Name: Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung dendritischer Zellen aus dem weiblichen Fortpflanzungstrakt für immunologische Studien. Diese Methode ermöglicht die Bewahrung von Oberflächenmarkern und funktionelle Analysen in vitro.

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Studie von NIH unterstützt AI102838 und AI117739 (CRW) gewährt. Wir danken Richard Rossoll für technische Hilfe. Durchflusszytometrischen Analyse erfolgte in DartLab, die gemeinsame Ressource am Dartmouthsupported (P30CA023108-37) und (P30GM103415-15).

Nach den Grundsätzen, die in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebracht wurden Studien am Menschen durchgeführt. Studien wurden vom Dartmouth College Institutional Review Board und dem Ausschuss für den Schutz der menschlichen Themen (CPHS) genehmigt. Schriftliche Einwilligung war HIV-negativ Frauen Hysterektomien am Dartmouth Hitchcock Medical Center (Libanon, NH) vor der Operation entnommen. Ausgebildete Pathologen Gewebeproben aus der EM, CX und ECX, frei von pathologischen Läsionen und weit entfernt von den Stätten der Pathologie ausgewählt. Freiwilligen gesunden Spendern am Dartmouth Hitchcock Medical Center rekrutiert wurden Blutproben entnommen. Blutspender wurden anonym. Pathologie für Isolation und Klassifizierung vor, in unserem Labor in separaten, sterile Polypropylenröhrchen übertragen wurden frisch isolierte EM, CX und ECX Gewebe aus den OP-Saal übertragen.
(1) enzymatische Verdauung von Geweben
Hinweis: Verwenden Sie Sterilgut und arbeiten in einem biologischen Sicherheitsschrank.
<ol><li>Bereiten Sie eine modifizierte Hank ausgewogen Salz Lösung (HBSS) mit 1 X HBSS mit Phenol rot, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, 0,35 g/L Nahco33und 20 mM HEPES.</li>
	<li>Vorbereiten den enzymatischen Cocktail (HBSS, 450 U/mL Kollagenase IV, 0,01 % [wt/Vol] Deoxyribonuclease geändert, ich und 2 mg/mL D-Glucose). Eine sterile 0,22 µm-Filter durchlaufen Sie die Lösung. Im Idealfall bereiten die Verdauung Enzym am Tag der Nutzung, aber er bei-20 ° C zur Aufbewahrung eingefroren werden kann. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen Zyklen.</li>
	<li>Spülen Sie das Gewebe mit veränderter HBSS und in einer Petrischale 100 x 15 mm2 . Passen Sie die Petrischale Größe bezogen auf die Menge des Gewebes zur Verfügung und das Volumen des Enzyms cocktail verwendet (siehe Schritt 1.4.2 unten). Hinweis: Gewebe variieren in der Größe abhängig von der chirurgischen Probe aus der Pathologie, von 1 bis 10 g.</li>
	<li>Physikalische Aufbereitung mit Einweg Skalpell und Pinzette:<ol>
<li>Fügen Sie ca. 3 mL Verdauung Enzym cocktail des Gewebes zu verhindern Austrocknen während des Schneidens.</li>
		<li>Verwenden Sie Zange zur Stabilisierung des Gewebes und Hackfleisch mit einem Skalpell auf der Oberfläche des Gewebes, die Verdauung Enzym cocktail ausgesetzt zu vergrößern. Schneiden Sie das Gewebe, in kleine Stücke (< 2 mm auf einer Seite). Fügen Sie ausreichende Verdauung Enzym-Cocktail zur Deckung aller Gewebe Stücke (5 mL/g Gewebe). Setzen Sie den Deckel auf der Petrischale.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 auf ein Rotator mit ca. 80 u/min für 45 min. Stellen Sie sicher, dass die Rotor-Geschwindigkeit gründlich die Verdauung Enzym-Cocktail mischt ohne Verschütten oder Luftblasen zu produzieren.</li>
		<li>Die Gewebe-Vorbereitung mit einem inversen Licht Mikroskop mit 4 X und 10 X Ziele zu visualisieren. Hinweis: Nach der Verdauung, kleine Gewebefragmente und eine gemischte Zellsuspension einschließlich sichtbare epitheliale Drüsen sollte vorhanden sein (siehe Abbildung 1A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) eine räumliche Trennung von Einzelzellen
<ol><li>Legen Sie in einer sterilen Umgebung Netzchen straff 250 µm mit Halter in einer Petrischale 150 x 15 mm2 . Stellen Sie sicher, dass das Netz ca. 0,5 cm über der Oberfläche der Petrischale ist.</li>
	<li>Das Netz mit 2 mL modifizierte HBSS nass und das verdaute Gewebe auf das Netz zu übertragen.</li>
	<li>Verwenden die flache Oberfläche des einen 10-mL Spritzenkolben, sanft, aber bestimmt, Mahlen Sie das verdaute Hackfleisch / Gewebe durch die Maschen. Achtung: Schleifen zu aggressiv das Netz beschädigt und Zelle Sterblichkeit zu erhöhen. Dieser Schritt wird aus dem Bindegewebe und Schleim die Epithelzellen und Stromazellen Zellen (einschließlich Immunzellen) trennen.</li>
	<li>Sobald die Gewebefragmente gründlich verteilt wurden, haben zu erheben, das Netz und die Halter 2-3 cm oberhalb der Petrischale und Spülen mit 3 mL geändert HBSS, zusätzliche Zellen wiederherzustellen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellsuspension. Legen Sie 20 µm-Mesh mit Halter in einer Petrischale und nass mit 2 mL modifizierte HBSS. Gießen Sie die Zellsuspension durch die Maschen des Netzes halten ca. 2-3 cm oberhalb der Petrischale und Spülen mit 6 mL modifizierte HBSS. Hinweis: Dieser Schritt wird die epithelialen Blätter trennen, die auf der Oberseite, aus einzelnen Zellen erhalten bleiben, die durch die Maschen zu übergeben. Der Durchfluss ist eine gemischte Zellsuspension, Immunzellen und Stromazellen Fibroblasten umfasst.</li>
	<li>Sammeln Sie die gemischte Zellsuspension und Zentrifuge bei 500 X g für 10 min. Absaugen der Flüssigkeit und aufzuwirbeln Sie das Pellet in 4 mL modifizierte HBSS für Dichte-Gradienten-Zentrifugierung.</li>
	<li>Schicht der gemischte Zellsuspension über 3 mL Polysucrose-Lösung und Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 500 X g für 30 min mit keine Bremse. Das weiße Band von der Spitze der Polysucrose Lösung zu sammeln und mit PBS waschen. Hinweis: Diese Fraktion ist angereicherten gemischte Zellsuspension, die reich an Immunzellen und enthält einige Stromazellen Fibroblasten.</li>
</ol>3. tote Zelle entfernen
Hinweis: Wenn ein großer Prozentsatz der abgestorbenen Zellen (> 20 %) nach Dichte-Gradienten-Zentrifugierung in der angereicherten gemischte Zellsuspension vorhanden sind, empfiehlt sich tote Zelle entfernen mit magnetischen Beads. Abgestorbenen Zellen müssen entfernt werden, da sie das positive magnetische Wulst Auswahlverfahren stören können.
<ol><li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer auf einem Lichtmikroskop mit 10 X-Objektiv. Spin-down alle Zellen in der angereicherten gemischte Zellsuspension (500 x g, 10 min, 4 ° C). Vollständig abzusaugen und den Überstand verwerfen. Fügen Sie 100 µL tote Zelle entfernen Perlen pro 1 x 107 total Zellen (lebenden und Toten), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.</li>
	<li>Die magnetische Spalte 30 µm Filter aufsetzen, Auftragen der Zellsuspension und die Perle-markierten Zellen durch die magnetische Spalte fallen.</li>
	<li>Spülen Sie die Spalte mit Toten Zelle entfernen Puffer als empfohlene (3 mL). Sammeln Sie die Durchströmung mit lebenden Zellen. Das Sortiment der Zelle Erholung nach tote Zelle entfernen ist in Abbildung 1 bpräsentiert. Hinweis: Diese Zellen können zur Durchflusszytometrie Färbung für phänotypische Untersuchungen (Abschnitt 5) durchführen oder fahren Sie mit DC Isolierung (Abschnitt 4).</li>
</ol>4. DC Reinigung durch Positive Magnetic Bead Auswahl
<ol><li>Nach tote Zelle entfernen (Schritt 3.2) die Zellen spin-down, entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zelle Pellet 80 µL magnetische Auswahlpuffer pro 1 x 107 Zellen (PBS, 0,5 % Hitze-inaktivierten AB Humanserum (HS), 2 mM EDTA).</li>
	<li>Fügen Sie für positive Selektion der DC Bevölkerung CD1a oder CD14 magnetische Beads gemäß den Anweisungen des Herstellers (20 µL magnetische Beads pro 1 x 107 Zellen hinzu). 15 min bei 4° c inkubieren
</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit der magnetischen Auswahlpuffer, spin-down und Puffer vollständig zu entfernen. Die Zellen in einem Minimum von 500 µL des magnetischen Auswahlpuffer aufzuwirbeln.</li>
	<li>Legen Sie die Spalte auf der Magnet und fügen Sie einen 30 µm-Filter auf der Oberseite der Spalte, um alle verbleibenden Zelle Klumpen behalten. Spülen Sie den Filter und die Spalte mit magnetischen Auswahlpuffer wie empfohlen.</li>
	<li>Die Zellsuspension auf die Spalte anwenden. 3 Mal mit magnetischen Auswahlpuffer abspülen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Spalte auf eine 15-mL-Tube, 5 mL des magnetischen Auswahlpuffer hinzufügen und Anwenden des Kolbens um die markierten Zellen in der Spalte freizugeben.</li>
	<li>Um die Reinheit zu erhöhen, wiederholen Sie Schritte 4,4-4,6 mit der wiederhergestellten Zellen unter Verwendung einer neuen Spalte. Das Spektrum der Zelle Erholung nach magnetic Bead Auswahl ist in Abbildung 1dargestellt.</li>
</ol>5. Bewertung der Zelle Reinheit: Flow Cytometry und Mikroskopie
<ol><li>Antikörper für die Durchflusszytometrie Färbung:<ol>
<li>Aufschwemmen bis 1 x 106 Zellen in 100 µL PBS mit 20 % Hitze-inaktivierten HS Fc-Rezeptoren zu blockieren und inkubieren Sie für 10 min auf Eis.</li>
		<li>Fügen Sie die gewünschten Eindringmittel "Antikörper" und das Reagenz für die Identifizierung der toten Zellen (ein Beispiel finden Sie in Abschnitt 6.5). Legen Sie Fluoreszenz minus ein (FMO) Kontrollen, um die Tore zu etablieren, und Entschädigung Perlen verwenden, um einzelne Fleck Steuerelemente auf Schadensersatz vorzubereiten. Beispiele der verwendeten Antikörper sind in Tabelle 1dargestellt. Inkubieren Sie für 20 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit 2 mL der magnetischen Auswahlpuffer. Hinweis: Vorhandensein von EDTA ist wichtig, die Bildung von Zelle für durchflusszytometrischen Analyse Klumpenbildung zu vermeiden. Spin-down und den Überstand verwerfen.</li>
		<li>Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 100 µL 2 % Paraformaldehyd Lösung pro Röhre.</li>
		<li>Analysieren Sie die Proben in ein Fluß Cytometer10,11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drehen Sie die Spalte (z.B. Cytospin) und verwenden Sie Giemsa Färbung Morphologie zu analysieren:<ol>
<li>Die Zellen in 200 µL des magnetischen Auswahlpuffer aufzuwirbeln.</li>
		<li>In einer Spalte Spin und Spin für 5 min laden. Lassen Sie die Folie vollständig trocknen.</li>
		<li>Befestigen der Folie durch Eintauchen in 100 % Methanol für 2 min. Spülen der Folie mit entionisiertem Wasser und lassen Sie es an der Luft trocknen.</li>
		<li>Führen Sie eine standard-Wrights-Giemsa-Färbung. Decken Sie die Zellen mit Eosin und 10 min inkubieren Sie, mit entionisiertem Wasser spülen Sie und trocknen lassen. Decken Sie die Zellen mit Wrights Geimsa Fleck, 1 min inkubieren mit entionisiertem Wasser spülen und an der Luft trocknen.</li>
		<li>Untersuchen Sie die Vorbereitungen mit einem inversen Mikroskop (Abb. 2A, 40 X Objektiv).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. allogene Stimulation Assay DC Zellfunktion bewerten
<ol><li>Tauen Sie die gefrorenen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)<ol>
<li>Wärmen die Zellkulturmedien mit 10 % HS bis 37 ° C.</li>
		<li>Tauen Sie die PBMCs, indem man die Cryotube in einem 37 ° C-Wasserbad, bis eine kleine Menge von gefrorenen Zelle Medien in der Cryotube bleibt. Der Inhalt der Cryotube auf 10 mL vorgewärmten Zellkulturmedien mit 10 % in einer sterilen Umgebung übertragen HS in eine 15-mL-Tube.</li>
		<li>Zentrifugieren bei ~ 500 X g für 7 min. Entfernen Sie das Medium, das Pellet zu zerstreuen, Aufschwemmen der PBMCs in 10 mL von Zellkulturmedien mit 10 % HS und Zentrifuge der Zellen.</li>
		<li>Wiederholen Sie der Waschschritt ein drittes Mal. Zählen der Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Naïve T-Zell-Auswahl:<ol>
<li>Verwenden Sie eine negative Auslese magnetische Antikörper Zelle Auswahl Kit, um naive T-Zellen nach der Hersteller-Protokoll zu isolieren.</li>
		<li>Überprüfen Sie nach Isolierung die Reinheit mit CD45RA und CCR7 Antikörpern. Hinweis: Typische Reinheit ist > 99 % naive T-Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Naïve T-Zell Proliferation Farbstoff Färbung:<ol>
<li>Bereiten Sie 600 µL 2 X Lösung der Zelle Verbreitung Farbstoff, den Farbstoff vor Lichteinwirkung schützen.</li>
		<li>Waschen Sie die naive T-Zellen 2 X mit PBS. Zellen in 500 µL PBS aufzuwirbeln.</li>
		<li>Während sanft aufschütteln hinzufügen Zellen im Kabinett, Biosafety 500 µL Verbreitung Farbstoff die naive T-Zellen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen für 10 min bei 37° c
</li>
		<li>Stoppen der Zelle Kennzeichnung durch Zugabe von 5 mL Zellkulturmedien mit 10 % HS zu den Zellen. Inkubation auf Eis für 5 min, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen an ~ 500 X g für 7 min aspirieren Sie die Medien und Aufschwemmen der Zellen bei 4 ° C von Zellkulturmedien mit 10 % HS. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen noch zweimal. Nehmen Sie ein Aliquot der Zellen vor der letzten Zentrifugation zählen. Hinweis: In der Regel reichen letzte naive T-Zell-Zahlen zwischen 5 % und 15 % der anfänglichen PBMC-Zellzahl.</li>
		<li>Die Zellen mit den Zellkulturmedien mit 10 % Aufschwemmen HS in die gewünschte Zelle Konzentration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC-allogene naive T-Zelle Kokultur:<ol>
<li>Teller isoliert DCs und naive T-Zellen in einer 96-Well, Rundboden Platte bei einem 01:15-Verhältnis von DCs auf T-Zellen. Stellen Sie sicher, dass die optimale Anzahl für DCs liegt zwischen 3.000 und 5.000 Zellen/gut.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei ~ 500 X g für 3 min um die Zellen befinden sich in der Mitte des Brunnens zu gewährleisten. Zell-Zell-Kontakt ist wichtig für die korrekte Signalisierung auftreten.</li>
		<li>6 Tage bei 37 ° C inkubieren. Überwachen Sie die Ansammlung von Zellen, die in den Vertiefungen zu erscheinen, wie Verbreitung mit Mikroskopie (Abbildung 3A) auftritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flow Cytometry Färbung um Verbreitung zu bewerten:<ol>
<li>Nach 6 Tagen können Zellen durch Durchflusszytometrie untersucht werden. Färben der Kokultur für Durchflusszytometrie.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 2 X Lösung des gelben Lebensfähigkeit Farbstoff (maximale Emission 572 nm) mit PBS-Puffer. Hinweis: Die Verwendung von PBS ohne Serum ist wichtig, als Serum Proteine stören den Farbstoff).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Platte mit Zellen bei ~ 500 X g für 5 Minuten.</li>
		<li>100 µL des Überstandes zu entfernen. Hinweis: an dieser Stelle sammeln und Speichern des Überstands für die separate Analyse der lösliche Faktoren.</li>
		<li>Die Zellen zweimal mit PBS waschen: Fügen Sie 150 µL/Well von PBS, Zentrifugieren bei ~ 500 X g für 5 min, 150 µL des Überstands mit einer Pipette entfernen. Sicherstellen Sie, dass es 50 µL überstand noch in jede Vertiefung.</li>
		<li>Jede Vertiefung 50 µL 2 X Lebensfähigkeit Farbstoff hinzufügen. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Während der Inkubation bereiten Sie eine master Mischung der gewünschten Antikörper Marker. Zum Beispiel: CD3 APC/Cy7, PE CD4, CD8 FITC, etc.
</li>
		<li>Fügen Sie die Antikörper-Mischung in jede Vertiefung. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen 2 X mit PBS + 2 % HS: Fügen Sie 150 µL/Well des PBS + 2 % HS. Zentrifugieren bei ~ 500 X g für 5 min. entfernen 150 µL des Überstands mit einer Pipette.</li>
		<li>Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 100 µL/Well von 2 % Para-Formaldehyd. Bei Bedarf: die Zellen und Medien auf Polypropylen Flow Cytometry Rohre übertragen. Röhren können bei 4 ° C aufbewahrt und geschützt vor Licht, bis der durchflusszytometrischen Analyse.</li>
		<li>Lesen Sie Rohre in einem Durchflusszytometer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Schleimhaut DCs sind eine seltene Zellpopulation stark beeinflusst durch die Gewebe-Umgebung, die deren Phänotyp und Funktion ändert, sobald sie das Gewebe3geben Sie. Während Blut abgeleitet DCs sind ein sehr nützliches Modell, sie repräsentieren nicht voll die Vielfalt der DC-Populationen in Geweben gefunden. Deshalb, um die einzigartigen Eigenschaften der Schleimhaut DCs zu verstehen, ist Isolierung von Primärzellen von Gewebe notwendig. Isolierung von DCs von verschiedenen anatomischen Standort...

Die FRT hat die doppelte Funktion der Schutz gegen Krankheitserreger gleichzeitiger Implantation und Schwangerschaft1. Um dies zu erreichen, ist die FRT mit jeder anatomischen Region anzeigen histologischen, immunologische und funktionalen Besonderheiten1zersplittert.
DCs bei Schleimhaut-Oberflächen machen Kontakt mit Mikroben in der Lunge, Darm und Genitalbereich, und bieten Immunüberwachung für potenzielle Krankheitserreger2. DCs haben die einzigartige Fähigkeit, prime naive T-Zellen und adaptive Immunantworten3auslösen. DCs in der FRT sind auch darauf spezialisiert, um fremde Antigene, z. B. auf Sperma und den sich entwickelnden Fötus, ermöglichen erfolgreiche Schwangerschaft4zu dulden. Daher, je nach Standort, DC Phänotyp und Funktion deutlich werden. Es ist bekannt, dass DCs stark von der Gewebe beeinflusst sind, so dass ihre Anzahl, Phänotyp und Funktionen durch das Gewebe Umfeld geändert werden in denen sie3wohnen. Daher müssen um die Rolle zu verstehen, die FRT DCs bei ansteckenden Krankheiten, Schwangerschaft und Krebs in der FRT spielen, ansässige DCs zu untersuchenden abgeleiteten DC-Modelle nicht ausreichen sind, um die regulatorischen Komplexität in FRT Geweben gefunden zu adressieren, da Blut.
Die Charakterisierung des menschlichen Gewebes ansässige DCs ist schwierig, aufgrund der geringen Zahl von Zellen im Schleimhaut-Gewebe und die Schwierigkeit, die Erlangung menschlichen Gewebeproben. DCs sind untersucht worden, in der FRT mittels Immunhistochemie5,6, die informiert über die Zellenposition innerhalb des Gewebes, sondern schließt funktionelle Studien und beschränkt die Zahl der Identifizierung Zelle Marker, die analysiert werden können auf einmal. Darüber hinaus wurden einzelne Zelle isoliert Protokolle für durchflusszytometrischen Analyse entwickelten7,8,9. Einige dieser Protokolle nutzen die wandernden Kapazität des DCs, die Zellen zu isolieren, die migrieren. Diese Methoden in der Regel über Nacht Inkubationen und Auswahl der aktivierten DCs erfordern, aber lassen Sie nicht für das Studium der DCs in der Steady-State.
Hier, mit Hysterektomie, wir ein Protokoll, um DCs von verschiedenen anatomischen Standorten in den FRT der Gebärmutterschleimhaut (EM), isolieren optimiert die Endocervix (CX) und des Ectocervix (ECX), die phänotypische und funktionelle Analysen ermöglicht. Ein nicht-proteolytischen enzymatische Verdauung-Protokoll verwenden, können wir sofort nach Gewebe Verdauung zu Zelle isoliert und Flow durchflusszytometrischen Charakterisierung ohne Zellaktivierung fortfahren. Mit mehrfarbigen Durchflusszytometrie und Anpassung funktionelle Studien für eine geringe Anzahl von Zellen, wir erkennen und charakterisieren seltene Teilmengen von DCs in den verschiedenen Standorten der FRT

<table><tbody><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Hyclone</td><td></td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Hyclone</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma Aldritch</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0,22 μm Stericup 500 mL&nbsp; Filter</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petrischale aus Polystyrol</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm Petrischale aus Polystyrol</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 25 mm Polystyrolschale</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Behandelte Zellkulturschale</td></tr><tr><td>Isotemp Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FICO3500TABB</td><td>5,0% CO2</td></tr><tr><td>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 um Nylonnetz</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 um Nylonnetz</td><td>Sefar</td><td>03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>Beckman GS-6R Zentrifuge</td><td>Beckman</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 mit Gentamicin L-Gln, Phenolrot, 1 l</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldritch</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpufferlösung (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Kit zur Entfernung toter Zellen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Vorabscheidefilter (30 μm)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS-Säule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multiständer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Mikrokügelchen, menschlich</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Mikrokügelchen, Mensch</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 Zellproliferationsfarbstoff</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>96 Vertiefung runde Bodenplatte</td><td>Falke</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>Zombie gelber Lebensfähigkeitsfarbstoff</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC/Cy7, Anti-Mensch</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, Anti-Human-EBiosciences</td><td></td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, Anti-Human-Tonbo</td><td>Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10 Farben, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8 Farben, VBR</td></tr></tbody></table>

isolation von dendritischen zellen aus menschlichen weiblichen fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle studien

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Die Charakterisierung der menschlichen dendritischen Zellen (DCs) Wohnsitz in Schleimhaut-Gewebe ist schwierig wegen der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von Proben und die geringe Zahl von DCs pro Gewebe zu präsentieren. Doch wie der Phänotyp und die Funktion der DCs wird durch das Gewebe Umfeld geändert, ist es notwendig zu analysieren Gewebe Wohnbevölkerung DC, da Blut DCs nicht vollständig abgeleitet spiegeln die Komplexität des DCs in Geweben. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um DCs aus der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane (FRT) mit Hysterektomie zu isolieren, die phänotypische und funktionelle Analysen ermöglicht. Das Protokoll besteht aus Gewebe Verdauung um eine einzelne Zelle gemischt Zellsuspension, gefolgt von positive magnetische Bead Auswahl zu generieren. Unsere Gewebe-Verdauung-Protokoll wird nicht Oberflächenmarker, cleave, wodurch phänotypische und funktionelle Analyse der DCs in der Steady-State, ohne Übernachtung Inkubationszeit oder Zelle Aktivierung. Dieses Protokoll kann für die Isolierung von anderen Immunzellen Typen oder Isolierung von DCs aus anderen Geweben angepasst werden.

Folgende Gewebe Verdauung, die Freilassung von epithelialen Blätter und Drüsen kann beobachtet werden, wie in Figur 1Adargestellt; Dies ist eine positive Kontrolle, die angibt, dass die enzymatische Verdauung erfolgreich war. Die Anzahl der insgesamt vitaler Zellen und DCs pro Gramm Gewebe wiederhergestellt werden auch in Abbildung 1 b und Abbildung 1, bzw. angezeigt. Immunzellen sind zwischen 5-30 %...

Wir beschreiben hier eine Methode um zu isolieren und reinigen von dendritischen Zellen aus verschiedenen anatomischen Fächer in der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für die Bewertung ihrer phänotypischen und funktionellen Eigenschaften. Diese Methode kann zu anderen Immunzellen oder dendritische Zellen aus anderen Schleimhaut-Gewebe isolieren angepasst werden.

Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dendritische Zellen aus verschiedenen anatomischen Kompartimenten des menschlichen weiblichen Fortpflanzungstrakts zu isolieren, um ihre phänotypischen und funktionellen Eigenschaften zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu geweberesidenten dendritischen Zellen im weiblichen Genitaltrakt zu beantworten, wie z.B. die anatomische Kompartimentierung bestimmter Untergruppen und deren funktionelle Eigenschaften. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass unser Gewebeverdauungsprotokoll keine Oberflächenmarker spaltet, was eine sofortige Isolierung dendritischer Zellen ohne Inkubation über Nacht oder Zellaktivierung ermöglicht.Während diese Methode optimiert wurde, um dendritische Zellen aus dem menschlichen weiblichen Fortpflanzungstrakt zu isolieren, kann sie auch angepasst werden, um andere Immunzellen oder dendritische Zellen aus anderen Geweben zu isolieren. Das Verfahren wird von Fiona Barr und Jared Fortier, Technikern in unserem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie das Gewebe mit modifiziertem HBSS spülen.Legen Sie das Gewebe in eine 100 mal 15 Quadratmillimeter große Petrischale und fügen Sie etwa drei Milliliter eines Verdauungsenzymcocktails hinzu, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern. Während Sie das Gewebe mit einer Pinzette stabilisieren, hacken Sie es mit einem Skalpell, um die Oberfläche des Gewebes zu vergrößern, die dem Verdauungsenzymcocktail ausgesetzt ist. Schneide das Taschentuch in kleine Stücke.Fügen Sie ausreichend Verdauungsenzymcocktail hinzu, um alle Gewebestücke zu bedecken, und legen Sie den Deckel auf die Petrischale. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid auf einem Rotator bei ca. 80 U/min für 45 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Rotatordrehzahl den Verdauungsenzymcocktail gründlich mischt, ohne zu verschütten oder Blasen zu bilden.Visualisieren Sie nach 45 Minuten die Gewebepräparation mit einem Inverslichtmikroskop mit den 4X- und 10X-Objektiven. Ein erfolgreicher enzymatischer Verdau sollte Epithelschichten und Drüsen freisetzen, wie in diesem repräsentativen Bild zu sehen ist. Führen Sie die Trennung einzelner Zellen in einer sterilen Umgebung durch.Legen Sie zunächst ein gespanntes 250-Mikrometer-Netz mit Halterung in eine 150 x 15 Quadratmillimeter große Petrischale und stellen Sie sicher, dass sich das Netz etwa 0,5 Zentimeter über der Oberfläche der Petrischale befindet. Befeuchten Sie anschließend das Netz mit zwei Millilitern modifiziertem HBSS und übertragen Sie das verdaute Gewebe auf das Netz. Reiben Sie das verdaute Hackfleisch mit der ebenen Oberfläche eines 10-Milliliter-Spritzenkolbens sanft, aber fest durch das Netz.Sobald die Gewebefragmente gründlich verteilt sind, heben Sie das Netz und den Halter zwei bis drei Zentimeter über die Petrischale und spülen Sie mit drei Millilitern modifiziertem HBSS, um zusätzliche Zellen zu gewinnen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie ein 20-Mikrometer-Netz mit Halter etwa zwei bis drei Zentimeter über eine neue Petrischale und befeuchten Sie es mit zwei Millilitern modifiziertem HBSS.Führen Sie die Zellsuspension durch das Netz und spülen Sie sie mit sechs Millilitern modifiziertem HBSS. Sammeln Sie die gemischte Zellsuspension und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 500 mal g. Saugen Sie die Flüssigkeit an und resuspendieren Sie das Pellet in vier Millilitern modifiziertem HBSS.Schichten Sie die gemischte Zellsuspension über drei Milliliter Polysaccharoselösung für die Dichtegradientenzentrifugation. Bei Raumtemperatur bei 500 mal g für 30 Minuten ohne Bremse zentrifugieren. Sammeln Sie das weiße Band von der Oberseite der Polysaccharoselösung und waschen Sie es mit PBS.Nachdem die angereicherte gemischte Zellsuspension entnommen wurde, zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer an einem Lichtmikroskop mit dem 10X-Objektiv. Schleudern Sie alle Zellen in der Zellsuspension 10 Minuten lang herunter. Saugen Sie den Überstand vollständig ab und entsorgen Sie ihn.Fügen Sie dann Kügelchen zur Entfernung abgestorbener Zellen hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Platzieren Sie nach 15 Minuten einen 30-Mikrometer-Filter auf der Säule, um verbleibende Gewebetrümmer oder Zellaggregate zurückzuhalten. Spülen Sie den Filter und die Säule mit Puffer zur Entfernung toter Zellen.Tragen Sie dann die Zellsuspension auf und lassen Sie die mit Kügelchen markierten Zellen durch die magnetische Säule fließen. Spülen Sie die Säule viermal mit drei Millilitern Puffer zur Entfernung toter Zellen. Sammeln Sie den Durchfluss mit den lebenden Zellen.Nach der Entnahme abgestorbener Zellen schleudern Sie die Zellen nach unten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in magnetischem Selektionspuffer, 80 Mikroliter Puffer pro einmal 10 auf die sieben Zellen. Für eine positive Selektion der dendritischen Zellpopulationen fügen Sie CD1a- oder CD14-Magnetkügelchen hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius.Waschen Sie die Zellen mit dem magnetischen Selektionspuffer, schleudern Sie sie herunter, entfernen Sie den Puffer vollständig und resuspendieren Sie die Zellen in mindestens 500 Mikrolitern magnetischem Selektionspuffer. Befestigen Sie die Säule am Magneten und fügen Sie einen 30-Mikrometer-Filter auf der Säule hinzu, um verbleibende Gewebetrümmer oder Zellaggregate zurückzuhalten. Spülen Sie den Filter und die Säule mit magnetischem Auswahlpuffer.Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf. Dreimal mit drei Millilitern magnetischem Selektionspuffer spülen. Füllen Sie die Säule in ein 15-Milliliter-Röhrchen um.Fügen Sie fünf Milliliter magnetischen Selektionspuffer hinzu und wenden Sie den Kolben an, um die ausgewählten Zellen aus der Spalte zu lösen. Um die Reinheit zu erhöhen, wiederholen Sie die Aufreinigungsschritte mit den zurückgewonnenen Zellen mit einer neuen Säule. Beurteilen Sie anschließend die Zellreinheit durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie, wie im Textprotokoll beschrieben.Vor Beginn dieses Assays werden naive T-Zellen mit einem kommerziell erhältlichen Kit aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes isoliert. Waschen Sie die naiven T-Zellen zweimal mit PBS. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS.Der Rest des Protokolls wird im Dunkeln durchgeführt. Während Sie die Zellen in der Biosicherheitswerkbank vorsichtig vortexen, fügen Sie den Zellen 500 Mikroliter einer 2X-Lösung des Zellproliferationsfarbstoffs hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Stoppen Sie die Zellmarkierung, indem Sie den Zellen fünf Milliliter Zellkulturmedium mit 10 % humanem AB-Serum hinzufügen. Fünf Minuten lang auf Eis vor Licht geschützt inkubieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei etwa 500 mal g für sieben Minuten.Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern Zellkulturmedium mit 10 % humanem AB-Serum. Nehmen Sie vor der letzten Zentrifugation ein Aliquot von Zellen zur Zählung. Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen im Zellkulturmedium mit 10 % humanem AB-Serum in der gewünschten Zellkonzentration.Um die allogene Co-Kultur der dendritischen Zellen zu starten, werden die isolierten dendritischen Zellen und naiven T-Zellen in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden bei einem Verhältnis von 1 zu 15 von dendritischen Zellen zu T-Zellen plattiert. Zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei etwa 500 g g, um sicherzustellen, dass sich die Zellen in der Mitte der Vertiefung befinden. Inkubieren Sie sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius.Überwachen Sie die Zellen mit der Mikroskopie. Nach sechs Tagen ist die Zellproliferation durch Durchflusszytometrie zu beurteilen, wie im Textprotokoll beschrieben. Diese Grafik zeigt den Bereich der Gesamtzahl lebensfähiger Zellen, die nach der Gewebeaufbereitung und der Entfernung toter Zellen in jedem Kompartiment des weiblichen Fortpflanzungstrakts, Endometrium, Endozervix und Ektozervix gewonnen wurden.Als nächstes wird die Anzahl der lebensfähigen dendritischen Zellen gezeigt, die pro Gramm Gewebe nach der Isolierung von magnetischen Kügelchen gewonnen wurden. Die dendritische Morphologie der isolierten Zellen wurde nach Giemsa-Färbung mikroskopisch bestimmt. Die Expression phänotypischer Marker vor und nach der Bead-Isolierung wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt.Nach der Isolierung von CD1a-positiven und CD14-positiven Kügelchen lag die Reinheit zwischen 85 und 92 %Ein allogener Stimulationsassay wurde durchgeführt, um die Funktionalität der dendritischen Zellen zu beurteilen. Die Bildung von T-Zell-Clustern während der Proliferation wurde durch Proliferationsfarbstofffärbung bestätigt. Die Proliferation wurde dann mittels Durchflusszytometrie quantifiziert.Hier ist die Gating-Strategie zur Identifizierung verschiedener dendritischer Zellen in der gemischten Zellsuspension dargestellt. Jede abgegrenzte Population in mehrfarbigen Diagrammen wird im nächsten Fenster angezeigt. Nach der Gating-Strategie werden spezifische dendritische Zelluntergruppen identifiziert.Es wird eine geringe Zellzahl erwartet, da dendritische Gewebezellen seltene Populationen sind. Einmal gemeistert, kann die Isolierung dendritischer Zellen aus dem Gewebe in vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Gewebe enzymatisch verdauen und verarbeiten, um eine einzige gemischte Zellsuspension zu erzeugen und die magnetische Perlenauswahl von dendritischen Zellen für die weitere Charakterisierung durchzuführen.

isolation-dendritic-cells-from-human-female-reproductive-tract-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen aus der Mausdarmwand. Die phänotypische Charakterisierung der intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie, während eine Anreicherung mittels magnetischer Sphären in Kombination mit Zellsortierung hochreine Zellpopulationen für funktionelle Untersuchungen liefert.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Ein effizienter Weg, um Lymphozyten, die aus Maus Genitaltrakt isolieren beschrieben. Diese Methode nutzt Enzym Verdauung und Percoll Gradienten Trennung effiziente Isolierung ermöglichen. Diese Technik ist auch anpassbar für die Verwendung in anderen...

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Diese Studie vergleicht zwei verschiedene Methoden der Isolierung humaner Monozyten zur Gewinnung von in vitro dendritischen Zellen (DCs). Monozyten werden durch Adhärenz selektiert oder durch magnetische Trennung negativ angereichert. Die Monozytenausbeute und -viabilität sowie die Viabilität, Proliferation und Expression von CD11c/CD14-Oberflächenmarkern werden zwischen beiden Methoden verglichen.

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Wir beschreiben hier eine Isolierungsmethode zur Gewinnung humaner endozervikaler intraepithelialer Lymphozyten für die Analyse von intraepithelialen gamma delta T-Zellen. Dieses Protokoll kann für die Aufreinigung von endozervikalen Gamma-Delta-T-Zellen durch magnetische Beads oder durch Zellsortierung erweitert werden.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen deziduale Zellen gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas, die für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. Immunocytochemistry, Durchflusszytometrie, etc.) verwendet werden können mit dem Ziel zur Untersuchung der Rolle von verschiedenen Zell-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Erfahren Sie die Isolierung dendritischer Zellen aus dem weiblichen Fortpflanzungstrakt für immunologische Studien. Diese Methode ermöglicht die Bewahrung von Oberflächenmarkern und funktionelle Analysen in vitro.

Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

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