Phloem Sap Probenahme aus Brassica Napus für 3D-Seite von Protein und Ribonucleoprotein komplexe

Das übergeordnete Ziel dieses 3D-PAGE-Verfahrens ist die Trennung von Protein- und Ribonukleoproteinkomplexen aus dem Saft von Brassica napus ploem, gekoppelt mit der Identifizierung der jeweiligen Nukleinsäure- und Proteinkomponenten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Biochemie und Pflanzenphysiologie zu beantworten. So können Sie z.B. die Zusammensetzung von Phloemkomplexen unter Stress analysieren.

Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass reiner Phloemsaft gesammelt und Nukleinsäuren sowie Proteinkomponenten gleichzeitig analysiert werden können. Obwohl diese Methode Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren innerhalb des Phloemsystems von Raps geben kann, kann sie auch auf die Phloemanalyse anderer Pflanzen wie Kürbisgewächse, Lupinen und Yucca angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir versuchten, Protein- und RNA-Interaktionspartner für ein bestimmtes Phloemprotein zu identifizieren.

Zuerst stechen Sie den blütenlebenden Stängel einer acht Wochen alten B.napus-Pflanze mehrmals mit einer 0,8 Millimeter großen Injektionsnadel ein. Durchstechen Sie mehrere andere blütenstehende Stängel derselben Pflanze und anderer Pflanzen, um genügend Phloemsaft zu erhalten. Wischen Sie den ersten Tropfen von jeder verletzten Stelle mit Filterpapier ab.

Nachdem Sie die ersten Tropfen entfernt haben, verwenden Sie eine Pipette, um die restlichen Tropfen aufzufangen. Und geben Sie sie in ein vorgekühltes konisches 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Anschließend wird das gesammelte Exsudat bei minus 20 Grad Celsius in einem eisfreien Kühlsystem gelagert.

Sammeln Sie so lange Tropfen, bis keine weitere Tropfenbildung mehr beobachtet wird, jedoch nicht länger als eine Stunde. Geben Sie als Nächstes die Phloemprobe in einen Zentrifugalkonzentrator mit einem Molekulargewicht von 10.000 Dalton und konzentrieren Sie sich auf etwa 1/6 des ursprünglichen Volumens. Zentrifugieren Sie dann die konzentrierte Probe mindestens 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 20.000 g, um Staubpartikel zu entfernen.

Um eine blaue native PAGE durchzuführen, bauen Sie die Gelkammer zusammen. Und fügen Sie der Hälfte dunkelblauen Kathodenpuffer B hinzu und waschen Sie die Vertiefungen mit dem Kathodenpuffer. 20 bis 30 Mikrogramm der konzentrierten Proteinprobe pro Vertiefung werden in mindestens dreifacher Ausfertigung auf ein kommerzielles Bis-Tris-Strahlungsgel geladen.

Füllen Sie die Kammer mit Kathoden- und Anodenpuffer und lassen Sie das Gel bei vier Grad Celsius und 150 Volt laufen, bis die Probe 1/3 des Gels passiert hat, was 20 bis 30 Minuten dauert. Pausieren Sie den Lauf und tauschen Sie den dunkelblauen Kathodenpuffer B gegen den hellblauen Kathodenpuffer B 1/10 aus. Starten Sie den Lauf neu und fahren Sie fort, bis die blaue Front aus dem Gel zu eluieren beginnt, was 120 bis 180 Minuten dauert.

Schneiden Sie eine ganze Gelbahn aus dem nativen blauen Gel aus, übertragen Sie es dann durch halbtrockenes Abtupfen auf eine Nylonmembran und markieren Sie die oberen und unteren Gelränder auf der Membran mit einem Bleistift. Waschen Sie die Membran nach dem Abtupfen mit DEPC-behandeltem Wasser und legen Sie sie zum Trocknen zwischen zwei Stücke Filterpapier. Anschließend wird die gefleckte Membran mit einer aufgewendeten Energie von 120.000 Mikrojoule pro Quadratzentimeter UV-Vernetzung durchgeführt.

Nun wird die UV-vernetzte Membran mit sechs Millilitern Hybridisierungspuffer für 60 Minuten bei 68 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen vorhybridisiert. Geben Sie der Membran einen zusätzlichen Milliliter Hybridisierungspuffer mit vier Mikrolitern biotinylierter 3-Prime-Sonden hinzu. Inkubieren Sie dann die Membran über Nacht mit der Sonde, während Sie den Hybridisierungsofen von 68 auf 37 Grad Celsius abkühlen.

Waschen Sie die Membran am nächsten Tag fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Puffer, der 2x SSC und 0,1 % SDS enthält, um unspezifisch gebundene Sonden zu entfernen. Führen Sie die Detektion der 3-prime-biotinylierten Sonden auf der Membran mit einem Streptavidin-HRP-Konjugat und Luminol als Meerrettichperoxidase-Substrat durch, was zu einer empfindlichen Chemilumineszenzreaktion führt. Schneiden Sie einzelne Banden aus dem blauen nativen Gel heraus.

Kombinieren Sie Banden aus Proben, die in parallelen Bahnen in einem konischen 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen laufen, um eine weitere Konzentration komplexer Proteine zu erreichen. Um ein 12%iges Tris-Tricin-Harnstoffgel herzustellen, gießen Sie 10 Milliliter Gellösung A zwischen zwei Glasplatten und überziehen Sie es mit Isopropanol. Entfernen Sie nach der Polymerisation das Isopropanol, fügen Sie dem Gel zwei bis drei Milliliter Gellösung B hinzu und führen Sie einen 10-Well-Kamm ein.

Zur Äquilibrierung der exzidierten Gelstücke wird ein Milliliter 2x SDS-Probenpuffer in das Reaktionsröhrchen gegeben. Nachdem die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde, wird sie in einem Heizblock bei 95 Grad Celsius etwa eine Minute lang erhitzt. Dann inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Anschließend stapeln Sie mehrere äquilibrierte Gelstücke, die denselben Komplex repräsentieren, in eine einzige Geltasche. Führen Sie nach dem Zusammenbau der Gelkammer eine Elektrophorese mit Anoden- und Kathodenpuffern bei 150 Volt für 45 bis 60 Minuten durch. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die gesamte Gelspur.

Inkubieren Sie die geschnittene Gelbahn 20 Minuten lang in saurem Puffer. Dann in 125 millimolaren Tris-HCL bei pH 6,8 für weitere 20 Minuten äquilibrieren. Gießen Sie eine 15%ige SDS-Trenngellösung nach Lanely ein.

Sobald das Gel fest wird, entfernen Sie das Isopropanol, fügen Sie drei Milliliter einer 4%igen Stapelgellösung hinzu und führen Sie den speziellen Kamm für IPG-Gele ein. Nach der Erstarrung übertragen Sie die Equilibrat-Gel-Lane auf das SDS-Gel und bedecken das Gel mit 0,5 % Agarose in 1x SDS-Laufpuffer, der mit einer Spur Bromphenolblau ergänzt wird. Lassen Sie das Gel nach dem Zusammenbau der Gelkammer 60 Minuten lang bei 150 Volt laufen.

Wenn Sie fertig sind, färben Sie das Gel mit kolloidaler Kumasi-Lösung für die anschließende massenspektrometrische Analyse. Analysieren Sie schließlich die sichtbaren Proteinflecken mit Hilfe der matrixgestützten Laserdesorptionsionisations-Flugzeitspektrometrie. Ein repräsentatives Ergebnis, das aus einer reinen Phloemprobe gewonnen wurde, ist hier dargestellt.

Nicht kontaminierte Phloemproben zeigen eine sichtbare Bande für das Thioredoxinalter, während kein Signal für RuBisCO und das Pollenhüllenprotein beobachtet wird. Mindestens vier Hauptbanden des Proteinkomplexes werden nach der BN PAGE des Saftes von B.napus phloem sichtbar. Zu niedrige oder zu hohe Konzentrationen von Phloemsaft erlauben keine klare Trennung der Komplexe.

Eine hochauflösende Trennung wird in 3D PAGE aufgrund des unterschiedlichen Proteinmigrationsverhaltens in den Harnstoff- und SDS-PAGE-Gelen beobachtet. Typischerweise sind Proteine, die zu einem einzigen Komplex gehören, als diagonale Linie über das Gel sichtbar. Proteine oberhalb dieser Linie weisen eine erhöhte Hydrophobizität auf, während Proteine unterhalb dieser Linie hydrophiler sind.

Das BN-Northern-Blotting zeigt, dass eine spezifische tRNA nur in einem bestimmten Komplex vorkommt. Massenspektrometrische Analysen zeigten, dass dieser Komplex hauptsächlich tRNA-Ligasen enthält, was die tRNA-Bindungsaktivität bestätigt, die beim BN-Northern-Blot gefunden wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Handschuhe und einen Laborkittel zu tragen, um die Carotinkontamination zu minimieren, die die massenspektrometrische Analyse behindert. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zymogramme und Enzymassays mit gesammeltem Phloemsaft durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, wie z.B. komplexe Aktivitäts- und Inhibitionsstudien. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Pflanzenwissenschaften, um Komplexe mit mehreren Untereinheiten in Phloemproben verschiedener Pflanzenarten zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Phloemsaft aus Brassica napus-Pflanzen isoliert und wie man Proteinproteine und Proteinnukleinsäurekomplexe isoliert und analysiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit SDS, Acrylamid und TMET äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten unter der Kapuze mit Handschuhen und einem Laborkittel bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.