dem Textprotokoll mit dem 100-fachen NA 1.46-Objektiv, der 1,6-fachen Optivar-Linse und dem TIRF-UHP-Modus ein. Erstellen Sie eine 647-Spur, um die mit Alexa Fluor 647 markierten Vimentin-Filamente abzubilden. Wählen Sie die Laserlinien 405 und 642 Nanometer und den Emissionsfilter LP 655
.Erstellen Sie dann eine 555-Spur, um die mit Alexa Fluor 555 beschrifteten Mikrotubuli abzubilden. Wählen Sie die Laserlinien 561, 488 und 405 Nanometer aus, um die Fluorophore und den Emissionsfilter BP 570 bis 650 abzubilden. Geben Sie anschließend Öl in das Objektiv und legen Sie die Probe auf das Objektiv.
Wählen Sie dann die Registerkarte "Lokalisieren" und öffnen Sie den Verschluss der Leuchtstofflampe. Finden Sie den Fokus und suchen Sie mit dem Okular nach den abzubildenden Zellen. Positionieren Sie dann mit dem Joystick die Zellen in der Mitte des Feldes.
Klicken Sie auf die Registerkarte "Erfassung", um zum Erfassungsmodus zurückzukehren. Wählen Sie dann die Spur 647 aus und stellen Sie die Laserleistung 642 auf 0,2 % und die Laserleistung 405 auf den minimalen Wert ein. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 50 Millisekunden und die Verstärkung auf 50 Millisekunden ein.
Wählen Sie dann den kontinuierlichen Erfassungsmodus, um die Zelle auf dem Bildschirm zu beobachten. Stellen Sie sicher, dass sich mindestens eine fluoreszierende Perle im Sichtfeld befindet. Verwenden Sie einen Autoscale-Modus für die Anzeige und passen Sie den Fokus an.
Nehmen Sie als Nächstes ein Weitfeld-Epifluoreszenzbild des Vimentin-Netzwerks auf, indem Sie auf Snap klicken und das Bild speichern. Um die TIRF-Beleuchtung zu überprüfen, klicken Sie auf TIRF, drücken Sie kontinuierlich, passen Sie die Erfassungsparameter an, um ein homogenes Beleuchtungsfeld zu erhalten. Drücken Sie dann auf Snap und speichern Sie das Bild.
Überprüfen Sie die Spur 555. Deaktivieren Sie die Spur 647 und wählen Sie die Spur 555 aus. Nehmen Sie ein Epifluoreszenzbild des Mikrotubuli-Netzwerks auf und speichern Sie es.
Nehmen Sie dann ein TIRF-Bild auf und speichern Sie es. Schauen Sie sich nun die Spur 647 an. Deaktivieren Sie die Spur 555 und wählen Sie die Spur 647 aus.
Stellen Sie die Verstärkung auf Null und die Belichtungszeit auf 10 Millisekunden ein. Drücken Sie dann auf Kontinuierlich. Stellen Sie die Laserleistung von 642 Nanometern auf 100 % ein, um die meisten Alexa 647-Farbstoffe in den dunklen Zustand zu pumpen.
Sobald die Fluorophore zu blinken beginnen, erhöhen Sie die Belichtung auf 15 Millisekunden und die Verstärkung auf 300. Verwenden Sie den Bereichsanzeigemodus, um zu überprüfen, ob einzelne Molekülsignale die Kamera nicht sättigen, wie durch die rote Farbe angezeigt. Verringern Sie in diesem Fall die Verstärkung, bis die Sättigung verschwindet.
Die Kügelchen bleiben zu Beginn der Akquisition gesättigt. Drücken Sie Stopp, um die Beobachtung der Zelle abzubrechen. Erweitern Sie das Online-Verarbeitungswerkzeug und klicken Sie auf Online-Verarbeitung PALM, um das STORM-Bild während der Aufnahme zu visualisieren.
Verwenden Sie neun für die maximale Maskengröße und sechs für die Spitzenintensität des Rauschens. Drücken Sie nun auf Erfassung starten. Fokussieren Sie sich während der Aufnahme bei Bedarf erneut auf die Zelle.
Passen Sie die Belichtungszeit an und schalten Sie schließlich die 405-Nanometer-Laserlinie ab 0,001 % ein, um eine mittlere Dichte von Fluorophoren mit einem Mindestabstand von einem Mikrometer zwischen den einzelnen Molekülen zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Lokalisierungsgenauigkeit im Histogramm unterhalb des rekonstruierten Bildes um oder unter 10 Nanometern zentriert ist. Drücken Sie Stopp, um den Film zu beenden, wenn mehr als eine Million Lokalisierungen erreicht wurden.
Speichern Sie die Rohdaten aus der STORM-Erfassung im CZI-Format. Aktivieren Sie dann im Kanalwerkzeug Spur 555, deaktivieren Sie Spur 647 und wählen Sie Spur 555 aus. Drücken Sie anschließend die kontinuierliche Taste.
Stellen Sie die Belichtungszeit auf 30 Millisekunden und die Verstärkung auf Null ein. Stellen Sie dann sowohl den 488- als auch den 561-Laser auf 100 % ein, um Alexa 555-Farbstoffe in den dunklen Zustand zu pumpen. Verwenden Sie den HILO-Beleuchtungsmodus.
Sobald die Fluorophore aufgebraucht sind, drücken Sie Stopp. Stellen Sie die Verstärkung auf 250 ein und verringern Sie den 488-Laser auf 50 %Verwenden Sie die Entfernungsanzeige, um zu überprüfen, ob einzelne Moleküle die Kamera nicht sättigen. Wenn dies der Fall ist, verringern Sie die Verstärkung.
Drücken Sie nun auf Erfassung starten. Erhöhen Sie während der Aufnahme die Verstärkung allmählich, bis die Sättigungsgrenze erreicht ist. Erhöhen Sie Schritt für Schritt die 405 Nanometer Laserleistung, um die Moleküle zu aktivieren und eine mittlere Dichte im Sichtfeld zu erreichen.
Verringern Sie die Laserleistung von 488 Nanometern auf 30 %, wenn der Laser 405 etwa 15 % beträgt, verringern Sie dann allmählich die 488, während Sie die Laserleistung 405 erhöhen, um das Blinken der Moleküle so schnell wie möglich und mit mittlerer Dichte zu halten. Die 488-Laserlinie, die mit dem 561-Anregungslaser gekoppelt ist, erhöht bei maximaler Intensität sowohl die Ein- als auch die Ausschaltraten der Fluorophore, während die 405-Laserlinie nur die Einschaltrate erhöht. Stoppen Sie die Erfassung, wenn 500.000 oder mehr Lokalisationen erreicht wurden oder wenn keine Moleküle mehr blinken.
Speichern Sie dann die Rohdaten aus der STORM-Erfassung im CZI-Format. Um eine Bildrekonstruktion mit dem Werkzeug PAL-Drift durchzuführen, wählen Sie den modellbasierten Korrekturtyp mit automatischen Segmenten mit einer maximalen Größe von acht. Drücken Sie mehrmals hintereinander auf Anwenden, bis die Abweichung korrigiert ist.
Bei dieser modellbasierten Korrektur wird ein Algorithmus angewendet, der auf einer Kreuzkorrelationsanalyse basiert und die Drift korrigiert. Verbessern Sie mit den PAL-Filterwerkzeugen das Erscheinungsbild des STORM-Bildes, indem Sie nur die Moleküle auswählen, die am besten lokalisiert wurden. Begrenzen Sie beispielsweise die Lokalisierungsgenauigkeit auf 30 Nanometer und die PSF auf 120 bis 180 Nanometer.
Verwenden Sie mit dem PAL-Render-Werkzeug eine Pixelauflösung von fünf oder 10 Nanometern und Parameter entsprechend dem Textprotokoll. Wählen Sie "Auto Dynamic Range HR rendern" mit einem Wert von 95 % und "Auto Dynamic Range SWF" mit einem Wert von 90 % aus. Wählen Sie dann Beste Renderqualität aus.
Wählen Sie im Menü PALM des Registers "Verarbeitung" die Option "PALM convert" aus. Drücken Sie auf Auswählen und dann auf Übernehmen. Speichern Sie abschließend das erstellte Bild im Format LSM und nicht CZI.
Diese Abbildung zeigt ein typisches Beispiel für ein D-STORM-Bild von Vimentin-Filamenten, die mit Alexa 647 immunomarkiert wurden. Die Erhöhung der Auflösung ist beim Vergleich mit dem Bild, das mit einem Standard-Weitfeldmikroskop aufgenommen wurde, deutlich zu erkennen. Die in dieser Grafik dargestellten Fluoreszenzintensitätsprofile zeigen, dass die hochauflösende Mikroskopie die Auflösung von Vimentin-Bündeln ermöglicht.
Die D-STORM-Auflösung reicht aus, um die Anzahl der in den Bündeln vorhandenen Filamente zu zählen. Hier ist ein typisches Beispiel für die zweifarbige D-STORM-Bildgebung von Vimentin- und Mikrotubuli-Netzwerken, die mit Alexa 647 bzw. Alexa 555 immunomarkiert wurden. Gute Vimentin-Bilder sollten mindestens 5.000 Lokalisationen pro Mikrometer zum Quadrat und 2.500 pro Mikrometer zum Quadrat für Mikrotubuli aufweisen.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Methoden der Fixierung und Parametrisierung an das Protein anzupassen, das abgebildet werden soll. Zum Beispiel liefert die Fixierung nur mit Glutaraldehyd schlechte Ergebnisse für Zwischenfilamente, ist aber am besten für die Mikrotubuli-Fixierung.
Es ist wichtig, daran zu denken, frisch zubereitete Proben und Lösungen zu verwenden, insbesondere MEA, dessen pH-Wert sorgfältig eingestellt werden muss. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, um die Morphologie nanoskopischer Zellstrukturen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Probenvorbereitung, die Bildaufnahme und die Rekonstruktion von zweifarbigen 2D-D-STORM-Bildern von intermediären Filamenten und Mikrotubuli durchführen.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einigen Lösungen, insbesondere PFA, NABH4, extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, das Arbeiten unter der chemischen Haube und die Verwendung bestimmter Behälter immer getroffen werden sollten, während dieses Verfahrens durchgeführt wird.
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Übersicht
Diese Methodik zielt darauf ab, optimale experimentelle Bedingungen für die zweidimensionale dualfarbige dSTORM-Bildgebung von Mikrotubuli und intermediären Filamenten in fixierten Zellen zu etablieren. Sie verbessert die Charakterisierung zytoskelettaler Netzwerke, die mit konventioneller Fluoreszenzmikroskopie häufig nicht aufgelöst werden können.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Abbildungstechniken
Hintergrund
- D-STORM-Bildgebung ermöglicht die hochauflösende Visualisierung zellulärer Strukturen.
- Mikrotubuli und Intermediärfilamente sind entscheidende Bestandteile des Cytoskeletts.
- Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie kann möglicherweise komplexe Wechselwirkungen in diesen Netzwerken nicht auflösen.
- Die Probenvorbereitung und Datenaufnahme sind entscheidend, um Artefakte zu minimieren.
Zweck der Studie
- Bedingungen für die Bildgebung von Mikrotubuli und Intermediärfilamenten zu optimieren.
- Das Verständnis zytoskelettaler Wechselwirkungen zu verbessern.
- Eine visuelle Demonstration der Methodik bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung der U373-Zellen gemäß einem festgelegten Protokoll.
- Waschen der Zellen mit PBS vor der Fixierung.
- Verwendung einer vorgewärmten Extraktionsfixierungslösung zur Zellfixierung.
- Aufnahme von dSTORM-Bildern zur Analyse zytoskelettaler Strukturen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Abbildung von Mikrotubuli und Intermediärfilamenten.
- Verbesserte Auflösung zellulärer Strukturen im Vergleich zu konventionellen Methoden.
- Nachgewiesene Kontrolle über die Probenvorbereitung und Datenerfassung.
- Charakterisierung von Wechselwirkungen innerhalb zytoskelettaler Netzwerke.
Schlussfolgerungen
- Die Methodik bietet einen robusten Ansatz zur Untersuchung der Dynamik des Cytoskeletts.
- Sie unterstreicht die Bedeutung einer sorgfältigen Probenvorbereitung.
- Zukünftige Anwendungen könnten die Erforschung anderer zellulärer Strukturen umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Die Auflösung dichter zytoskelettaler Netzwerke wie Intermediärfilamente und Mikrotubuli ist entscheidend für das Verständnis koordinierter zellulärer Funktionen in Krankheitsmodellen. Die zweifarbige dSTORM-Bildgebung ermöglicht eine nanoskalige Auflösung, um physikalische Assoziationen zwischen diesen Netzwerken sichtbar zu machen und dadurch mechanistische Risiken bei Zielstrukturen, die in die Regulation des Zytoskeletts involviert sind, zu minimieren. Diese Fähigkeit unterstützt die Zielvalidierung und die Entwicklung von Assays, indem strukturelle Abhängigkeiten aufgezeigt werden, die zelluläre Motilität, Polarität und intrazellulären Transport beeinflussen – zentrale Phänotypen in der neurodegenerativen und Krebsforschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung direkter Assoziationen zwischen Intermediärfilamenten und Mikrotubuli mit einer Auflösung von <10 nm.
- Operativer Wert: Liefert quantitative Messgrößen zur Filamentbündelung und Netzwerkdichte, um die funktionelle Zielvalidierung zu unterstützen.
- Prädiktiver Wert: Klärt die mechanistischen Zusammenhänge zwischen zytoskelettalen Komponenten und verringert damit Mehrdeutigkeiten bei der Pfadinterpretation während der Zielstrukturauswahl.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, hochauflösende Bildgebungsdaten, die für die Eichung von Assays in Bildschirmen für zytoskelettale Modulatoren geeignet sind.
- Operativer Wert: Etabliert reproduzierbare Protokolle für die Aufnahme und Rekonstruktion im zweifarbigen dSTORM-Verfahren und ermöglicht so die Konsistenz zwischen verschiedenen Laboren.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über verschiedene Zelllinien und Proteinziele hinweg, sofern die Fixierungs- und Markierungsbedingungen angepasst werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kohärenz: Verbindet die nanoskalige Zytoskelett-Organisation mit zellulären Phänotypen, die für Krankheitsmodelle relevant sind, wie beispielsweise die Aktivierung von Gliazellen oder die neuronale Integrität.
- Mechanistische Risikominimierung: Klärt, wie Vimentin-Intermediärfilamente die Organisation und Stabilisierung von Mikrotubuli steuern, und liefert damit Grundlagen für prädiktive Modelle von Defekten im vesikulären Transport.
- Relevanz für präklinische Modelle: Verwendet U373-Gliazellen – ein krankheitsrelevantes System zur Untersuchung von Neuroinflammation und Gliomprogression.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur Identifizierung von Leitsubstanzen ein, wobei die Integrität des Cytoskeletts als phänotypischer Endpunkt für die Wirkung von Verbindungen auf Zellstruktur und -funktion dient.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem geklärt wird, ob Verbindungen die Ko-Organisation von Intermediärfilamenten und Mikrotubuli stören oder stabilisieren.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch quantifizierbare Ausgangsparameter wie Lokalisierungsdichte (>5.000/µm² für Vimentin, >2.500/µm² für Mikrotubuli) und Auflösung der Bündel.
- Analytik: Bietet präzise Messungen des Filamentabstands und der Ko-Lokalisation, wodurch Teams strukturelle Phänotypen unter verschiedenen Bedingungen vergleichen können.
- Translationale Forschung: Verbindet die Nanoskalen-Bildgebung mit mikrotubulabhängigen Prozessen wie dem vesikulären Transport, was für die Entwicklung von Neurotherapeutika von Bedeutung ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Super-Resolution-Bildgebungstechnologie zum Studium beliebiger Proteinkombinationen im Cytoskelett, sofern sie mit kompatiblen Fluorophoren markiert sind.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung, indem nanoskalige zytoskelettale Wechselwirkungen aufgeklärt werden, die für die konventionelle Mikroskopie unsichtbar sind.
- Operationaler Wert: Schafft Standardisierung durch feste Aufnahmeparameter (z. B. 642 nm Laser mit 0,2 % zur Aktivierung, 100 % zur Depletion) und Rekonstruktions-Schwellenwerte (Lokalisierungsgenauigkeit <10 nm).
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in späteren Stadien, indem eine frühe Erkennung einer zytoskelettalen Dysregulation in präklinischen Modellen ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem strukturelle Nachweise zur Target-Bindung in zytoskelettalen Signalwegen bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Expertise in der Super-Auflösungs-Mikroskopie, Immunfärbung und der TIRF/HILO-Optik-Justage.
- Ist abhängig von spezialisierten Geräten, einschließlich einer 100x-NA-1,46-Objektivs, Optivar-Linse und Laserlinien bei 405, 488, 561 und 642 nm.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Fixierungsprotokollen (z. B. PFA-Konzentration, Abklingen mit Natriumborhydrid), um Autofluoreszenz zu minimieren und die Epitopintegrität zu bewahren.
- Erfordert eine Anpassung der Markierungsdichte und der Laserleistung bei der Zielsetzung unterschiedlicher Proteine, wie durch unterschiedliche Einstellungen für Alexa 647 im Vergleich zu Alexa 555 belegt.
- Ist eingeschränkt durch die Notwendigkeit, frisch zubereitete Lösungen und strenge Umweltkontrollen zu verwenden, um Drift zu verhindern und das Einzelmolekül-Blinkverhalten sicherzustellen.
