Name: Phloem Sap Probenahme aus Brassica Napus für 3D-Seite von Protein und Ribonucleoprotein komplexe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Erfahren Sie die 3D-PAGE-Methode zur Isolierung und Analyse von Protein- und Ribonukleoproteinkomplexen aus dem Phloem-Saft von Brassica napus. Diese Technik ermöglicht die hochauflösende Trennung und Identifizierung von Proteinen und RNA-Komponenten.

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Jennifer Deke und Urszula Zarzenska danken wir für ihre wissenschaftliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde von einem Career Integration Grant (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) von der Europäischen Kommission im Rahmen des 7. Rahmenprogramms, Grant LFF-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung Hamburg) und das DFG-Stipendium (DFG-KE 856_6-1) finanziell unterstützt. verliehen an JK.

1. Probenahme und Vorbereitung der Phloem-Saft von B. Napus Pflanzen 4,8,20
<ol><li>Phloem SAP Probenahme, verwenden gut bewässerten 8 Wochen alten B. Napus Pflanzen dieser Show nur erste Blüte um Pollen Kontaminationen zu verhindern.</li>
	<li>Verwenden eine Injektionsnadel (Ø 0,8 mm) und punctata der Blütenstand ergeben sich mehrere Male. Wiederholen Sie bei mehreren anderen Blütenstand Stengel und an anderen Pflanzen genug Phloem Sap (Abbildung 2a) zu erhalten. Hinweis: Für die komplexe Analyse empfiehlt es mit mindestens 600 µL Phloem Sap zu starten. 4 bis 5 Pflanzen werden zwischen 200 und 700 µL Phloem Sap ergeben.</li>
	<li>Wischen Sie den ersten Tropfen von den verletzten Seiten mit Filterpapier. Diese Tropfen vor allem stark belasteten Material aus den umliegenden verletzte Gewebe enthalten und müssen verworfen werden.</li>
	<li>Sammeln Sie die folgenden Tropfen durch pipettieren und speichern Sie die gesammelten Exsudat in einem vorgekühlt konische 1,5 mL Reaktionsgefäß bei-20 ° C mit einem eisfreien Kühlsystem.</li>
	<li>Weiter sammeln, bis keine weitere Tropfenbildung zu beobachten, aber nicht länger als 1 h ist. Dieses Verfahren kann nach zwei Tagen ohne erheblichen Verlust der gesammelten Phloem Sap wiederholt werden. Hinweis: Der gesammelten Phloem-Saft sofort genutzt oder gespeichert werden kann bei-80 ° C zur späteren Analyse. Für die-80 ° C Lagerung Schock-Freeze das Reaktionsgefäß in flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Die Phloem Probe zu ca. 1/6th das Ausgangsvolumen mit zentrifugalen Konzentratoren mit einem Molekulargewicht abgeschnitten (MWCO) von 10.000 Dalton (Da) zu konzentrieren. Zentrifugieren Sie die konzentrierte Probe bei 4 ° C und 20.000 x g für mindestens 15 min. um Staubpartikel zu entfernen. Hinweis: Phloem SAP-Konzentration führt nicht zu einem erheblichen Verlust von Proteinen.</li>
	<li>Fahren Sie für nachfolgende Funktionentheorie mit Schritt 3.1.</li>
</ol>(2) Phloem SAP-Reinheitskontrolle mit Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) 4,8,20
<ol><li>Gesamt-RNS aus Phloem-Saft mit einer standard RNA Extraktionsmethode für flüssiges Material zu isolieren (z.B. TRIzol oder Phenol-Chloroform-Extraktion gefolgt von Isopropanol Niederschlag aus der wässrigen Phase und Ethanol Waschschritten gemäß der des Herstellers Protokoll). Achtung: Phenol-Chloroform ist giftig. Arbeiten Sie unter einer Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. Bis zu sechs Monaten kann die extrahierte RNA in Ethanol bei-80 ° C aufbewahrt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie Verunreinigungen der DNA durch Verdauung mit DNase I (1 u/µg) für 45 min bei 37 ° C und inaktivieren das Enzym durch Zugabe von EDTA, eine Endkonzentration von 5 mM und die Probe bei 75 ° C für 10 min inkubieren.</li>
	<li>Um reine RNA, zu reinigen und die Probe zu konzentrieren, indem eine weitere Reinigungsstufe (z. B. mit RNA-Cleanup-Kits, gemäß den Anweisungen des Herstellers).</li>
	<li>Führen Sie eine Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) für die Synthese der cDNA mit einer cDNA Synthese Kit mit 150 ng reine RNA wie vom Hersteller beschrieben ist das Protokoll. Hinweis: Die cDNA kann bei-20 ° C bis zur weiteren Verwendung gespeichert werden.</li>
	<li>Verwenden Sie 5 µL cDNA als Vorlage für eine standard-PCR-Reaktion wie vom Hersteller angegeben, Fach-spezifische Protokolle zu verstärken und durch Agarose-Gelelektrophorese überprüfen. Bestätigen Sie die Reinheit der Phloem Proben z.B. mit Primer für Rubisco kleine Untereinheit, Thioredoxin-h und die Pollen-Hüllprotein (Abbildung 1 b, Tabelle 1).</li>
</ol>3. blaue native Seite 4,25,26,31
<ol><li>Verwenden Sie entweder selbst gegossenen native gradient Gele wie beschrieben an anderer Stelle27 oder kommerziellen Bis-Tris gradient Gele.</li>
	<li>Laden Sie mindestens 20 bis 30 µg der konzentrierten Proteins Probe pro Bohrloch auf das Gel in triplicates.</li>
	<li>Führen Sie das Gel bei 4 ° C und 150 V mit dunkel blauen Kathode Puffer B und Anode Puffer (Tabelle 2), bis die Probe 1/3rd des Gels (ca. 20 bis 30 min, Bild 3a) übergeben. Hinweis: Für Nordbeflecken, reicht eine einzige Gel-Gasse, während für die Analyse der Proteinzusammensetzung von 3D PAGE und Massenspektrometrie ist es empfehlenswert, die gleiche Band aus bis zu zehn Gel Bahnen sich weniger reichlich Proteine kombinieren.</li>
	<li>Unterbrechen den Lauf und Austausch dunkel blaue Kathode Puffer B mit leichten blauen Kathode Puffer B/10 (Tabelle 2) und der Flucht. Beenden Sie das Gel ausgeführt werden, wenn die blaue Front beginnt zu eluieren aus Gel (ca. 120 bis 180 min, Bild 3a). Hinweis: Das fertige blau native Gel kann bei 4 ° C für mindestens eine Woche gespeichert werden. Längerer Lagerung kann um zu diffundieren Bänder führen und sollte vermieden werden. Dunkel blau Puffer B kann wiederverwendet werden.</li>
</ol>4. OPTIONAL: Nachweis von RNA mit blauen native northern Blot 4
<ol><li>Unterschiedliche Banden geschnitten Sie aus oder verwenden Sie die ganze Gel-Spur aus dem blauen native Gel und übertragen Sie sie auf eine Nylon-Membran von semi Dry blotting bei 3,5 mA/cm2 für 60 min und markieren Sie die obere und untere Gel-Grenze mit einem Bleistift auf der Membran (Abbildung 4a).</li>
	<li>Beflecken, waschen Sie die Membran mit DEPC-behandeltem Wasser und trocknen Sie zwischen zwei Filterpapiere.</li>
	<li>Führen Sie UV-Vernetzung der gepunkteten Membran mit 120.000 µJ/cm2 (85 s wenn der Vernetzer in Tabelle Materialienverwenden).</li>
	<li>Pre-hybridisieren Sie die Membran mit 6 mL Hybridisierung Puffer (kommerzielle oder selbst gemacht) für 60 min bei 68 ° C im Backofen Hybridisierung (Abb. 4a).</li>
	<li>Fügen Sie eine zusätzliche 1 mL der Hybridisierung Puffer mit 4 µL 3' biotinylierte Sonden (100 nM).</li>
	<li>Inkubieren Sie Membran mit der Sonde über Nacht, beim Abkühlen des Backofen von 68 ° C auf 37 ° c</li>
	<li>Waschen Sie die Membran mit Puffer mit 2 X SSC und 0,1 % SDS für 5 min bei Raumtemperatur, Sonden gebunden unspezifisch zu entfernen. Achtung: SDS kann Reizungen verursachen. Tragen Sie Handschuhe und Kittel bei der Arbeit mit SDS und SDS mit Lösungen.</li>
	<li>Führen Sie die Erkennung der 3'-biotinylierte Sonden auf der Membran z.B. mit Streptavidin-HRP-Konjugat und Luminol als Meerrettich Peroxidase (HRP) Substrat, wodurch eine sensible Chemilumineszenz-Reaktion (Abb. 4a).</li>
</ol>5. zweite dimension: Tris-Tricine-Harnstoff Seite 4,28
<ol><li>Verbrauchssteuern Sie einzelne Bands aus dem blauen native Gel. Kombinieren Sie Bands aus Proben laufen in parallelen Bahnen, eine weitere Konzentration von komplexen Proteinen (Abbildung 5) zu erreichen. Hinweis: Ausgeschnittenen Bänder können in einzelnen Reaktionsgefäßen bis zur weiteren Verwendung bei 4 ° c gespeichert werden</li>
	<li>Gießen Sie eine 12 %-Tris-Tricine-Harnstoff-Gel (Dicke von 1 mm, 6,8 x 8,6 cm (Breite x Länge)). Das trennende Gel (Tabelle 2), 10 mL Gel Lösung A vorbereiten Gießen zwischen zwei Glasplatten und Overlay mit Isopropanol. Entfernen Sie das Isopropanol, nachdem die Polymerisation beendet ist und übertragen Sie 4 mL Gel Lösung B (Tabelle 2) für das Stapeln Gel auf das Gel und legen Sie eine 10 gut kämmen zu. Achtung: Unpolymerisierten Acrylamid kann neurotoxische und TEMED ist gesundheitsschädlich beim Einatmen. Immer persönliche Schutzausrüstung tragen und arbeiten unter einer Haube.</li>
	<li>Übertragen Sie die ausgeschnittenen Gel-Bands in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß und 1 mL 2 x SDS-Probenpuffer für Gleichgewichtherstellung der Gel-Stücke (Abbildung 5, Tabelle 2).<ol>
<li>Brüten Sie die Proben 10 min bei Raumtemperatur, vor dem Kochen in einem Heizblock (95 ° C) oder in der Mikrowelle und inkubieren Sie die Proben wieder auf weitere 15 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Stapeln Sie mehrere äquilibriert Gel Stücke vertreten die gleichen Komplex in einem einzigen Gel Tasche.</li>
		<li>Führen Sie die Elektrophorese mit Anode und Kathode mit 150 V für 45 bis 60 min Puffer und Verbrauchsteuern Sie die ganze Gel-Spur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brüten die geschnittenen Fahrspur für 20 min in sauren Puffer (100 mM Tris, 100 mM Essigsäure) und equilibrate in 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 für weitere 20 min (Abbildung 5).</li>
</ol>(6) dritte Dimension: SDS-PAGE 4,32
<ol><li>Gießen Sie einen 15 % SDS Trennung Gel nach Laemmli32 (Dicke: 1,5 mm, 6,8 x 8,6 cm (Breite x Länge)) (Tabelle 2) und fügen Sie eine dünne Schicht von 4 % Gel oben stapeln. Achtung: SDS, Acrylamid und TEMED sind giftig und schädlich. Arbeiten unter einer Haube und persönliche Schutzausrüstung tragen.</li>
	<li>Übertragen der äquilibriert Gel-Spur auf das SDS-Gel und decken das Gel mit 0,5 % (w/w) Agarose in 1 X SDS laufen Puffer ergänzt mit einer Spur von Bromophenol blue (Abbildung 5).</li>
	<li>Kochen Sie die SDS mit Puffer Agarose in der Mikrowelle vor Verladung auf das Gel.</li>
	<li>Legen Sie für den Betrieb eines Protein-Markers zur Abschätzung der Molekulargewichte der Einzelkomponenten ein Stück Filterpapier an einem Ende des Gels, bis die Agarose erstarrt oder verwenden Sie einen speziellen Kamm in der Regel für IPG Gele verwendet.</li>
	<li>Führen Sie das Gel 150 V für 60 min und Fleck Färbung das Gel mit kolloidalem Coomassie, silbernen Fleck oder eine andere Methode geeignet für anschließende massenspektrometrische Analyse.</li>
	<li>Analysieren Sie die sichtbaren Proteinspots mit massenspektrometrischer Methoden wie Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) oder LC-MS/MS Massenspektrometrie. Hinweis: Wir empfehlen, um die kolloidalen Coomassie-Färbung wie bereits beschrieben33zu verwenden. In unseren Händen sogar weniger reichlich Proteine kann ausreichend gebeizt und ermöglicht eine massenspektrometrische Analyse mit angemessenen Datenqualität.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Phloem ist ein Fach von großem Interesse, da es den wichtigsten Transportweg für Photoassimilates bildet, und auch ist für Langstrecken Signalisierung zwischen verschiedenen pflanzlichen Teile9,20,34, 35. Neben kleinen Molekülen haben Makromoleküle wie Proteine und RNA mit Phloem Wartung und Signalisierung4,7,8verwickelt. Die Analyse der Zusammensetzung der Phloem ist durch die eingeschränkte Erreichbarkeit auf Phloem Proben in den meisten Pflanzenarten beschränkt. Die Insekten Mandrin Technik ist vielseitig einsetzbar, sondern experimentell anspruchsvoll und resultiert in sehr geringen Mengen von Phloem Proben11. Eine einfache Technik zum Phloem Probenahme ist EDTA erleichtert Exsudation12. EDTA bilden zweiwertige Ionen wie Calcium und verhindert somit Schließung der Sieb Platten von P-Proteine und Zellstress. Es ist einfach zu bedienen, aber ist anfällig für Verunreinigungen durch beschädigte Zellen und Proben verdünnt. Abbauende zweiwertige Ionen durch EDTA könnte auch zu einem Zusammenbruch der bestehenden Anlagen führen. Allerdings ermöglicht es Probenahme aus einer Vielzahl von Arten, einschließlich der Modellpflanze A. Thaliana15. Spontane Exsudation von Phloem Sap tritt nur in einer kleinen Anzahl von Pflanzenarten. Es ist eine invasive Methode, die erheblichen Verletzungen der Pflanze Gewebe10beinhaltet. Vor kurzem haben wir als eine Art Modell für das Studium Fernverkehr4,8,20 B. Napus etabliert. Hier können Sie Phloem Sap von kleinen Einschnitten, probieren die Verwundung Effekte und Kontaminationsquellen reduziert.
Verwenden verschiedene Stichprobenverfahren, das Proteom von Phloem Proben aus verschiedenen Pflanzenarten wurde untersucht in den letzten Jahren7,8,17,36,37, 38,39. Für diese Studien Proteom Proteine wurden extrahiert und unter denaturierenden Bedingungen ausgefällt und erlauben daher keinerlei Rückschlüsse auf Protein: Protein und Protein: Nukleinsäure-Interaktionen unter heimischen Bedingungen zu präsentieren. Co-Immunopräzipitation (CoIP) und Overlay-Assays zeigten, dass eine große Ribonucleoprotein komplexe könnte im Phloem-Saft von Kürbis40vorhanden, aber es nicht nachgewiesen wurde, dass makromolekulare komplexe unter heimischen Bedingungen innerhalb existieren der Phloem-System.
Blaue native Seite, eingeführt durch Schägger Et al. 26, in Kombination mit weiteren hochauflösenden Gel-Elektrophorese Schritte ermöglichen die Trennung der einzelnen Komponenten der große Proteinkomplexe. Mit 3D-Seite Analysen der native B. Napus Phloem Exsudat, konnten wir kürzlich zeigen, dass mehrere im Phloem Proben existieren hohen Molekulargewicht Protein: Protein und RNP-komplexe enzymatisch aktive4 sind. Alternative Methoden um Proteinkomplexe sowie RNPs zu isolieren, wie Größe Ausgrenzung Chromatographie existieren könnte, aber nicht in Bezug auf Auflösung im Vergleich zu BN-Seite. Darüber hinaus für eine angemessene Qualität der komplexen Trennung müssen Größe Ausgrenzung Spalte Matrizen die insgesamt komplexer Molekulargewichte untersucht angepasst werden. Analysieren komplexe unterschiedlicher Größe werden daher fordern verschiedene Typen von Spalten ist kostenintensiv und lässt sich nicht als hohe Fokussierung macht als BN-Seite.
Wichtige Schritte um komplexe aus B. Napus zu analysieren sind den Gesamtbetrag der Phloem Sap als Ausgangsmaterial verwendet. Mindestens 600 µL Phloem Probe sind notwendig und können aus fünf gut-gewässerten Pflanzen gewonnen werden. Für 3D-Seite und BN Nordbeflecken ist es notwendig, das erste BN-Gel mit einer ausreichenden Menge von Phloem Proben beginnen. Um dies zu erreichen, sind Phloem Proben konzentriert, bis gut und mindestens 20 bis 30 µg Protein in jeder geladen werden kann, dass Triplicates der gleichen Probe parallel ausgeführt werden. Zu niedrige oder zu hohe Konzentrationen reduzieren die Erkennung von komplexen (Abbildung 3). Phloem Proben müssen in Reaktionsgefäßen auf Eis gesammelt und eingefroren für die spätere Verwendung zur Vermeidung von Proteinabbau und Umsatz gespeichert werden soll. Protease-Inhibitoren sind in allen Phloem Proteome analysiert gefunden worden, aber auch ein vollaktives Proteasom in das Phloem von B. Napus4beschrieben wurde. Darüber hinaus abhängig von Volumen und Zusammensetzung Phloem Proben die Sampling-Zeit-Punkt und Umweltbedingungen10. Daher muss darauf geachtet werden, zur gleichen Zeit des Tages unter ähnlichen Bedingungen zu sammeln. Stress-Behandlungen (z.B. Trockenheit) reduzieren die Menge der Bast, die gesammelt werden können. Um einzelne Proteine durch Massenspektrometrie zu identifizieren, ist es zwingend erforderlich, um mögliche Keratin Verunreinigungen durch tragen von Handschuhen die Zeit zu begrenzen. Keratin führt zu zusätzlichen Signale während der Masse Spec Analyse und Proteinidentifikation behindert. Ausführen der BN-Seite an eine höhere Spannung oder bei Raumtemperatur führen zur Erwärmung des Gels, die Demontage der fragilen komplexe führen können.
Die hier vorgestellten Protokoll eignet sich für die Analyse von Protein: Protein-komplexe. Wir zeigen auch, dass es verwendet werden kann, um bestimmte RNAs enthalten in den komplexen parallel zu erkennen. Um dies zu erreichen, haben wir vor kurzem ein Protokoll für northern Blot-4BN eingeführt. RNAs sind anfällig für Abbau durch RNAse Verunreinigungen. Um diesen Abbau zu begrenzen sollte DEPC-behandelte Wasser verwendet werden.
Wichtigste Einschränkungen der vorgestellten Methode gehören die Schätzung des Molekulargewichtes von Proteinkomplexen getrennt von BN-Seite, da Migrationsverhalten auf Größe, Form und auch posttranslationale Modifikationen der komplexe31abhängt, 41. Abschätzung der Größe der RNP-komplexe ist noch komplizierter durch den Einfluss von Nukleinsäuren auf das Migrationsverhalten. Es kann auch nicht verhindert werden, dass komplexe gleicher Größe in einem einzigen Band Co migrieren. Dies führt zu der falschen Vorhersage von komplexen Kompositionen. Überprüfen daher die beobachteten Interaktionen mit komplementären Techniken, kann z. B. durch funktionelle Assays4, erforderlich sein. Auch verloren nur schwach oder vorübergehend zu einem makromolekulare Komplex verbundenen Proteine in der BN-Puffer verwendet. Um dies zu vermeiden, könnte Proben vernetzt, was auch zu Artefakten führen können oder nicht Proteinidentifikation, oder der Pufferbedingungen optimiert werden.
Im Gegensatz zu klassischen 2D-Seite, die Kombination von Harnstoff und SDS-PAGE ermöglicht die Trennung nach Hydrophobie und Molekulargewicht statt isoelektrischen Punkt (pI) und Molekulargewicht 28, und schränkt nicht die Trennung an Proteine von einem spezifische pI reichen. Ähnlich wie bei klassischen 2D-Seite, getrennten Proteine sind als einzelne Flecken sichtbar, aber auf einer diagonalen Linie 4,28 (Abbildung 5, Abbildung 6). Weitere hydrophobe Proteine erscheinen in Flecken über diese Diagonal, während mehr hydrophile Proteine sich unterhalb der Linie28 befinden. In diesem Protokoll verwendeten Polyacrylamid-Konzentrationen werden Proteine zwischen 25 bis 80 kDa gut zu trennen. Ermöglicht einer Trennung von kleineren oder größeren Proteinen die Polyacrylamid Konzentration variiert werden oder Farbverlauf Gele eingesetzt werden, in der dritten Dimension. Die Komponenten des komplexen IV (Abbildung 3) getrennt durch 3D-Seite (Abbildung 6) wurden ausgeschnitten, Trypsin verdaut und durch Massenspektrometrie analysiert. Dies führte bei der Identifizierung von mehreren tRNA Ligases. Die Komponenten der anderen Anlagen wurden vor kurzem veröffentlicht 4. Unsere 3D-Seite aktiviert die Trennung der verschiedenen Ligases, nämlich Aspartat-, Asparagin, Threonin, Lysin und Glycin Ligases mit ähnlichen Molekulargewichten (Tabelle 3). Mit einer Methionin-tRNA-spezifische-Sonde, wir konnten potenziell gebundene tRNA innerhalb komplexer IV erkennen, aber wenn in voller Länge tRNA oder tRNA Fragmente in der Anlage sind kann nicht mit den Sonden verwendet diskriminiert werden. Um zu überprüfen, wenn die Nukleinsäuren wirklich gefesselt innerhalb des Komplexes und Co nicht migrieren sind, Protease Phloem Sap verdaut können Proben als geeignete Migration Kontrollen dienen.
Es wurde bereits spekuliert, dass Protein Übersetzung im Phloem Sieb Röhren, auftreten kann, da fast die meisten Komponenten der gesamten Ribosom sowie Dehnung Faktoren im Phloem Proben4,7gefunden worden sind. Unsere Feststellung der tRNA und tRNA Ligases scheint diese Idee zu unterstützen. Allerdings tRNA Fragmente vorhanden im Phloem Proben aus Kürbis haben gezeigt, dass potente Inhibitoren der Übersetzung42 werden und funktionelle Ribosomen scheinen zu fehlen4, was darauf hindeutet, dass die Übersetzung nicht stattfinden kann.
Zusammengenommen kann das Protokoll hier präsentierten die Trennung von nativen Protein: Protein und sogar RNP komplexe aus Bast Proben und die Trennung und Identifizierung ihrer einzelnen Komponenten mit hoher Auflösung. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht die Entdeckung neuartiger Protein und RNP-komplexe im Phloem Proben und kann daher neue Funktionen in diesem hoch spezialisierten Werk Fach aufzuklären.

Die Langstrecken das Phloem-Conduits sind essentiell für die Verteilung von Nährstoffen in höheren Pflanzen, sondern sind auch beteiligt bei der Regulierung der vielen verschiedener Prozessen wichtig für Wachstum und Entwicklung, Erreger Verteidigung und die Anpassung an den negativen Umweltbedingungen. Neben kleinen Effektoren wie Ionen, Phytohormonen oder Metaboliten selbst sind Makromoleküle wie Proteine und RNA als potentielle Signale vor kurzem entstanden.
Studien haben gezeigt, dass Phloem Laden von Proteinen Größe abhängig und kontrollierten durch Ausgrenzung Größenbeschränkung (SEL) der Pore-plasmodesmal Einheiten verbinden Begleiter Zellen (CC) und sieben Elemente (SE), die typischerweise im Bereich von 10 bis > 67 kDa1 , 2 , 3. jedoch trotz dieser Größe Beschränkungen größere Proteine und Protein komplexe innerhalb des Systems der Phloem herausfordernde Idee der Größe Ausgrenzung4gefunden wurden, und auch unspezifische Verlust von Proteinen aus CC SE wurde vorgeschlagen5 .
Multi sowie große Ribonucleoprotein komplexe spielen entscheidende Rolle bei der Biosynthese und Aufrechterhaltung der strukturellen Integritätdes der Zelle6. Es gibt Hinweise darauf, dass Protein-Protein und Ribonucleoprotein komplexe Phloem-Mobile gibt es4,7, aber bisher ist wenig über ihre Funktion bekannt. Im Phloem Siebelemente Protein: Protein und RNP-komplexe mit Fernverkehr und / oder Signalisierung8,9verwickelt. Um die Funktionen der translozierten komplexe, studieren ihre Zusammensetzung unter verschiedenen ökologischen zu entwirren oder stress Bedingungen ist erforderlich. Um dies zu erreichen, haben einheimische komplexe isoliert werden und ihre Komponenten mit ausreichender Auflösung getrennt werden.
Um hohen Molekulargewicht komplexe aus dem Phloem zu isolieren, ist es zunächst notwendig zu SAP-Proben in ausreichender Qualität und Menge zu erhalten. Die Technik, die für Phloem Probenahme verwendet werden kann hängt von der Pflanzenart von Interesse. Drei Hauptmethoden, Phloem Sap zu erhalten gibt es 10: Insekt Stylectomy11, EDTA erleichtert Exsudation12und spontane Exsudation13.
Phloem Proben von Arabidopsis Thaliana (A. Thaliana), der wichtigsten Modellpflanze in Laboren weltweit, erhalten Sie nur durch EDTA erleichtert Exsudation oder Blattlaus Stylectomy14,15. Beide Methoden führen zu stark verdünnte Phloem Sap oder sehr niedrigen Probe Beträge. EDTA-erleichtert Exsudation ist auch anfällig für Verschmutzung und kann nicht die reale Phloem Zusammensetzung16darstellen. Spontane Phloem Exsudation beschränkt sich auf Pflanzenarten wie Kürbisgewächse, Lupine oder Yucca, wohin führt Pflanzenteile abschneiden, eine spontane Emission von Phloem Sap, die leicht erhobenen13,17,18werden können, 19. Wir vor kurzem errichtet Raps (Brassica Napus) als Modellsystem für Phloem Analyse geeignet, denn es ist ein naher Verwandter von A. Thaliana und mehrere Mikroliter der Phloem Sap kann erfragt werden kleine Einschnitte, die gezeigt wurden sein hoher Reinheit4,8,20. Darüber hinaus wurde die Genomsequenz B. Napus 201421veröffentlicht.
Mit Ausnahme der Blattlaus Stylectomy alle Phloem Erhebungsmethoden beschrieben gehören Beschädigung des umgebenden Gewebes am Ort der Probenahme und die Zusammensetzung der Phloem Sap variieren in Reaktion auf eine Verletzung. Daher ist es unerlässlich, um die Qualität von Phloem Proben, unabhängig von der Sampling-Methode angewendet. Es gibt verschiedene Methoden zur Qualitätskontrolle von gesammelten Phloem Sap, z.B. durch Bestimmung der RNase Aktivität22,23, RT-PCR mit Primer gegen Rubisco8,24, oder die Analyse des Zuckers Zusammensetzung-8.
Verschiedene Methoden zu isolieren und zu trennen Proteinkomplexe aufgebracht werden können, einschließlich Größe Ausgrenzung Chromatographie, Saccharose Dichte Ultrazentrifugation oder Probenfiltration durch Membranen mit unterschiedlichen Molekulargewicht Cut Offs. Allerdings erlauben diese Ansätze keine hohen Auflösung. Die Technik namens blau native Seite (BN-Seite), erstmals von Schägger Et al.beschrieben. 25, ist überlegen in Bezug auf Auflösung. Es wurde erfolgreich verwendet, um festzustellen, die Molmassen von großen systemeigene Proteinkomplexen aus verschiedenen Organellen oder zellulären Lysates und ihre relativen Häufigkeiten26,27.
Um die komplexe Zusammensetzung von Proteinkomplexen weiter zu erhellen, ist es notwendig, die einzelnen Komponenten unter denaturierenden Bedingungen führt zu komplette Demontage komplexer Bauteile zu trennen. Dies kann durch eine zweite Dimension der SDS-PAGE 28,29 oder höheren Auflösung, durch eine zweite Dimension der isoelektrischen Fokussierung (IEF) gefolgt von einer Third dimension von SDS-PAGE30 und spätere Identifikation der zu erreichen die Proteine mittels Massenspektrometrie.
In diesem Protokoll beschreiben wir Probenahme von reinen Phloem-Saft von B. Napus Pflanzen und die Analyse von Proteinkomplexen aus solchen Phloem Proben mit einem 3D elektrophoretischen Ansatz BN-Seite mit Tris-Tricine-Harnstoff-PAGE und SDS-PAGE zu verbinden. Die getrennten Protein komplexen Bauteile werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert. Darüber hinaus führen wir als eine Methode, die Erkennung von RNAs in großen RNP-komplexe4blau native Nordbeflecken erweitert die Anwendbarkeit des Ansatzes.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Reaktionsgefäße</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>10-Well-Kamm für SDS PAGE, Dicke 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung (29:1) Lösung</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung (37,5:1) Lösung</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>96 % Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumsulfat-(14-18)-hydrat</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumperoxodisulfat (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalkonzentratoren z.B. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>Chemilumineszenz-Nukleinsäure-Detektionsmodul-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Chromatographie-Papiere z.B. 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 System</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol abs.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imaging System z.B. Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen z.B. GFL Hybridisierungs-Inkubator 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsnadel (0,8 mm)</td><td>B Braun</td><td>4658309</td><td></td></tr><tr><td>IPG Gelkamm, Dicke 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>Markierung von RNA z.B. Biotin 3'end DNA Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>Natives Gradientengel z.B. Novex NativePAGE 4&ndash; 16% Bis-Tris Protein Gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Membran z.B. Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Ortho-Phosphorsäure</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler vorgefärbte Proteinleiter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Netzteil für Gelelektrophorese EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>erhältlich im GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Semi Dry Blot z. B. . Fastblot 43B halbtrockener Blot</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>Synthese von cDNA z.B. RevertAid Erststrang-cDNA-Synthesekit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricin</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat-Dihydrat</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol-Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridisierungspuffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vernetzer z.B. Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>von Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Vertikales Elektrophoresegerät z.B.The XCell SureLock Mini-Cell oder Mini-Protean III System</td><td>Thermo Fisher Scientific oder BioRad</td><td>EI0001 oder 1658004</td><td></td></tr><tr><td>Scheibenwischer z.B. KIMWIPES Delicate Scheibenwischer</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

phloem sap probenahme aus brassica napus für 3d-seite von protein und ribonucleoprotein komplexe

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Probenahme das Phloem der höheren Pflanzen ist oft mühsam und wesentlich abhängig von der Pflanzenart. Proteom-Studien unter denaturierenden Bedingungen konnte jedoch in verschiedenen Pflanzenarten erreicht werden. Nativen Protein: Protein und Eiweiß: Nukleinsäure-komplexe aus Bast Proben noch kaum analysiert wurden, obwohl sie eine wichtige Rolle in der Wartung von diesem spezialisierten Fach oder im Fernverkehr Signalisierung spielen könnte. Große molekularen Baugruppen können isoliert mit einer blauen gebürtige Gelelektrophorese (BN-Seite) werden. Ihre Proteinkomponenten können durch eine anschließende Natriumsulfat der Dodecyl Seite (SDS-PAGE) getrennt werden. Allerdings migrieren Co Proteine mit ähnlichen Molekulargewichten, was kann Proteinidentifikation durch Massenspektrometrie behindern. Kombination von BN-Seite mit zwei verschiedenen Geruchsstoffen Gel-Elektrophorese Schritten, nämlich Tris-Tricine-Harnstoff und SDS-PAGE, ermöglicht die weitere Trennung der Proteine nach ihrer Hydrophilie/Hydrophobie und erhöht somit Auflösung und den Erfolg der Proteinidentifizierung. Es erlaubt sogar die Proteine, die unterscheiden sich nur in ihrer posttranslationale Modifikationen zu unterscheiden. Darüber hinaus kann blau native Nordbeflecken angewendet werden, um die RNA-Komponenten in makromolekulare komplexe zu identifizieren. Wir zeigen, dass unser Protokoll geeignet, das Protein und die RNA-Komponenten von nativen Protein: Protein und Ribonucleoprotein (RNP) komplexe im Phloem Proben zu entwirren. Kombination von einem blauen native Seite mit zwei verschiedenen Geruchsstoffen Seite Schritte kann dazu beitragen, um verschiedene Arten von großer Proteinkomplexe zu trennen und ermöglicht auch eine höhere Erkennungsrate von deren Komponenten durch Massenspektrometrie. Darüber hinaus ist das Protokoll robust genug, um gleichzeitig potenziell gebundenen Nukleinsäuren in einzelne Protein-komplexe erkennen.

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Proteinzusammensetzung von großen native Protein: Protein und Protein zu analysieren: Nukleinsäure-komplexe aus Raps (B. Napus) Phloem Exsudat mit einem 3D Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Ansatz kombiniert blau Native (BN) mit zwei denaturierenden Seiten gefolgt von massenspektrometrische Identifizierung.

Phloem Sap Probenahme aus Brassica Napus für 3D-Seite von Protein und Ribonucleoprotein komplexe

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

Das übergeordnete Ziel dieses 3D-PAGE-Verfahrens ist die Trennung von Protein- und Ribonukleoproteinkomplexen aus dem Saft von Brassica napus ploem, gekoppelt mit der Identifizierung der jeweiligen Nukleinsäure- und Proteinkomponenten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Biochemie und Pflanzenphysiologie zu beantworten. So können Sie z.B. die Zusammensetzung von Phloemkomplexen unter Stress analysieren.Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass reiner Phloemsaft gesammelt und Nukleinsäuren sowie Proteinkomponenten gleichzeitig analysiert werden können. Obwohl diese Methode Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren innerhalb des Phloemsystems von Raps geben kann, kann sie auch auf die Phloemanalyse anderer Pflanzen wie Kürbisgewächse, Lupinen und Yucca angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir versuchten, Protein- und RNA-Interaktionspartner für ein bestimmtes Phloemprotein zu identifizieren.Zuerst stechen Sie den blütenlebenden Stängel einer acht Wochen alten B.napus-Pflanze mehrmals mit einer 0,8 Millimeter großen Injektionsnadel ein. Durchstechen Sie mehrere andere blütenstehende Stängel derselben Pflanze und anderer Pflanzen, um genügend Phloemsaft zu erhalten. Wischen Sie den ersten Tropfen von jeder verletzten Stelle mit Filterpapier ab.Nachdem Sie die ersten Tropfen entfernt haben, verwenden Sie eine Pipette, um die restlichen Tropfen aufzufangen. Und geben Sie sie in ein vorgekühltes konisches 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Anschließend wird das gesammelte Exsudat bei minus 20 Grad Celsius in einem eisfreien Kühlsystem gelagert.Sammeln Sie so lange Tropfen, bis keine weitere Tropfenbildung mehr beobachtet wird, jedoch nicht länger als eine Stunde. Geben Sie als Nächstes die Phloemprobe in einen Zentrifugalkonzentrator mit einem Molekulargewicht von 10.000 Dalton und konzentrieren Sie sich auf etwa 1/6 des ursprünglichen Volumens. Zentrifugieren Sie dann die konzentrierte Probe mindestens 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 20.000 g, um Staubpartikel zu entfernen.Um eine blaue native PAGE durchzuführen, bauen Sie die Gelkammer zusammen. Und fügen Sie der Hälfte dunkelblauen Kathodenpuffer B hinzu und waschen Sie die Vertiefungen mit dem Kathodenpuffer. 20 bis 30 Mikrogramm der konzentrierten Proteinprobe pro Vertiefung werden in mindestens dreifacher Ausfertigung auf ein kommerzielles Bis-Tris-Strahlungsgel geladen.Füllen Sie die Kammer mit Kathoden- und Anodenpuffer und lassen Sie das Gel bei vier Grad Celsius und 150 Volt laufen, bis die Probe 1/3 des Gels passiert hat, was 20 bis 30 Minuten dauert. Pausieren Sie den Lauf und tauschen Sie den dunkelblauen Kathodenpuffer B gegen den hellblauen Kathodenpuffer B 1/10 aus. Starten Sie den Lauf neu und fahren Sie fort, bis die blaue Front aus dem Gel zu eluieren beginnt, was 120 bis 180 Minuten dauert.Schneiden Sie eine ganze Gelbahn aus dem nativen blauen Gel aus, übertragen Sie es dann durch halbtrockenes Abtupfen auf eine Nylonmembran und markieren Sie die oberen und unteren Gelränder auf der Membran mit einem Bleistift. Waschen Sie die Membran nach dem Abtupfen mit DEPC-behandeltem Wasser und legen Sie sie zum Trocknen zwischen zwei Stücke Filterpapier. Anschließend wird die gefleckte Membran mit einer aufgewendeten Energie von 120.000 Mikrojoule pro Quadratzentimeter UV-Vernetzung durchgeführt.Nun wird die UV-vernetzte Membran mit sechs Millilitern Hybridisierungspuffer für 60 Minuten bei 68 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen vorhybridisiert. Geben Sie der Membran einen zusätzlichen Milliliter Hybridisierungspuffer mit vier Mikrolitern biotinylierter 3-Prime-Sonden hinzu. Inkubieren Sie dann die Membran über Nacht mit der Sonde, während Sie den Hybridisierungsofen von 68 auf 37 Grad Celsius abkühlen.Waschen Sie die Membran am nächsten Tag fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Puffer, der 2x SSC und 0,1 % SDS enthält, um unspezifisch gebundene Sonden zu entfernen. Führen Sie die Detektion der 3-prime-biotinylierten Sonden auf der Membran mit einem Streptavidin-HRP-Konjugat und Luminol als Meerrettichperoxidase-Substrat durch, was zu einer empfindlichen Chemilumineszenzreaktion führt. Schneiden Sie einzelne Banden aus dem blauen nativen Gel heraus.Kombinieren Sie Banden aus Proben, die in parallelen Bahnen in einem konischen 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen laufen, um eine weitere Konzentration komplexer Proteine zu erreichen. Um ein 12%iges Tris-Tricin-Harnstoffgel herzustellen, gießen Sie 10 Milliliter Gellösung A zwischen zwei Glasplatten und überziehen Sie es mit Isopropanol. Entfernen Sie nach der Polymerisation das Isopropanol, fügen Sie dem Gel zwei bis drei Milliliter Gellösung B hinzu und führen Sie einen 10-Well-Kamm ein.Zur Äquilibrierung der exzidierten Gelstücke wird ein Milliliter 2x SDS-Probenpuffer in das Reaktionsröhrchen gegeben. Nachdem die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde, wird sie in einem Heizblock bei 95 Grad Celsius etwa eine Minute lang erhitzt. Dann inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.Anschließend stapeln Sie mehrere äquilibrierte Gelstücke, die denselben Komplex repräsentieren, in eine einzige Geltasche. Führen Sie nach dem Zusammenbau der Gelkammer eine Elektrophorese mit Anoden- und Kathodenpuffern bei 150 Volt für 45 bis 60 Minuten durch. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die gesamte Gelspur.Inkubieren Sie die geschnittene Gelbahn 20 Minuten lang in saurem Puffer. Dann in 125 millimolaren Tris-HCL bei pH 6,8 für weitere 20 Minuten äquilibrieren. Gießen Sie eine 15%ige SDS-Trenngellösung nach Lanely ein.Sobald das Gel fest wird, entfernen Sie das Isopropanol, fügen Sie drei Milliliter einer 4%igen Stapelgellösung hinzu und führen Sie den speziellen Kamm für IPG-Gele ein. Nach der Erstarrung übertragen Sie die Equilibrat-Gel-Lane auf das SDS-Gel und bedecken das Gel mit 0,5 % Agarose in 1x SDS-Laufpuffer, der mit einer Spur Bromphenolblau ergänzt wird. Lassen Sie das Gel nach dem Zusammenbau der Gelkammer 60 Minuten lang bei 150 Volt laufen.Wenn Sie fertig sind, färben Sie das Gel mit kolloidaler Kumasi-Lösung für die anschließende massenspektrometrische Analyse. Analysieren Sie schließlich die sichtbaren Proteinflecken mit Hilfe der matrixgestützten Laserdesorptionsionisations-Flugzeitspektrometrie. Ein repräsentatives Ergebnis, das aus einer reinen Phloemprobe gewonnen wurde, ist hier dargestellt.Nicht kontaminierte Phloemproben zeigen eine sichtbare Bande für das Thioredoxinalter, während kein Signal für RuBisCO und das Pollenhüllenprotein beobachtet wird. Mindestens vier Hauptbanden des Proteinkomplexes werden nach der BN PAGE des Saftes von B.napus phloem sichtbar. Zu niedrige oder zu hohe Konzentrationen von Phloemsaft erlauben keine klare Trennung der Komplexe.Eine hochauflösende Trennung wird in 3D PAGE aufgrund des unterschiedlichen Proteinmigrationsverhaltens in den Harnstoff- und SDS-PAGE-Gelen beobachtet. Typischerweise sind Proteine, die zu einem einzigen Komplex gehören, als diagonale Linie über das Gel sichtbar. Proteine oberhalb dieser Linie weisen eine erhöhte Hydrophobizität auf, während Proteine unterhalb dieser Linie hydrophiler sind.Das BN-Northern-Blotting zeigt, dass eine spezifische tRNA nur in einem bestimmten Komplex vorkommt. Massenspektrometrische Analysen zeigten, dass dieser Komplex hauptsächlich tRNA-Ligasen enthält, was die tRNA-Bindungsaktivität bestätigt, die beim BN-Northern-Blot gefunden wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Handschuhe und einen Laborkittel zu tragen, um die Carotinkontamination zu minimieren, die die massenspektrometrische Analyse behindert. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zymogramme und Enzymassays mit gesammeltem Phloemsaft durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, wie z.B. komplexe Aktivitäts- und Inhibitionsstudien. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Pflanzenwissenschaften, um Komplexe mit mehreren Untereinheiten in Phloemproben verschiedener Pflanzenarten zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Phloemsaft aus Brassica napus-Pflanzen isoliert und wie man Proteinproteine und Proteinnukleinsäurekomplexe isoliert und analysiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit SDS, Acrylamid und TMET äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten unter der Kapuze mit Handschuhen und einem Laborkittel bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.

phloem-sap-sampling-from-brassica-napus-for-3d-page-protein

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die molekulare Basis der räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen wird untersucht mit Hilfe von transgenen Pflanzen, die Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom Mängel aufweisen. Die Isolierung von spezifischen Zellen mit induzierter Phytochrom-Chromophor Abreicherung durch Fluorescence-Activated Cell Sorting gefolgt von Microarray-Analysen wird genutzt, um Gene in räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen beteiligt sind.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Wir haben eine Technik, um Protein-Protein-Interaktionen in Anlage-Test entwickelt. Ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) ist in zwei nicht überlappende Fragmente aufgeteilt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse via Gateway-System geklont, wodurch Expression von Fusionsproteinen. Rekonstitution der YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteinen interagieren.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung und Charakterisierung von Pflanzenproteinkomplexen. Wir zeigen, dass durch Immunpräzipitation ein einzelnes Protein in einem Komplex, so können wir seine post-translationale Modifikationen und seinen Interaktionspartner zu identifizieren.

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

Die Kenntnis der Zusammensetzung des Phloemsaft sowie der Mechanismus ihrer Be-und Fernverkehr ist für das Verständnis der Langstrecken-Signalisierung in der Entwicklung von Pflanzen und Stress / Pathogen Reaktion und assimilieren Transport unerlässlich. Dieses Manuskript beschreibt die Sammlung von Phloemexsudaten mit der EDTA-Methode erleichtert.

Sammlung und Analyse von<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloemexsudaten Mit der EDTA-Methode erleichtert

Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare "Tags" für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

Dieses Protokoll beschreibt die optimierte Extraktion von Apoplast-Waschflüssigkeit aus Pflanzenblättern, wobei französische Bohnenpflanzen (Phaseolus vulgaris) als Modellbeispiel verwendet werden.

Die Infiltration-Zentrifugation Technik zur Gewinnung von apoplastischen Flüssigkeit aus Pflanzenblättern verwenden Phaseolus vulgaris Als Beispiel

Hier präsentieren wir ein Interaktom-Capture-Protokoll, das auf Arabidopsis thaliana Blatt-Mesophyll-Protoplasten angewendet wird. Diese Methode beruht kritisch auf in vivo UV-Vernetzung und ermöglicht die Isolierung und Identifizierung von p-mRNA-bindenden Proteinen aus einer physiologischen Umgebung.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Präsentiert wird hier ein phosphoprotemischer Ansatz, nämlich Stop-and-Go-Extraktionsspitze Phosphoproteomic, die hohen Durchsatz und tiefe Abdeckung von Arabidopsis phosphoproteome bietet. Dieser Ansatz beschreibt den Überblick über osmotische Stresssignale in Arabidopsis.

Phosphoproteomic Strategie zur Profilierung osmotischer Stresssignalisierung bei Arabidopsis

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur histologischen Beobachtung von Gallen, die durch Plasmodiophora brassicae induziert werden. Vibratomschnitte von Hypokotylen werden vor der Fluoreszenzbildgebung entfernt, um die Beteiligung von Transkriptionsfaktoren und Phytohormonen während des Krankheitsverlaufs zu untersuchen. Dieses Protokoll überwindet Einschränkungen bei der Einbettung von Harz und ermöglicht die Visualisierung fluoreszierender Proteine in planta .

Kombination von Clearing- und Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Veränderungen der Genexpression und physiologischen Reaktionen auf Plasmodiophora brassicae

Erfahren Sie die 3D-PAGE-Methode zur Isolierung und Analyse von Protein- und Ribonukleoproteinkomplexen aus dem Phloem-Saft von Brassica napus. Diese Technik ermöglicht die hochauflösende Trennung und Identifizierung von Proteinen und RNA-Komponenten.

Phloem Sap Probenahme aus Brassica Napus für 3D-Seite von Protein und Ribonucleoprotein komplexe

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