Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen der Zellbiologie und Biochemie zu beantworten, z. B. wie die dynamische Assemblierung von Proteinen und Proteinkomplexen Signalwege und das Zellverhalten steuert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir zwei interagierende Proteine spezifisch isolieren können, während wir nicht komplexierte Einzelproteine und konkurrierende Bindungspartner ausschließen. Obwohl wir diese Methode verwenden, um Einblicke in die rezeptive Tyrosinkinase-Dimerisierung bei Brustkrebs zu geben, kann sie auch auf jedes andere physiologische Umfeld oder jede andere Krankheit angewendet werden.

Wir hatten die erste Idee für diese Methode, als wir feststellten, dass der GFP-Nanobody das dreidimensionale Epitop von GFP und anderen fluoreszierenden Proteinen erkennt. Geben Sie zunächst 150 Nanogramm Eintrittsvektor, 150 Nanogramm Zielvektor und acht Mikroliter TE-Puffer in ein 0,2-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter Rekombinase und ZiMex hinzu und zentrifugieren Sie die beiden kurz.

Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur, fügen Sie dann einen Mikroliter Proteinase-K-Lösung hinzu und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Reaktion zu stoppen. Als nächstes tauen Sie Hitzeschock-kompetente Zellen auf Eis auf. Und geben Sie 50 Mikroliter der Zellen in ein 14-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen mit rundem Boden.

Geben Sie einen Mikroliter Reaktionsprodukt in die Zellen und mischen Sie es vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang auf Eis. Dann schocken Sie die Zellen 45 Sekunden lang in einem 42 Grad heißen Wasserbad, bevor Sie die Zellen wieder auf das Eis legen.

Geben Sie einen Milliliter LB-Medium in die Zellen. Und inkubieren Sie die Probe unter Schütteln eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Dann wird die Umwandlung mit Ampicillin auf eine 10 Zentimeter große Agarplatte aufgetragen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Um mit der Plasmidreinigung zu beginnen, geben Sie Ampicillin und 100 Milliliter LB-Medium in einen großen konischen Kolben. Verwenden Sie dann eine Impfschlaufe, um eine einzelne Kolonie von der Agarplatte zu entfernen. Tauchen Sie die Impfschlaufe in LB-Medien und mischen Sie sie kurz, decken Sie dann die Oberseite des Kolbens mit Alufolie ab und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.

Von hier aus reinigen Sie die Plasmid-DNA mit einem Standard-Maxiprep-Plasmid-DNA-Aufreinigungskit, bevor Sie mit der Transfektion fortfahren. Zuerst säen Sie HEK 293T-Zellen in 10-Zentimeter-Schalen mit 10 Millilitern DMEM. Verdünnen Sie dann 2,5 Mikrogramm jedes bimolekularen Fluoreszenz-Komplementationsvektors in 500 Mikrolitern Transfektionspuffer.

Fügen Sie 10 Mikroliter des Transfektionsreagenzes hinzu und wirbeln Sie die Mischung 10 Sekunden lang. Zentrifugieren Sie dann die Proben kurz und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann die DNA-Transfektionsmischung tropfenweise in die Schüssel.

Inkubieren Sie die Proben dann acht bis 24 Stunden lang. Bereiten Sie einen Zelllysepuffer und einen ergänzten Zelllysepuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Waschen Sie dann die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS.

Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie einen Millimeter eiskalten, ergänzten Zelllysepuffer hinzu. Dann die Schale auf Eis legen und fünf Minuten inkubieren. Verwenden Sie dann einen Zellschaber, um die Zellen zu entfernen, und geben Sie sie in ein gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 18.000-facher Schwerkraft, um die Zelltrümmer zu entfernen, und übertragen Sie dann den klaren Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie ein angemessenes Volumen Agarosekügelchen in einem Milliliter PBS, zentrifugieren Sie die Kügelchen bei der 300-fachen Schwerkraft und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter Agarosekügelchen zu jeder Probe.

Und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius mit End-to-End-Rotation. Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 300-facher Schwerkraft und waschen Sie sie dreimal in Zelllysepuffer. Suspendieren Sie dann die gewaschenen Kügelchen erneut in 50 Mikrolitern verdünntem Probenpuffer.

Zum Schluss erhitzen Sie die Proben zwei bis drei Minuten lang bei 95 Grad Celsius. In dieser Studie wird die BiCAP-Methode verwendet, um eine positive Interaktion für mehrere Proteintypen etwa 16 Stunden nach der Co-Transfektion HEK293T Zellen zu beobachten. Die konfokale Mikroskopie wird verwendet, um die Dimerisierung der RTKERBB2 an der Plasmamembran und die Bindung von Ubiquitin an die E3-Ligase UBR5 zu beobachten.

Nach der Affinitätsreinigung mit dem GFB-Nanobody können in der Co-Transfektionsprobe nur das Venus-Kontrollprotein in voller Länge und interagierende V1- und V2-markierte Proteine nachgewiesen werden. Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, die Platzierung des bimolekularen Fluoreszenz-Komplementations-Tags und entweder des C-terminalen oder des N-terminalen Endes Ihres Proteins zu optimieren. Dies ist notwendig, um eine positive Protein/Protein-Wechselwirkung zu beobachten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die BiCAP-Technik durchführen und wie Sie sie auf Ihre interessierende Proteininteraktion anwenden können. Nach diesem Verfahren könnten viele der nachgelagerten Charakterisierungstechniken wie ChIPseek eingesetzt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie die Dimerisierung der Transkriptionsfaktoren die DNA-Bindung steuert.